毕业设计-山梨酸对果蝇生长发育的影响

1、山梨酸对果蝇生长发育的影响摘 要：山梨酸已被广泛用于人们的日常生活中，成为主要的防腐剂。为研究山梨酸对果蝇生长发育的影响，本实验以黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）为材料，收集8小时内羽化未交配的果蝇置于添加了不同浓度（0.020%、0.030%、0.045%、0.067%、0.100% ）山梨酸的培养基中，对果蝇后代的发生量、性别比、体重、畸变率进行了研究。结果表明，山梨酸会导致果蝇体重的下降；低浓度的山梨酸能够促进果蝇后代数量增加，高浓度的山梨酸则会导致果蝇后 代数量减少。关键字：山梨酸；黑腹果蝇；生长发育Effects of Sorbic Acid on Grow

2、th and Development ofDrosophilaMelanogasterAuthor: Li Bei Associassor professor: Zuo QingfanLife Science and Tech no logy School, Lingnan Normal Un iversity, Zhan gjia ng, 524048 ChinaAbstractsorbic acid is widely used in daily life nowadays. It has been the main source of an tiseptic age nt. To stu

3、dy the effect of deterge nt on fruit flies growth and developme nt. Newly trapped and not mated Drosophila melanogasters collected within 8 hours were cultured in the media with the different concentrations of sorbic acid（0.020%、0.030%、0.045%、0.067%、0.100%）. According to study the effect of sorbic a

4、cid on its survival rate of adult in sect, Male-female sex ratio of adults in sect, the weight of adult in sect, aberrati on rate of adults in sect. The results shows that sorbic acid resulted in decreased body weight of Drosophila melanogaster. And show that low concentration of sorbic acid in crea

5、ses the amount of Drosophila mela no gaster , while high concen trati on of sorbic acid decreases it.Keyword:S orbic acid; Drosophila melanogaster; Growth and development丄、八1前言1.1山梨酸概述1.1.1性质山梨酸是国际卫生和粮农组织推荐的安全高效的防腐剂，其应用范围广泛，可以应用于食品、农药、饮料、化妆品、石油化工、烟草等行业，作为不饱和脂肪酸，也 可用于橡胶、香料和树脂等工业。中文名：山梨酸、2，4 一己二烯酸、己二烯

6、酸、2一丙烯基丙烯酸、清凉茶酸；英文名：Sorbic Acid；别称：花楸酸、B二烯酸、Sorbistat。 其分子式为C6H8O2,结构式为CH3CH=CHCH=CHC00H，分子量为112.13,异构体 共有4种类型，即超顺式(2Z，4E-2)、超反式(2E, 4E-2)、反式(2Z, 4Z-2 )、顺式(2E, 4Z -2), 山梨酸应用于工业生产上的大多数为超反式结构。山梨酸的颜色为无色或白色，呈现为粉末状或鳞片状结晶，气味为无臭或稍有刺激性气味；在空气中容易着色氧化，并且对某些二价金属(如铁、铜、镍等)有腐蚀性；其光热性能好，耐热耐 光，但是较容易升华，当温度达到 60C时开始升华；

7、山梨酸的相对密度在 19C时为 1.204,沸点为228T(并且在该温度下开始分解)，熔点为132C 135C，闪点为1267C，难溶于水，能溶于乙醚、乙醇等有机溶剂。其饱和水溶液pH值为3.6，明显呈酸性，离解常数为K=1.73X10-5，当加热其水溶液时，其中的山梨酸容易随着水 蒸汽一同挥发13。山梨酸是一种双重不饱和脂肪族直链单羧酸，除了含有羧基外，分子中还含有两个双键，因此其具有共轭性。山梨酸的化学反应活性高，容易发生加成、 加氢、脱羧、酯化、氧化、卤代和共聚等反应1,14。如和醇反应可得到酯，能与乙烯、 丙烯、丁烯及其衍生物发生共聚反应2。以上所述性质使得山梨酸拥有很好的应用价 值。

