掌叶覆盆子的化学成分及其活性研究

1、掌叶覆盆子的化学成分及其活性研究掌叶覆盆子作为一种药食同源品种, 具有多种生物活性 , 极具研究开发前景。掌叶覆盆子中有效成分复杂, 至今尚未完全明晰。对掌叶覆盆子的功能性成分的研究还有待进一步深入探讨, 以促进覆盆子资源的开发与利用。本论文通过现代色谱及波谱技术分离和鉴定掌叶覆盆子的有效成分 , 阐明了掌叶覆盆子中主要活性物质, 包括挥发性成分、活性小分子化合物以及多糖等 ; 探讨了一种黄酮苷类化合物的抗炎作用机制; 阐明了一种三萜类化合物抑制人乳腺癌细胞增殖、 诱导凋亡的作用机制 ; 探索了覆盆子多糖的提取纯化、理化性质、结构分析以及活性评价。本研究有助于阐明掌叶覆盆子药食两用的物质基础,

2、 并且可以对其高附加值产品的开发提供理论支持和方法的指导。(1) 通过水蒸气蒸馏法、索氏乙醇提取法和索氏乙醚提取法分别提取覆盆子果实中挥发性成分, 提取率依次为 0.15%、2.12%和 1.98%。利用气相色谱 - 质谱法 (GC-MS)分离鉴定其中的挥发性成分, 三种不同的提取方法从覆盆子果实中共分离鉴定出58 种挥发性成分 , 其中包括 8 类化合物 :9 种饱和烃类、 10 种不饱和烃类、 9 种醇类、 2 种羰基类化合物、 11 种酯类、 7 种有机酸类、 8 种氧化物类及两种其它类化合物。用水蒸气蒸馏法、索氏乙醇提取法和索氏乙醚提取法提取得到的覆盆子挥发油分别分离鉴定出54、47

3、和 41 种化合物。索氏乙醚提取法得到的覆盆子挥发油含有较多的饱和烃类化合物与酯类化合物。在三种挥发油中 , 通过索氏乙醚提取法提取得到的覆盆子挥发油具有较强的溶血抑制效果 , 显著高于阳性对照肝素钠在相同浓度下的溶血抑制率, 这可能与其含有更多的酯类化合物相关; 通过水蒸气蒸馏法提取得到的覆盆子挥发油抑制人肺癌细胞 (A549) 增殖的效果最好 , 这可能与其含有大量的不饱和脂肪酸有关。(2) 提取分离得到覆盆子四大类活性物质 ( 多糖、黄酮、皂苷和生物碱 ) 并对其进行了抗氧化、抗补体以及抗肿瘤活性评价 , 研究结果表明 , 覆盆子总黄酮具有良好的抗氧化活性和卓越的抗补体活性 , 同时还具

4、有显著的抗肿瘤活性 , 说明黄酮富集了本植物有效活性成分。通过单因素实验和Box-Benhnken 中心组合实验得到覆盆子黄酮提取的最佳工艺条件为: 提取温度 75, 时间为 2.5h, 乙醇浓度为 30%,液固比为 20:1 。在此条件下 , 覆盆子总黄酮平均提取率为3.2%, 与理论相符。通过硅胶柱层析和重结晶从覆盆子黄酮中分离纯化得到了一种主要化合物, 鉴定为椴树苷。通过 MTT实验 , 探讨了椴树苷对A549 肺癌细胞增殖能力的影响, 结果表明椴树苷对人肺癌细胞A549 有明显的抑制作用 , 并且呈现出浓度依赖性。 经 AnnexinV-FITC/PI 双染以及流式细胞仪检测分析, 椴

5、树苷是通过诱导A549细胞的凋亡来抑制肿瘤细胞的增殖。(3) 采用 95%乙醇加热回流提取的方法 , 减压浓缩得到覆盆子 95%乙醇粗提取物 , 有机溶剂分级萃取得到四个极性部位 : 石油醚萃取物、 乙酸乙酯萃取物、 正丁醇萃取物和水萃取物。活性评价实验结果表明 , 覆盆子乙酸乙酯萃取物不仅具有良好的抗氧化活性和卓越的抗炎活性 , 还具有显著的抗肿瘤活性 , 说明覆盆子 95%乙醇粗提取物经过不同极性的有机溶剂分级萃取后, 活性成分主要集中在乙酸乙酯部位。利用柱色谱层析法和高效液相分析等分离纯化手段对覆盆子乙酸乙酯部位进行了系统全面的分离纯化, 共得到 9 个单体化合物 , 分别为 : 对映

