分子生物学实验复习题附答案(最新整理)_1

1、分子生物学复习题实验一dna 的制备（1） 为什么分子生物学实施时要担心 eb？溴化乙锭（ethidium bromide）是 dna 诱变剂，溴化乙锭可以嵌入碱基分子中，导致错配。具有高致癌性(接触致癌)（2） dna 加样缓冲液的用途是什么？由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对 dna 的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。1核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系（2）琼脂脂糖的浓度 不同大小的 dna 需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。琼脂糖浓度与 dna 分离范围琼脂糖浓度 /% 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2

2、 1.5 2.0（3） dna 电泳时所用的琼脂糖凝胶其浓度是如何决定的？线状 dna 大小/kb60-520-110-0.87-0.56-0.44-0.23-0.1dna 分子在 ph 值高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向阳极移动。dna 分子在电场中通过琼脂糖凝胶而泳动，除了电荷效应以外，还有分子筛效应。由于 dna 分子可片段的相对分子质量不同， 移动速度也不同，所以可将相对分子质量不同或构象不同的 dna 分离。dna 片段迁移距离（迁移率） 与碱基对的对数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较， 便可测出未知片段的大小。但是当 dna 分子大小超

3、过 20kb 时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，就用琼脂糖凝胶电泳分离 dna 时，分子大小不宜超过此值。（4） 琼脂糖凝胶电泳分离 dna 的原理是什么（5） 琼脂糖凝胶电泳时胶中 dna 是靠什么发出荧光的？为什么？溴化乙锭是一种高度灵敏的荧光染色剂,可插入 dna 双螺旋结构的两个碱基之间，形成一种荧光络合物。在 254nm 波长紫外光照射下，呈现橙黄色的荧光。用溴化乙啶检测 dna，可检出 10-9g 以上的 dna 含量。（6） 制备基因组 dna 时用到的以下试剂分别起什么作用？ctab 等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋

4、白解聚，从而使 dna 得以游离出来氯仿有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(dna、rna)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。无水乙醇上清液中加入无水乙醇使 dna 沉淀，沉淀 dna 溶于 te 溶液中，即得植物总 dna 溶液。75%乙醇,乙醇轻轻洗涤管壁实验二rna 的制备1. 制备 rna 时通常要注意些什么？为什么？应该要注意(1)不要徒手操作,必须带手套;(2)加样时不能够大声说话,防止唾液等进入;由于 rna 分子的结构特点，容易受 rna 酶的攻击反应而降解，加上 rna 酶极为稳定且广泛存在，因而在提取过程中要严格防止 rna 酶的污

5、染，并设法抑制其活性，这是本实验成败的关键。2. 制备的 rna 通常有哪些用途？制备的 dna 通常又有哪些用途？ 研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化 rna。质粒 dna 构建克隆载体,分离目的基因3. rna 制备好后是通过什么方法检测其有没有降解的？从胶上检测什么指标来判断rna 质量好坏？为什么？1.2%琼脂糖凝胶电泳。在紫外检测仪下观察，完整的总rna 样品应呈现三条带：28s、18s、和5s rrna。其中 28s rrna 条带的亮度应该为 18srrna 条带的 1.52 倍。反之，说明部分 28s rrna 已经降解成 18s rrna。若无清晰条带，则说

6、明样品 rna 已严重降解。若加样孔内或孔附近有荧光区带，则说明有 dna 污染。4. rna 制备好后通过什么方法测定其含量？rna 通常用分光光度计测量，通常在 a260 的读书在 0.15-1.0 之间才是可靠的，a260 为 1 相当于 rna的浓度为 40 微克/ml实验三质粒 dna 的制备1. 什么是质粒？质粒有什么主要用途？染色体外小型（1-200kb）的共价、闭合、环状的双链 dna 分子（cccdna），能自主复制并能稳定遗传的遗传因子。常常编码一些对宿主有利的酶的基因，这些基因的表型包括抗生素抗性、产生抗生素、限制酶、修饰酶等用途:把一个有用的目的 dna 片段通过重组