8、1.1.2防腐机理几乎绝大部分的食品都是由植物或者动物的组织制成的，它们都含有一定的水 分、营养物质和能分解食物成分的酸类等其他物质。食品在存放久了经常会腐烂变质， 这是因为当卫生条件，环境温湿度等因素控制不当时，食品中的各种微生物中的酶就 会不断发生新陈代谢，其中的饱和脂肪酸被氧化脱氢，形成不饱和脂肪酸而导致的。 当加入适量的山梨酸后，微生物酶中的巯基就会与其结合，起到破坏微生物许多重要 酶系的作用，从而使得脱氢酶的活动得到控制， 使其不能再氧化食品中的脂肪酸， 最 终抑制各种微生物的繁殖。霉菌、酵母菌、细菌、丝状菌和好氧性菌的活性均能被山 梨酸有效地抑制，并且当它与乙酸混合使用时，还能地抑

9、制乳酸菌的繁殖。除此之外 山梨酸还能很好地抑制金黄色葡萄球菌、肉毒杆菌、沙门氏菌等有害微生物的生长， 但是在抑制嗜酸乳杆菌和嫌气性芽胞形成菌生长繁殖上几乎无效。山梨酸的抑菌谱实验结果表明，随着pH值的升高山梨酸的防腐效果随之降低，其最好的防腐效果是在 pH=3.0时，当pH值升到5.0、6.0时仍有防腐作用，但这时要加大所需要的浓度15 还有研究表明，在pH=5.0时，同样属于酸性防腐剂的苯甲酸，其抑菌效果仅为山梨 酸的1 /3。1.1.3用途本身作为一种不饱和脂肪酸，山梨酸会像食品中其它的不饱和脂肪酸一样，能通过人体的正常代谢作用，最终被分解为 H2O和C02,故山梨酸的毒性被公认是最低 的

10、，并且是至今世界上有效的、最安全的一种防腐剂。山梨酸的防腐效果较苯甲酸显 著，并能较好地保留食物中原有的味道， 还有苯甲酸有致癌的潜在危险。以上种种原 因使得山梨酸越来越受人们的欢迎，山梨酸的使用领域随之越来越广。山梨酸主要应 用于食品加工行业，并且因为其又有成本低、用量少的优点，使得世界各国争先使用。 其可以应用于熟肉制品、预制水产品、冰棍类、葡萄酒、果冻、蜜饯凉果、饮料类、 酱制品、干酪、氢化植物油、果酱、调味糖浆、醋、酱油、肉灌肠类、火腿香肠、蛋 制品、浓缩果蔬汁、豆干制品、糖果、面包、糕点、培烤食品、食用菌、藻类、干果 类、人造黄油、乳制品、蔬菜水果、鱼制品等方面。除此之外，山梨酸也可

11、以应用于 化妆品、滋补品、医药品和烟草等行业。山梨酸不仅在食品工业方面有广泛的应用价值，在饲料加工业也有所用途。它可 以作为添加剂添加到饲料中，能较好地防止饲料中霉菌的生长，尤其对黄曲霉素的抑 制作用特别明显，且不破坏饲料原有的口感，动物食用后也无表现出任何不良反应 。 在农业方面，山梨酸可以用来合成杀虫剂和昆虫引诱剂，并且在农药复配的应用上取得了减毒增效的显著作用。用酒精和山梨酸按比例混合制成的复配农药已经在美国推 广使用，该复配农药具有明显的减毒增效效果， 经复配的农药，其中的毒性较之前下 降了 50%以上，而药性则较之前的增加了 10%以上。随着新的应用领域不断开发， 山梨酸愈发显示出它

12、的良好应用前景。1.2目的与意义近几十年来，山梨酸的生产与应用迅速发展。上世纪 80年代，世界山梨酸的总 产量已超过2万吨。到90年代，世界总生产量已达到 4万吨。到2000年，世界山 梨酸总生产量超过13万吨，我国山梨酸用量约8000吨。2005年我国山梨酸的市场 需求量约为1.52万吨。随着山梨酸的应用越来越广，其用途涉及国民经济的众多领 域，人们对其关注程度亦在迅速发展。黑腹果蝇(Drosophila melanogaste)属于双翅目昆虫，是一种真核多细胞生物，具有 生存周期短，繁殖量大，饲养简便，反应灵敏等优点，其代谢系统，生理功能，生长 发育等同哺乳动物基本相似12，是遗传学、发育

