DNA疫苗PPT课件

1、1,Genic Guard 基因疫苗,2,疫苗的发展,3,基因疫苗的发展,1992年， Tang等 将表达人生长激素的基因质粒DNA，导入小鼠的表皮细胞 小鼠血中：检测到特异性抗生长激素抗体 再次注入加强剂量质粒： 免疫反应增强,Wolff等：小鼠基因治疗试验(1990) 对照动物 将带有报告基因的质粒DNA直接肌肉注射入 意外发现： 肌细胞内：检测到该外源基因的表达产物,4,Ulmer等（1993） 将重组甲型流感病毒核蛋白( nucleoprotein，NP)的cDNA片断插入含有巨细胞病毒(CMV)启动子的质粒中 将该质粒直接注射入小鼠的四头肌内 结果：小鼠产生了特异的细胞毒T淋巴细胞(

2、CTL)应答和高滴度的抗体,1994年在日内瓦召开的专题会议上将这种疫苗定名为基因疫苗,5,概 念,基因疫苗(genetic vaccine) 是指一类将抗原基因重组到表达载体上的重组质粒疫苗，经肌肉注射或黏膜免疫等方法导入宿主体内，通过宿主细胞表达抗原蛋白，诱导宿主细胞产生对该抗原蛋白的免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的,新型疫苗（1990-） 第三次疫苗革命” 美国纽约科学院：疫苗学的新纪元(1995） 又称为： DNA疫苗(DNA vaccine) 基因免疫(genetic immunization) 核酸免疫(nucleic acid immunization,6,基因工程疫苗,基因

3、疫苗,7,基因工程疫苗”与“基因疫苗,基因疫苗 即将编码外源性抗原的基因插入到含真核表达系统的质粒上，然后将质粒直接导入人或动物体内，让其在宿主细胞中表达 抗原蛋白，诱导机体产生免疫应答。抗原基因在一定时限内的持续表达，不断刺激机体免疫系统，使之达到防病的目的,基因工程疫苗 也称遗传工程疫苗使用DNA重组生物技术，把天然的或人工合成的遗传物质定向插入细菌、酵母菌或哺乳动物细胞中，使之充分表达，利用表达的抗原产物，或重组体本身制成的疫苗。 主要包括基因工程亚单位疫苗，基因工程载体疫苗，核酸疫苗，基因缺失活疫苗，及蛋白工程疫苗等五种,8,基因免疫的原理,质粒DNA导入细胞后，抗原编码基因表达抗原蛋

4、白，随后被降解为812个氨基酸短肽,短肽上含有抗原表位，分别与MHC-1类和MHC-2类分子结合并被呈递到细胞表面,与MHC-类分子结合的短肽激活CD8+T细胞( Tc ),与MHC-类结合的短肽激活CD4+T细胞（ Th,分泌到细胞外的抗原被带有相应抗体的B细胞捕捉，在T辅助细胞分泌淋巴因子的刺激下转化为浆细胞，大量分泌抗体,9,基因免疫的原理,10,DNA疫苗的构建,目的基因的选择： 侧重于免疫原性，即所表达的目的蛋白刺激机体免疫应答的能力。目的蛋白中是否具有受MHC分子限制的T细胞抗原表位，是保证核酸免疫有效的先决条件。核酸疫苗所选择的目的基因应尽量避免有害基因成分，特别是病毒或肿瘤的核

5、酸免疫,11,载体的选择： 构建DNA疫苗的质粒通常是非复制型的真核表达质粒，能高水平地表达目的基因,重组质粒可分为两个部分： 转录部分：由启动子、插入的目的抗原cDNA和poly A终止子组成，指导目的蛋白在体内表达，诱发特异性免疫应答。 佐剂部分：CpG基序,12,启动子的选择： 质粒在宿主细胞内表达外源性蛋白的水平与调控DNA表达的启动子关系密切。表达水平的不同又直接影响免疫应答的强度和持续性,13,DNA疫苗的优化 联合构建：在载体质粒中插入2个或2个以上目的抗原基因，既能激活CD8T细胞产生特异性CTL，又能激活CD4Th2细胞产生体液免疫。 协同构建：将目的基因与某种细胞因子的基因