7、dna 技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(vector)。细菌质粒是重组 dna 技术中常用的载体。2. 分子生物学实验中用的质粒是由野生型改建而来的，它必须具备哪三个基本要素？1 环状 dna 分子能够自我复制，或整合到染色体上，随染色体复制。2 有多个限制酶切点(便于切割)3 有标记基因(便于进行检验)3. 制备的质粒 dna 在琼脂糖凝胶上通常以三种形式条带存在，它们分别是什么？哪种条带形式的质粒dna 其转化或转染效率最高？三种结构：线形、开环、闭环超螺旋。实验四感受态细菌的制备及质粒 dna 的转化（1） 什么是感受态细菌？感受态细菌的主要用途是什么？感受态细胞：处理

8、后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源 dna 分子通过时细胞的状态。感受态细菌吸收异源 dna 分子，使受体细胞获得新的遗传性状.（2） 什么是转化？转化与转染的主要区别是什么？转化（transformation)感受态细菌捕获质粒 dna 的过程转染（transfection)细菌捕获噬菌体 dna 的过程（3） 有哪些主要因素决定质粒 dna 的转化效率？1. 细菌的生长状态和密度：od006=0.30.5细菌出于对数期或者对数前期2. 质粒 dna：数量：质粒 dna 不超过感受态细胞体积的 5%大小：分子量越大转化效率越低，超过 30kb 的质粒 dna 很难转化成功构型：超螺旋

9、的 dna 具有较高的转化效率，重组 dna 效率低一些，环状 dna 相比线性 dna 转化效率高一些3. 所用试剂纯度、质量、器皿的洁净程度4. 防止杂菌和其他外源 dna 的污染（4） 质粒 dna 的转化过程可分为哪几个阶段？每个阶段中主要发生了什么事件？1 吸附阶段：完整的双链 dna 分子吸附于感受态细胞表面。2 转入阶段：双链 dna 分子解链，以单链形式进入细胞，而另一链则被降解。3 自身稳定阶段：外源质粒在细胞内又复制成双链环型 dna4 表达阶段：即目的基因随质粒的复制子一起复制，并被转录及翻译。（5） 什么是转化子？什么是非转化子？转化子：带有异源 dna 分子的受体细胞

10、非转化子:不带有异源 dna(质粒) 分子的受体细胞实验五质粒 dna 的酶切与鉴定（1） 限制性核酸内切酶天然存在于什么生物体内？是一类能够识别双链 dna 分子中的某种特定核苷酸序列，并在识别序列内或附近特异切割双链 dna的核酸内切酶。限制性内切酶天然存在于细菌体内（2） 什么是细菌的限制-修饰系统？限制-修饰系统对细菌有什么用途？限制性内切酶,与相伴存在的甲基化酶共同构成细菌的限制-修饰系统（restriction-modification system）。用途:降解外来 dna 分子，以限制（restriction）或阻止病毒侵染，是细菌细胞为防御异源遗传物质进入的一种有效方式。（3

11、） 限制性内切酶有几类？这几类限制性内切酶各有什么特点？可作为工具酶的限制性内切酶是哪一类？为什么？型限制性内切酶功能：限制、修饰特点：需 mg2+、atp 和 s-腺苷蛋氨酸为辅助因子；识别位点和切割位点不一致，没有固定切割位点（随机性）应用：不常用。型限制性内切酶功能：功能：识别并特异切割 dna 分子, 即通常所指的 dna 限制性核酸内切酶。特点：仅需 mg2+作为催化反应的辅助因子，能识别双链 dna 的特殊序列，并可特异切割 dna，产生特异性的片段。应用：种类繁多,分子克隆最常用的内切酶。型限制性内切酶限制、修饰特点：需 mg2+、atp 和 s-腺苷蛋氨酸为辅助因子；特异切割，