13、生物学、生物学和发育生物学实验中 最常用的动物，并已经成为了生物学特别是医学研究领域中的模式生物。此外，果蝇还可用于环境物质遗传生物学效应的快速检测和某些保健食品及添加剂的功效评价 方8,11。本实验以果蝇为实验材料，研究添加了山梨酸的培养基对果蝇生长发育、繁 殖能力、致畸变等方面的影响。本实验不仅可为建立以果蝇作为检测山梨酸毒理研究 的模式生物提供基础资料，而且可为进一步研究山梨酸对有机体影响的分子机理提供 线索。2材料与方法2.1仪器、材料与试剂实验仪器：电磁炉、微波炉、锥形瓶、棉花塞、载玻片、扣针、恒温培养箱、显 微镜、电子天平、烧杯、玻璃棒、勺子、不锈钢锅、石棉网、橡皮圈、胶头滴管、放

14、 大镜。材料：18#品系黑腹果蝇(由本学院遗传学实验室提供)、红糖、琼脂、玉米粉、 麦麸、酵母粉。试剂：乙醚、丙酸、山梨酸(天津市光复精细化工研究所，纯度为8% )。2.2方法2.2.1种蝇培养18#品系黑腹果蝇培养于干燥、25C的恒温培养箱中，经扩大培养后供实验用。 2.2.2果蝇培 养基 的制作 将80g红糖和7. 5g琼脂加入1000mL水中煮沸并不断搅拌至完全溶解。 用200mL水把80g麦鼓和20g玉米粉调至糊状，倾入中并不断搅拌，连续 煮沸20min。 加入8mL丙酸，再煮几分钟停火。 趁热加入7g酵母粉并搅拌均匀至糊状，制成普通培养基。 在煮沸消毒过的烧杯中，预先按下表加入不同剂

15、量的山梨酸， 待培养基制成后 立即分装到各烧杯中，每个烧杯约100mL (122g)，充分搅拌配制成不同浓度的山梨酸 培养基，再用微波炉加热灭菌，然后分装到培养瓶中，每瓶培养基厚度约为铺满瓶底 即可，约为0.5cm。表1山梨酸添加量组别CK12345山梨酸浓度（%）0.0000.0200.0300.0450.0670.100山梨酸质量（g）0.0000.0240.0370.0550.0820.122上述山梨酸添加量是根据卫生部颁布的 食品添加剂使用标准（GB2760 - 2011）， 其中规定了山梨酸用于不同食品的使用量各不相同，其中最低的是熟肉制品和预制水 产品（0. 075g/kg），这也

16、是因为熟肉制品的每日食用量较大，甚至可以作为一整天 的全部干粮（为确保安全，应以食用熟肉制品较多的人为标准）0.075g/kg乘以安全系数 100,则为7.5g/kg；又因所用的山梨酸纯度为98%,故根据食品添加剂使用标准， 当果蝇培养基中含有0.77%质量分数的山梨酸（食品添加剂）时，在实验中应观察不到 有害作用。以此为基准，等比设置5个实验浓度梯度，公比为1.50。但是在进行了预 实验时，该浓度设置对于果蝇还是偏高，导致培养不出果蝇并且亲本蝇在各浓度梯度 中几乎全部死亡，完全无法进行实验。此后查找了更多相关理论和做了多次预实验进 行浓度调整，最终确定实验中山梨酸的浓度梯度，实验顺利进行。2

17、.2.3果蝇子代发生量、性别比和畸变率的统计收集18#品系处女蝇及雄蝇，分别放入含有不同量山梨酸的培养瓶中，每个浓度 梯度做3瓶，每瓶4对。饲养过程中，观察并记录果蝇的发育状况；7d后将成虫全部倒出处死。再过14d,将各管内的F1，果蝇分批麻醉，雌、雄果蝇分别计数，统计 果蝇发生量、体重和畸变率。畸变主要考察翅形、体色、眼色和刚毛类型。2.2.4统计分析用SPSS和Excel软件对所得数据进行统计分析。3结果与分析3.1果蝇数量、体重、畸变率和性别比的平均值及显著性检验实验后分别统计每个浓度梯度中每个培养瓶中雌雄果蝇的数量和畸变数，然后整理数据，得到以下表2中的每个浓度平均一瓶培养瓶中果蝇总数

