拟南芥转录因子MYB73抗核盘菌的分子机制研究

1、拟南芥转录因子MYB73抗核盘菌的分子机制研究由核盘菌 (Sclerotinia sclerotiorum)引起的菌核病常在世界范围内的粮油、蔬菜等作物生产上造成严重的经济损失。研究植物抗核盘菌的分子机制, 对于培育作物抗核盘菌的新品种具有重要意义。本研究中 , 我们分离鉴定了 1 个拟南芥抗核盘菌相关基因MYB73,并研究了MYB73在植物抗病反应中的功能, 进一步利用酵母双杂交技术, 获得 MYB73互作蛋白 , 为完善植物的抗病信号网络和指导病害防治提供理论依据。主要研究结果如下 :1. 通过对 myb73进行抗病性测定 , 发现 myb73接种核盘菌后其病斑面积明显大于野生型 (WT)

2、, 且 myb73中核盘菌 SsTUBULIN的表达水平也明显高于 WT,明确了myb73为核盘菌敏感突变体。进而获得 MYB73超表达植株 (OE), 经抗病性测定发现MYB73超表达植株对核盘菌的抗性明显高于野生型, 分析了接种核盘菌后WT,myb73和 OE植株中 POD活性和 MDA含量 , 确定 MYB73为拟南芥抗核盘菌相关基因。2. 对 WT、myb73和 OE植株接种致病细菌丁香假单胞杆菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pvtomato DC3000,Pst DC3000), 结果发现 myb73对 Pst DC3000 抗性增强 , 且 OE对Pst

3、DC3000的感病程度与 WT相似 ,Real time-PCR 分析发现 ,PstDC3000侵染 WT后 ,MYB73表达明显下调 , 抗病相关基因 PR1,PR3,PR5和 PDF1.2的表达在接种不同时间均出现上调 , 表明 MYB73为拟南芥抗 Pst DC3000 的负调控因子。3.RT-PCR分析发现 ,myb73 中 PR1和 PDF1.2表达与 WT中没有明显差别 , 表明MYB73基因功能缺失不直接影响PR1和 PDF1.2的表达 ;myb73 中 SOD,POD和 CAT的表达低于 WT,但 PAL和 PPO的表达高于 WT,表明 MYB73与抗氧化基因表达相关 ;myb

4、73中 NPR1表达被抑制 , 同时 npr1 中 MYB73表达被抑制 , 表明 MYB73与 NPR1的表达具有相互协同作用;eds5,sid2,npr1和 jar1 突变体中 ,MYB73表达低于 WT,同时水杨酸 (salicylic acid,SA)处理 eds5,sid2和 nahG及茉莉酸 (jasmonicacid,JA) 处理 jar1突变体后 ,MYB73表达被诱导 , 表明 MYB73的表达依赖于EDS5,SID2,NahG和 JAR1,且受 SA和 JA 信号途径调控。 4.SA、 JA 和 ACC处理 WT和 myb73不同时间 , 结果发现 WT和 myb73中 P

5、R1和 PDF1.2 的表达没有明显变化 ,ACC处理 WT 12 h 后 ICS1 表达上调 , 但 ACC处理 myb73 12 h 后 ICS1 表达没有增加 , 表明 MYB73功能缺失抑制了 ACC对 ICS1 的诱导表达。核盘菌接种 WT和 myb73后, 结果发现 WT和 myb73突变体中 PR1和 PDF1.2的表达没有明显变化 , 但接种核盘菌 1 h 后,myb73 中 ICS1 的表达显著下降 , 表明核盘菌侵染过程中 ,MYB73功能缺失抑制了ICS1 的表达。 5. 不同浓度的 SA、 JA和 ACC处理 WT和 myb73,结果发现 100M的 JA 处理后 ,m

6、yb73 根的抑制程度明显小于 WT,而 SA和 ACC处理后 ,myb73 根的生长和下胚轴的生长与WT相似 , 表明MYB73功能缺失减弱了JA 对拟南芥根的抑制作用。6.HPLC分析发现 ,myb73 中的 SA含量与 WT没有明显差别 , 但核盘菌侵染 24 h后 myb73中的 SA含量明显低于 WT;ELISA分析发现 ,myb73 中的 ABA含量明显低于 WT,而核盘菌侵染 24 h 后 myb73和 WT中的 ABA含量均出现上调 , 但 myb73中ABA的含量依然低于 WT,说明 MYB73功能缺失抑制了 SA的诱导合成和 ABA的积累。7. 本研究构建了 MYB73的诱饵表达载体 , 转录活性分析确定 MYB73具有很高的转录激活活性 , 其转录激活区域位于 C 端。以 MYB73为诱饵 , 利用酵母双杂交体系筛选拟南芥 cDNA文库 , 获得了 15 个阳性克隆。 RT-PCR分析发现 , 核盘菌侵染 24 h 后 AT1G12080编码基因 F12F1.4 在WT中表达明显下调 , 在 myb73中表达明显上