6、-16 ,17- 二羟基 - 贝壳杉 -19- 羧酸、委陵菜酸、齐墩果酸、槲皮苷、金丝桃苷、椴树苷、-胡萝卜苷、紫云英苷、山奈酚 -3-O- 芸香糖苷。 其中化合物对映 -16 ,17- 二羟基- 贝壳杉 -19- 羧酸和委陵菜酸为首次从覆盆子中分离得到。(4) 覆盆子中提取得到的黄酮苷类化合物 ( 槲皮苷、金丝桃苷、椴树苷和紫云英苷 ) 均表现出一定程度的 NO抑制作用 , 并呈现浓度依赖性 ; 其中 , 椴树苷具有极好的抗炎活性 , 当浓度为 100 g/m L 时 , 其 NO释放抑制率为 30.4%, 接近于 50g/m L 地塞米松 (DXM)的抗炎效果。研究表明椴树苷可能是通过巨噬

7、细胞内MAPKs/NF- B信号转导通路 , 抑制 TNF-、iNOS、IL-6mRNA等相关基因转录从而进一步抑制 NO及相关炎症因子的产生 , 最终起到抗炎作用。(5) 通过 MTT实验 , 探讨了从覆盆子中分离纯化得到的单体化合物对4 种肿瘤细胞和 1 种正常细胞的增殖能力的影响, 实验结果表明委陵菜酸 (tormenticacid)对人乳腺癌 MCF-7细胞的增殖抑制作用尤为显著, 并表现出较强的细胞选择性。通过流式细胞仪检测分析, 委陵菜酸抑制 MCF-7细胞增殖是通过诱导细胞凋亡和G0/G1期阻滞来实现的。委陵菜酸能够促使MCF-7细胞内 ROS的产生 , 过量的 ROS会攻击线粒

8、体 , 使MCF-7细胞内线粒体跨膜电位 ( m)下降而导致线粒体功能紊乱; 同时 , 委陵菜酸能够激活 Caspase-9 和 Caspase-3 的活化 , 导致细胞凋亡。 另一方面 ,ROS水平过高能够触发 NF- B 途径和 MAPKs途径 , 其中 , 委陵菜酸能够下调细胞内p-p65和 p-ERK的蛋白表达 , 进而调控下游的信号分子转导和相关的基因转录 , 如 CDK4和 Cyclin D1等, 最终导致细胞凋亡和 G0/G1期阻滞的发生 , 抑制人乳腺癌 MCF-7细胞的增殖。(6) 通过水提醇沉法并经过脱色、脱蛋白处理得到覆盆子果实粗多糖F-Ps和覆盆子叶粗多糖L-Ps, 对

9、这两种多糖进行活性 ( 抗氧化、抗炎和抗肿瘤活性 ) 评价 , 实验结果表明 , 覆盆子叶粗多糖的活性优于覆盆子果实粗多糖 , 因此对覆盆子叶粗多糖的提取工艺进行了优化研究 , 最佳工艺条件为 : 提取温度 88, 时间为 3h, 液固比为 30:1 。在此条件下 , 覆盆子叶粗多糖平均提取率为9.57%, 与理论相符。对提取得到的覆盆子果实粗多糖和覆盆子叶粗多糖进行理化性质比较分析以及 DEAE-52离子交换柱层析 , 对得到的覆盆子果实纯化多糖F-Ps-3 和叶纯化多糖 L-Ps-1 进行分子量测定及单糖组成成分分析 , 实验结果表明 , 覆盆子果实粗多糖洗脱曲线的主峰为 0.3 M NaCl 洗脱得到的峰 F-Ps-3, 其相对分子量为 81 kDa;而叶粗多糖洗脱曲线的主峰为蒸馏水洗脱得到的峰L-Ps-1, 其相对分子量为17kDa。覆盆子果实纯化多糖F-Ps-3 的各单糖摩尔比为L- 鼠李糖 L- 阿拉伯糖D-木糖 D-葡萄糖 D-半乳糖 =4