18、、总畸变率和雌雄性别比。再通过SPSS进行显著性检验，得到各个浓度不同数据之间与空白对照组比较 后的不同结果。表2果蝇数量、畸变率和性别比的平均值及显著性检验组别山梨酸浓度（%）雌雄果蝇总数（只）雌雄果蝇总畸变率（%）雌雄性别比CK0.0002301.741.0710.020319*1.90*0.9420.030277*2.16*0.9830.0452214.54*0.9840.067145*4.05*1.2150.10027*0.00*0.94注：表中数据为平均值，与空白对照组比较，*p0.05，*p0.05）。实验后分别统计每个浓度梯度中每个培养瓶中雌雄果蝇的数量、体重、畸变数， 然后整理

19、所得数据，得到下表3中的每个浓度中平均一瓶培养瓶雌、 雄果蝇各自的数 量、畸变率和平均一个果蝇的体重。再通过 SPSS进行显著性检验，得到各个浓度不 同数据之间与空白对照组比较后的不同差异。表3果蝇数量、体重、畸变率的平均值及显著性检验性别组别山梨酸浓度（%）果蝇数量（只）果蝇体重（mg）畸变率（%）CK0.0001191.2800.8410.020155*1.2661.29*20.0301371.241*0.73雌性30.0451091.222*2.75*40.06779*1.191*2.53*50.10013*1.132*0.00*CK0.0001110.8770.9010.020164*

20、0.852*0.61*20.030140*0.831*1.43*雄性30.0451120.800*1.79*40.06766*0.782*1.52*50.10014*0.755*0.00*注:表中数据为平均值，与空白对照组比较,*p0.05,* p0.01 。由上表可以明显看出，在数量统计上，雌果蝇最多是155只、最少是13只，雄 果蝇最多是164、最少是14,雌雄果蝇最大值和最小值与空白对照组比较差异是显著的（pv0.05或pvO.01）。在体重方面，雌果蝇最重为 1.266mg、最轻为1.132mg，雄果 蝇最重为0.852mg、最轻为0.755mg，与空白组比较，雄果蝇的两值差异均极显著

21、（pvO.01），雌果蝇只有最轻值差异才极显著（p0.01），最重值则不显著。在畸变率 上，雌果蝇最大值是2.75%、最小值是0.00%，雄果蝇最大值是1.79%、最小值是0.00%， 雌雄果蝇最大值和最小值与空白对照组比较差异均极显著 （p0.01）。3.2山梨酸对果蝇子代发生量的影响在培养基中加入不同浓度山梨酸以后，对果蝇子代发生量的平均值进行差异显著 性检验，结果显示（见表2），山梨酸添加含量为0.020%、0.030%、0.067%、0.100% 的培养瓶中果蝇子代发生量与空白对照组相比较，差异均有统计学意义（p0.05或p0.01）。再通过Excel处理得出以下果蝇子代发生量均值的折

22、线图。350300 -200 -150 -loo -I I I I I ICK 12345山梨酸浓度组别图1果蝇子代发生量结合表2和图1可以看出，果蝇子代发生量与山梨酸含量有明显的相关性。在分别加入含量为0. 020%和 0. 030%山梨酸的第1组和第2组培养瓶中，果蝇数量较对 照组均显著上升（p0.01或p0.05）;在山梨酸含量为0.045%的第3组培养瓶中，果 蝇数量几乎和对照组的果蝇数相同，差异不显著；而在山梨酸含量达到0.067%以上的第4组和第5组培养瓶中，果蝇数量较对照组有不同程度的减少，差异均达到极显著（p0.05）。再通过Excel处理得出以下果蝇雌雄性别比均值的柱状图。2

