中图版选修一酶的制备及活力测定课件15张2

1、酶的制备及活力测定,3.1,辣根过氧化物酶的制备及活力测定,实验目的和要求,1,掌握盐析法制备活性蛋白质的原理及方法,2,掌握过氧化物酶的活力测定方法,实验原理,2H,2,O,2,O,2,2H,2,O,这一类酶以铁卟啉为辅基，所以属血红素蛋白质,类,hemeproteins,过氧化物酶在生物界分布极广,在细胞代谢的氧化还原过程中起重要的作用,实验原理,辣根过氧化物酶,horse radish peroxidase,简称,HRP,EC.1.11.1.7,是植物中研究得最深入的一种过氧,化物酶，早在,20,世纪,30,年代就有人着手从辣根中分离,此酶，以后又制备出结晶。本实验是以辣根为原料,经过水

2、的抽提，硫酸铵和丙酮分级分离，再经锌离子,纯化，透析除盐，冰冻干燥，便可得到高纯度的辣根,过氧化物酶,实验原理,辣根过氧化物酶是一种含亚铁血红素的蛋白质,Mr,在,40,000,左右，等电点,7.2,溶于水，溶解度为,5%(W/V,溶液呈棕,红色，透明,HRP,可溶于,0.58,饱和度以下的硫酸铵溶液，而,0.62,饱和度以上则不溶。该酶最适,pH7.0,对愈创木酚为氢给体,而言,在室温下,HRP,几周内稳定，加热到,63,在,15min,内,稳定。氧化还原电势很低,pH6.08,时,E 0 =-0.2070V,pH,为,7.71,E 0,0.2787V,辣根过氧化物酶的活力测定方法,1.RZ

3、,值：提纯工作的后几步，以及纯酶溶液可用,RZ,值表,明酶的纯度,RZ= A403nm/A275nm,403nm,处的吸收代表,血红素辅基的吸收,275nm,的吸收是蛋白质的吸收，结晶的,HRP,的,RZ,值为,3.04,测定时的酶浓度为,1mg,蛋白,mL,2,愈创木酚法：测,k4,以愈创木酚,邻甲氧基酚,guaiacol,为氢给体，其反应产物四邻甲氧基连酚,有色产物四邻甲氧基连,酚生成的速度,dx/dt,与底物过氧化氢及氢给体愈创木酚的浓度,有关,本实验是采用测定,k4,的方法来判断酶的纯度,实验步骤,一,HRP,1,水提取：称取,5kg,用水冲刷干净的鲜辣根,辣根,皮中亦含有丰富的,HR

4、P,用菜刀切成小碎块，在绞,肉机中绞碎,1,2,次。碎渣浆用,1,倍体积的水低温下搅,拌提取过夜,亦可采用高速抽提法,次日用甩干机,或,离心机,甩干，收集滤液，碎渣再用,1/4,倍体积水浸泡,提取,1,次，合并,2,次滤液，测得总体积,实验步骤,2,硫酸铵分级分离：在不断搅拌下，每,1 000mL,滤液中慢慢加入,226g,硫酸铵,粉末,相当于,0. 40,饱和度,0,大约在,1,2h,内加完，置冷室中放置过夜,次日将上清液小心地用虹吸管移出，下面混浊液以,3 000r/min,离心,15min,弃沉淀，合并上清液。再按每,1 000mL,上清液加,258g,硫酸铵粉末,0.8,饱和度,随加随

5、搅拌，当硫酸铵全部溶解后，置冷室过夜。次日，虹吸出上清液，沉,淀部分在冰冻离心机中以,13 000r/min,离心,20min,弃去上清液，收集沉淀,将沉淀悬浮于,100,150mL,蒸馏水中,加水量要使沉淀全部溶解为止,分装,于透析袋内，放在流动自来水中进行透析,1,2,天，直到硫酸铵透析完毕为止,可用,5,乙酸钡溶液或奈氏试剂进行检查,然后改换成用蒸馏水透析，中间,更换,2,3,次，用,0.1mol/L,硝酸银溶液检查透析外液无氯离子为止。将透析液,合并，在冰冻离心机中以,4 000r/min,离心,15min,弃去沉淀，量上清液的体,实验步骤,3,丙酮分级分离：将上清液倒入烧杯并置冰盐,

6、浴中，在不断搅拌下，用细滴管沿杯壁加入,1,倍体积预冷至,15,的丙酮，放置片刻，在,冰冻离心机中以,4 000r/min,离心,15min,弃去,沉淀。上清液再加入,0.8,体积,按原上清液体积,15,丙酮,操作同上,静置后，在冰冻离,心机中离心收集沉淀。将沉淀溶于少量蒸馏,RZ,值近于,1,的,酶溶液,实验步骤,4,精制：将上步酶液适当稀释，滴加,1mol/L,硫酸锌溶液，使酶液中锌离子浓度为,10,3 mol/L,5 000r/min,离心,10min,得上,清液。再将沉淀用少量蒸馏水洗涤，离,心，洗液与清液合并，分装于透析袋内,用水透析除盐，用微孔滤膜过滤，进行,真空冰冻干燥,约得,2

7、0mg,产品呈米黄,色纤维状松软物,HRP,RZ,值,可达,3.0,左右，置真空干燥器中低温保存,实验步骤,二,HRP,1,活力测定：测定,k4,值的方法操作如下：取,2,个比色池,带盖,光程,1cm,按表加入反应物,对照样品,磷酸盐缓冲液,愈创木酚溶液,反应物,2.90mL,0.05mL,0.01mL,2.91mL,0.05mL,0.0mL,酶液,酶液：将,1mg,蛋白,mL,的酶液用磷酸盐缓冲液稀释,10,倍后使用,实验步骤,加好反应物，摇匀，在,470nm,读出,A470nm,值，为,t=0,时的读数。立即,加,0.01mL40mmol/L,过氧化氢溶液于,2,个比色池中，即刻摇匀并记时，每隔,30s,读数,1,次，约,5min,将所测样品的,A470nm,值减去相应时间对照的,A470nm,值，然后以,A470nm,值为纵坐标，时间为横坐标作图，得一直线，计算出平均每分钟,光吸收的增加，即求出,x,t,按公式,8,求出,k4,值。或不求,k4,值，而把,在上述条件下，每分钟,A470nm,增加,0.001,所需酶量定为,1,个,HRP,活力单位,2,蛋白质含量的测定：将酶液适当稀释后，用,Bradford,法比色测定蛋白质,含量,实验结果,1,计算产品的,RZ,值及,k4,2,计算