12、切割位点在识别位点外，距识别位点 3端 24-26bp 处应用：数量很少，分子克隆中无实际作用（4） 限制性内切酶的识别序列有什么特点？称为什么序列？ii 型限制性核酸内切酶的识别序列通常是对称的，识别位点序列长度为 4-8 个核苷酸对。这种对称序列称为回纹序列（palindrome）。（5） 酶通常在什么温度中保存？为什么酶在该温度下保存不会结冻？酶最后工作的时候其甘油浓度必须低于多少？限制性内切酶需保存于-20，操作时应将酶保持在冰浴中，避免长时间置于高温中。限制性内切酶溶液通常含有 50%甘油（6）1 个单位（1 u）的限制性内切酶代表什么意思？酶活力单位的量度。1961 年国际酶学会议

13、规定：1 个酶活力单位是指在特定条件（25，其它为最适条件）下，在 1min 内能转化 1mol 底物的酶量，或是转化底物中 1mol 的有关基团的酶量。实验六目的基因的 pcr 扩增（1） pcr 反应液中主要成分是哪些？在 pcr 反应过程中各起什么作用？dna 模板、反应缓冲液、dntp、mgcl2、两条合成的 dna 引物、耐热 dna taq 聚合酶。（2） 为什么在 pcr 反应过程中，使用三个不同的温度变化？高温变性、低温退火、中温延伸 3 个阶段。1、变性：加热使模板 dna 在高温下（94-95）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。2、退火：在体系温度降至 37

14、-65，模板 dna 与引物按碱基配对原则互补结合，使引物与模板链 3端结合，形成部分双链 dna，即退火阶段。3、延伸：体系反应温度升至中温 72，耐热 dna 聚合酶以单链 dna 为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的 4 种脱氧核苷三磷酸（dntp），按 5到 3方向复制出互补 dna，即引物的延伸阶段。（3） 用 pcr 扩增目的基因，要想得到特异性产物需注意哪些事项？由于 pcr 灵敏度非常高，所以应当采取措施以防反应混合物受痕量 dna 的污染。1. 所有与 pcr 有关的试剂，只作 pcr 实验用，而不挪作它用。2. 操作中所用的 pcr 管、离心管、吸管头等都只能一次性使

15、用。3. 每加一种反应物，应换新的枪头。实验七dna 重组及转化实验（1） 什么是 t-载体？聚合酶链反应产物的克隆运载体，线性化后两侧 3端各多出一个脱氧胸苷酸(t)。由于 pcr 产物两侧 3 端通常含单个脱氧腺苷酸(a)，与 t 载体之间的 a-t 互补性可提高 pcr 产物克隆的效率。（2） 什么是 t-a 克隆？ta 克隆方法（original ta cloning kit）把 pcr 片断与一个具有 3-t 突出的载体 dna 连接起来的方法。（3）t-a 克隆 dna 重组实验的主要步骤有哪些？切,接,转,增,检（4） 目前获取目的基因的常用方法有哪些？一直接获取目的基因：1、从

16、供体细胞直接获取 （鸟枪法-用限制性内切酶处理 dna）2、从基因组文库中获取二合成法获取目的基因： 1、利用 mrna 反转录形成2、人工合成即根据蛋白质的氨基酸的序列推导出 mrna 的核糖核苷酸序列，再推导出 dna 的脱氧核苷酸的序列，最后用化学合成法合成目的基因3、pcr 扩增（5） 蓝-白斑筛选的原理是什么？n 由 -互补产生的 lac+ 细菌较易识别，它在生色底物 x-gal(5-溴-4 氯-3-吲哚-d-半乳糖苷)存在下被 iptg(异丙基-d-半乳糖苷)诱导形成蓝色菌落。n 当外源片段插入到 pucm-t 质粒的多克隆位点上后会导致读码框架改变， 表达蛋白失活，产生的氨基酸片

17、段失去 -互补能力，因此在同样条件下含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。此为 -互补现象筛选。“”“”at the end, xiao bian gives you a passage. minand once said, people who learn to learn are very happy people. in every wonderful life, learning is an eternal theme. as a professional clerical and teaching position, i understand the importance of continuous learning, life is diligent, nothing can be gained, only continuous learning can achieve better self. only by constantly learning and mastering the latest relevant knowl