23、00150100500CK4图2果蝇雌雄性别比23山梨酸浓度组别曰雄蝇13由表2、3和图2可见，第15组培养瓶中果蝇的雌雄数量基本一致，性别比接 近理论值（1:1），且均无显著性差异。以上实验结果表明，果蝇子代性别比与山梨 酸含量没有的相关性。3.4山梨酸对果蝇子代体重的影响对每个雌、雄果蝇体重平均值进行差异显著性检验，由表3结果显示出，除雌性果蝇的0.020%浓度组平均体重与对照差异不显著外，其他浓度组雌、雄果蝇平均体 重均显著或极显著低于对照组（p0.05或p0.01）。然后在通过Excel处理，得到以下每个雌、雄果蝇体重平均值的折线图山梨酸浓度组别-*雄蝇图3子代每只雌、雄果蝇体重结合表

24、3和图3可以看出，随着山梨酸浓度的增加，果蝇Fi雌、雄蝇体重均呈现逐渐下降的趋势。与对照组比较，山梨酸含量为0.067%和0.100%的第4组和第5组培养瓶中雌、雄活果蝇体重均极显著降低（p0.01）,第5组培养瓶中果蝇体重尤 为明显。以上实验结果表明，山梨酸对果蝇Fi代的生长造成影响。对果蝇雌雄个体分别统计分析发现，当山梨酸含量为0.020%时，Fi雌果蝇的体重较对照组下降了 1.11%，但是差异并不显著，雄果蝇的体重较对照组极显著下降了 2.93%;当山梨酸含量为0.030%时，F1雌果蝇的体重较对照组显著下降了 3.14%，雄 果蝇的体重较对照组极显著下降了5.54%;当山梨酸含量为0.

25、044%时，F1雌果蝇的体重较对照组显著下降了 4.75%,雄果蝇的体重较对照组极显著下降了 9.63%;当山 梨酸含量为0.067%时，F1雌果蝇的体重较对照组显著下降了7.46%，雄果蝇的体重较对照组极显著下降了 12.15%;当山梨酸含量为0.100%时，R雌果蝇的体重较对照 组下降了 13.07%，雄果蝇的体重较对照组下降了 13.91%，雌雄都表现为极显著差异。 果蝇F1雌、雄蝇体重均随着山梨酸浓度的增加而降低，但雄性体重降低较严重，说 明山梨酸对雄性果蝇体重产生的影响更大，这可能与雌性个体抗逆性更强有关。3.5山梨酸对果蝇子代畸变率的影响将果蝇放在含有不同浓度山梨酸的培养基中饲养1

26、4d 后,再检测其畸变情况。结果显示（见表2、3）,与对照组相比含山梨酸的实验组除浓度为0.030%组外，其他组的雌性果蝇畸变率差异达到极显著水平（p0.01）;而所有实验组雄性果蝇的畸变 率和雌雄总畸变率和对照组比较，均有极显著性差异（p0.01）。然后在通过Excel处理，得到以下果蝇畸变率平均值的折线图。CK 123Q5山梨酸浓度组别图4果蝇子代畸变率由表2、3和图4可以看出，在分别加入含量为 0.045%和0.067%山梨酸的第3 组和第4组培养瓶中，果蝇畸变率较对照组明显上升，均达到极显著性差异。当山梨 酸含量为0.045%时，雌性果蝇的畸变率较对照组增加了 227.38%, Fi雄

27、性果蝇的畸 变率较对照组增加了 99.00%;当山梨酸含量为0.067%时，雌性果蝇的畸变率较对照 组增加了 201.19%，Fi雄性果蝇的畸变率较对照组增加了 68.89%；在高浓度山梨酸 的条件下，果蝇子代畸变率增加，并且雌性果蝇的畸变率明显比雄性果蝇畸变率高。4讨论关于果蝇子代发生量，本实验结果表明，添加了山梨酸的培养基对果蝇子代发生 量有影响。呈现为低浓度山梨酸使果蝇子代发生量增加，高浓度山梨酸则会使果蝇子 代发生量减少，并且浓度越高果蝇子代发生量下降越显著。 造成这种现象可能的原因 有以下：其一，前面介绍过山梨酸具有防腐的功效，其对酵母菌、霉菌、细菌、好气 性菌、丝状菌均有抑制作用，

