远志高产途径、种质资源与鲨烯环氧酶基因克隆研究

1、远志高产途径、种质资源与鲨烯环氧酶基因克隆研究远志为远志科（ Polygalaceae ）植物远志 Polygala tenuifolia Willd.或卵叶远志 P. sibirica L.的干燥根 , 具有安神益智、祛痰、消肿、抗炎与抗诱变等作用 , 临床应用较广。本文从远志高产途径、 质量评价、种质资源遗传多样性、远志鲨烯环氧酶（ SE）基因克隆四个方面对远志进行了研究。1. 远志高产途径研究以远志种子千粒重与发芽率为指标拟定了远志种子贮存年限与千粒重标准：一级种子 , 贮存年限 2 年, 千粒重 2.711g ；二级种子 ,贮存年限 4 年, 千粒重 2.441g ；三级种子为劣质种子

2、。首次采用二次饱和D-最优设计建立了远志产量与N、P2O5、K2O施用量的产量回归模型：Y=5121+36.113X1+150.557X2+71.157X3-439.15X12-321.447X22-168.478X32-91.306X1X2-28.206X1X3+8.238X2X3。氮、磷、钾对远志产量效应顺序为： （NX1）>P（ X2）>K （X3） , 交互作用顺序为： NP>PK>NK, 获得5146.172kg/hm2 远志需投入氮 117.128kg, 磷 ,120.333kg,钾 ,136.257kg/hm2, 投入比例 11.03 1.16 。旱棚下采

3、用盆栽方式进行了水肥耦合试验 , 土壤含水量 14%的低水条件下 , 氮肥早施（开花期）优于晚施 , 低量氮肥比高量氮肥好 , 土壤含水量 24%的高水条件下 , 返青期 +开花期施 N处理 , 产量极显著高于其它处理组合。远志对氮肥的耐受范围较窄, 生长早期耐受性强 , 开花期是远志对水分与氮肥的需求高效期。远志需水规律与病虫害防治研究结果表明盛花期灌溉产量最高,乐果与苦参碱防治蚜虫效果显著高于鱼藤碱, 而乐果与苦参碱间防治效果差异不显著 , 生物农药木霉制剂与化学农药退菌特结合施用比二者分别单独施用, 对防治远志根腐病效果显著。首次对大田栽培远志群体生长动态进行了系统研究,2007 200

4、8 年远志主茎直径、鲜根直径、鲜根干根比、鲜根重、根干物质重、茎叶干物质重、生物学产量均随生长期的延长而增加, 分枝个数、支根数 2007 年较 2008 年为多 , 远志年生长期内株高变化呈抛物线形,2008 年远志株高明显高于2007 年。远志根干物质月增长最快时期在2007 年 7 月 20 日至 8 月 20 日与 2008 年 6 月 27 日至 7月 27 日,2008 年远志根部干物质积累总量大于2007 年。2. 远志质量评价研究远志 HPLC指纹图谱试验结果显示： 23 批远志指纹图谱相似度较高 , 远志野生变家栽后 , 有效物质群与野生药材相差较小 , 质量相当。不同采收月

5、份与生长时期栽培远志指纹图谱结构相似 , 生长时间对远志有效物质群种类影响不大。远志根心对照图谱与药材指纹图谱结构相似 , 但峰面积较小、含量较低 , 栽培与野生远志根心指纹图谱与其对照图谱相似度均在 0.807 以上。远志酸含量影响因素试验结果表明： 产地对远志酸含量影响达极显著水平； 海拔高度与纬度对远志酸含量具有一定影响； 2008 年不同月份采收的远志 , 远志酸含量明显高于 2007年同期采收的远志 , 远志中远志酸含量与远志生长年限与收获时期密切相关, 而与远志生长发育阶段关系可能并不密切, 远志在达到生长年限后应选择6、7 月份采收较好；远志根心中含有一定量的远志酸, 根心与药材

6、远志酸积累具有负相关的趋势；不同产地远志（Polygala tenuifolia Willd）叶中几乎不含远志酸 ,但四川茂县与九龙山卵叶远志叶（P. sibirical L）中远志酸含量稍高。3. 种质资源遗传多样性研究首次采用AFLP（amplified fragment lengthpolymorphism ）技术、毛细管电泳技术、植物等位酶分析技术在DNA、蛋白质与等位酶三个层次分别对远志种质资源遗传多样性进行了研究。对远志种质资源DNA采用 AFLP技术进行研究 , 共扩增出清晰可重复的310 个等位基因谱带 , 其中多态性条带 261 条 , 占 84.19%, 平均每个位点有 2

7、1.75 个等位变异 , 有效等位基因数 1.49 个,24 个远志居群的遗传一致度在 0.4000-0.8645 之间 , 遗传距离在0.1456 0.9163 之间 , 表明远志居群的遗传多样性较为丰富, 远志 AFLP分子标记的结果与经典形态学分类结论一致, 也与地理分布的不同相一致。采用毛细管电泳技术对远志种质资源蛋白质遗传多样性研究结果表明, 远志种质资源相似系数在0.316 0.895 之间 , 遗传多样性丰富 , 通过远志种质资源蛋白质所反映的亲缘关系仍表现为地理位置相近的远志资源相似系数较高, 亲缘关系较近 , 但远志栽培资源蛋白质性状差异较大, 山西不同产地的栽培远志, 在蛋

8、白质的多样性表达上却表现出与地理位置较远的四川茂县或甘肃等地野生远志较高的相似性 , 远志蛋白质遗传多样性研究与远志DNA遗传多样性研究结果并不完全一致。远志可溶性蛋白与等位酶的研究结果表明, 迁移率为 0.136 处的过氧化物酶谱带与迁移率为0.818 处的酯酶谱带可以将卵叶远志与远志区别开来, 迁移率为 0.492 处的过氧化物酶谱带可以将山西沁源远志与其它8 种远志区别开来 ,远志等位酶电泳条带多态性在0.198 0.444 之间 ,9 份远志种质资源的遗传一致性在 0.3 0.9 之间 , 卵叶远志与远志间的遗传一致性明显低于远志种质资源间的遗传一致性 , 遗传距离较大 , 远志可溶性蛋白与等位酶酶谱相似度与远志地理位置的分布具有一定的相关性。首次对远志酸生物合成途径中关键酶鲨烯环氧酶基因（SE）进行了研究 , 利用 5 对简并引物 , 对远志鲨烯环氧酶DNA基因进行克隆 , 获得一条 517bp 的核苷酸 ,经 GenBank Blastx 鉴定 , 该核苷酸片段属于 SE基因片断 , 根据