6、构建成嵌合基因，以促进目的基因的免疫效果,14,免疫途径、剂量、时间： 常见免疫途径有： 注射方式（皮内、皮下、肌内等），也可以用基因枪注射接种 非注射方式：口服、鼻内滴注、鼻腔喷雾接种等,15,DNA注射剂量以实验动物种类而异。对小鼠而言，最适宜的注射剂量为50100ug，对小牛注射则需500ugDNA，太少基因表达很低，太高则不呈剂量相关,年龄越小，DNA疫苗产生的效果越好,16,DNA疫苗的特点,1）既能诱导细胞免疫反应，也能刺激产生体液免疫反应,原因：表达产物 一部分在降解后与MHC-I类分子结合 一部分也可分泌出去，经抗原递呈细胞(APC)等途径与MHC-II类分子结合,17,2）安

7、全可靠 可根据需要设计、选择DNA疫苗的抗原基因，靶向性明确; 质粒载体上的CpG基序具有强烈的佐剂作用，故DNA疫苗接种时一般不需外加佐剂,18,3）价格低廉 质粒经转化细菌扩增后，其提取、纯化等制备过程远比蛋白质纯化技术简单得多，省钱、省时和省力，适宜于规模性生产； DNA疫苗在常温下性能稳定，可以室温保存，不需要冷链运输，容易保证高效接种率,19,4）多途径免疫接种， 易为免疫对象所接受，也有利于模拟自然感染途径。 注射方式（皮内、皮下、肌内等），也可以用基因枪注射接种 非注射方式：口服、鼻内滴注、鼻腔喷雾接种等,20,基因枪,利用高压气体加速， 将包裹了DNA的球状金粉或者钨粉颗粒 直

8、接送入完整的植物组织或者细胞中 这一加速设备称为基因枪,21,DNA疫苗的应用,牛病毒性腹泻病毒（BVDV) 以表达BVDV1型主要糖蛋白E2的质粒DNA肌肉注射小牛，可产生病毒中和抗体和抗原特异的细胞增殖反应；免疫后16周进行攻毒试验，发现免疫牛能产生针对BVDV1型和2型的血清中和抗体强烈的记忆抗体反应，对牛有部分免疫保护作用,22,鸡传染性喉气管炎病毒（ILT) 将分别构建的含有鸡传染性喉气管炎病毒王岗株gB、gC和gD基因的重组真核表达质粒及空载体质粒分组注射雏鸡，攻毒后观察免疫保护效果。结果表明，重组质粒诱导了免疫应答，免疫保护率达到79%，该基因疫苗可以作为预防ILV的1个补充,2

9、3,DNA疫苗的优点,DNA接种载体（如质粒）的结构简单，提纯质粒DNA的工艺简便，因而生产成本较低，且适于大批量生产,DNA分子克隆比较容易，使得DNA疫苗能根据需要随时进行更新,DNA分子很稳定，可制成DNA疫苗冻干苗，使用时在盐溶液中可恢复原有活性，因而便于运输和保存,24,质粒本身可作为佐剂，因此使用DNA疫苗不用加佐剂，既降低成本又方便使用,比传统疫苗安全，虽然DNA疫苗具有与弱毒疫苗相当的免疫原性，能激活细胞毒性T淋巴细胞而诱导细胞免疫，但由于DNA序列编码的仅是单一的一段病毒基因，基本没有毒性逆转的可能，因此不存在减毒疫苗毒力回升的危险,将多种质粒DNA简单混合，组成多价疫苗，使DNA疫苗生产的灵活性大大增加,25,DNA疫苗发展中存在的问题,目前，DNA疫苗尚未得到广泛的应用，除了因为它是一种新事物，不大为人所了解之外，它本身的安全问题则是人们对它 的最大顾虑。DNA疫苗存在的问题如下,外源DNA进入机体后是否整合到宿主基因组，导致癌基因激活或抑癌基因失活,DNA疫苗长期在体内表达是否会诱导机体产生免疫耐受，长远来说，导致机体免疫功能低下,DNA疫苗作为一种外来物质，是否会引起机体产生抗DNA抗体,DNA疫苗诱导的CTL反应是否会对其他细胞产生杀伤作用,26,DNA疫苗的发展前景,近年来，许多畜禽病毒性传染病，已