28、还能防止肉毒杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门杆菌的生长 繁殖，因此了添加低浓度山梨后，山梨酸抑制了培养基中杂菌的生长， 果蝇的生长环 境在一定程度上得到了较大的改善，并且该浓度山梨酸对果蝇尚未表现出致死的毒性 效应，所以在低浓度山梨酸的条件下，有利于果蝇子代的繁殖。其二，可能由于高浓 度山梨酸存在时，会使果蝇产卵较晚甚至减少产卵量。 因为只有当环境条件适宜，果 蝇才会选择产卵，而高浓度山梨酸存在可能会使果蝇认为在该条件下不适宜产卵和幼 虫的生长发育，最终导致产卵时间推迟和产卵量下降。 其三，高浓度山梨酸表现出明 显的毒性效应，受精卵的生长发育受到抑制，严重时甚至会使受精卵和幼虫停止发育 或者死亡；还

29、可能是果蝇的生殖系统随着体内的山梨酸逐渐累积而受到影响，最后影响到精卵细胞的发育。其四，所购买的山梨酸并不是纯品，其中还含有其他杂质，这 些物质混合在一起发生各种反应作用， 使得对果蝇造成的影响更加复杂。因此想要很 好地解释实验结果的成因，还必须在此实验基础上结合纯品进一步研究。上述实验结果与王延之等的研究结果一致，他们用不同浓度的柠檬黄（食品添 加剂）培养果蝇，结果显示低浓度的柠檬黄使果蝇数量增加，而高浓度的柠檬黄则使果蝇数量减少。还有研究表明，山梨酸毒性在哺乳动物中试验结果为9，用添加了含量为0.5%、1%、2%、4%、8%的山梨酸喂养90组大白鼠，除了大白鼠的肝脏稍有 肿大外，其它方面均

30、正常；用添加了 4%含量山梨酸的饲料喂养小狗90 天,实验期间 对小狗进行一系列考察并且在90天后做了解剖，没有发现效果有任何病理学变化。 该研究和本试验结果有所不同，其原因可能是相对于哺乳类动物，果蝇对山梨酸可能 更为敏感，可能由于果蝇的排泄系统和代谢与哺乳动物有差别所致。关于果蝇体重，本实验结果显示，用添加了山梨酸的培养基培养果蝇会导致果蝇 体重下降，而且山梨酸添加量越高，果蝇体重较对照组下降就越明显。 导致这种现象 的原因可能有以下几点，第一，果蝇对添加了山梨酸的培养基食用欲望不强，以致果蝇体重下降。第二，果蝇的主食是酵母菌，而山梨酸能抑制酵母菌的生长，随着山梨 酸的浓度升高，山梨酸对酵

31、母菌的抑制作用就越强，培养基中的酵母菌数量就越少， 而果蝇的食物来源也随之减少，因此果蝇的体重随着山梨酸浓度增加而减少。第三， 山梨酸随着食物一起进入果蝇体内后， 可能对果蝇的消化系统有影响，从而影响果蝇 的取食量和对营养物质的消化吸收，最终导致体重减少。实验结果还显示出，雌、雄 果蝇体重下降的程度各不相同，雄性果蝇体重下降程度比雌性果蝇的要大。 雄性体重 降低较严重，这说明山梨酸对雄性果蝇体重产生的影响较雌性的要大，这可能是雄性果蝇对山梨酸的敏感度更强而导致的。关于果蝇子代畸变情况，本实验结果显示，当山梨酸添加量达到0.045%和0.067% 时，果蝇畸变率明显上升，并且雌性果蝇的畸变率较雄性果蝇畸变率高。但由于本次试验总量相对较少。同时考虑到基因突变的比例，因此没法判断出山梨酸是否会影响 果蝇的畸变率。有研究表明10，Hasegawa与Munzer等分别在1984与1990年以中国 Hamster卵细胞和V79Hamster成纤维细胞进行了硫代尿苷阻力点突变试验，结果证明 山梨酸在此基因突变试验中为阴性。而 Mukherjee等1988年报道，用山梨酸一次性 小鼠腹腔注射（最大剂量为150mg/kg体重）发现了骨髓细胞微核形式与姊妹染色体交 换10。由于上述两个相关研究的结果不相同，并且实验对