鸡肠道致病菌的分离鉴定试验设计

1、鸡肠道致病菌的分离鉴定试验设计鸡肠道致病菌种类：大肠杆菌与沙门氏菌实验内容： 阶段一：大肠杆菌与沙门氏菌的形态培养特性的观察，实验材料的增菌与直接分离培养。 阶段二：识别菌落、做纯培养及三糖铁琼脂接种 阶段三：菌种纯度检查及生化培养基接种 阶段四：生化反应结果观察与沙门氏菌血清学诊断。阶段一：1、 材料实验菌种 混合菌液甲（大肠杆菌和沙门氏菌） ，混合菌液乙（产气肠杆菌与普通变形杆菌） 观察材料四种细菌的融通培养物、琼脂平板、麦康凯或SS琼脂平板的培养物、三糖铁琼脂 培养物。培养基亚硒酸盐亮绿增菌液或四磺酸钠增菌液；SS琼脂平板、麦康凯、琼脂平板等选择与鉴别培养基。2、 内容与方法培养特性观察

2、 对大肠杆菌、沙门氏菌、产气肠杆菌、普通变形杆菌在常用培养基上的培养 特性作仔细观察并相互比较。形态观察 以无菌接种环分别挑取上述四种细菌在麦康凯等琼脂平板上生长的单个菌落。在 玻片上制成涂片，待自然干燥后，以火焰固定，用革兰氏染色法染色，镜检。观察没在细菌 的形态、大小与排列方式，并作比较。这四种细菌都是革兰氏阴性而两端钝圆的杆菌，无芽孢和荚膜，大小差异不显著。增菌培养 用无菌 2ml 刻度吸管吸取混合菌液甲 2ml ，分别加入亚硝酸盐亮绿增菌液 100ml 的试管与四磺酸钠增菌液 10ml的试管中各1ml。换另一支无菌吸管，以同样的方法将混合 菌液乙接种到两种增菌液中，接种后轻轻摇匀，置

3、37 摄氏度恒温箱内培养 18-24h 。 直接分离培养 每种混合菌液用常规划线方法，接种麦康凯琼脂平板和SS琼脂平板各一个。置 37 摄氏度恒温箱内培养 24h 后取出，观察每种平板上两种细菌的生长情况，单个菌落的 形态，并比较之。保留活动单个菌落的平板培养物，待阶段二使用。阶段二1 、 材料普通琼脂斜面、三糖铁琼脂等。2、 内容与安排纯培养 从经 24h 培养的麦康凯琼脂平板上，分别选出 4种不同的细菌的单个菌落。然后， 用无菌接种环在四个单个菌落的中央表面轻轻取培养物少许，各移植至普通琼脂斜面一管， 置 37 摄氏度恒温箱中培养 24 后，取出后在冰箱内或室温保存备用。三糖铁琼脂接种 用

4、灭菌接种环从纯培养所选定的四个单个菌落中再次分别挑取细菌少许， 各接种一管三糖铁琼脂。 接种时， 现涂布斜面， 后穿刺底层。 置 37 摄氏度恒温箱中培养 24h, 取出观察其反应情况，并将结果记录在后面的附表内。阶段三1 、 材料生化培养基 蛋白胨水、葡萄糖蛋白胨水、糖培养基、尿素琼脂、醋酸铅琼脂、枸橼酸盐琼 脂、半固体琼脂、硝酸钾蛋白胨溶液等。2、 内容与方法菌种纯度检查 生化试验前，须对菌种进行纯度检查，以保证其不污染杂菌，否则，影响生 化反应结果的准确性。检查方法同一般培养物的制片、染色、 镜检。 镜检时瑶适当多看几个 视野， 每视野中细菌形态与染色性质均须符合该菌种的特性。 凡污染杂

5、菌者， 此菌种不可使 用。糖发酵管接种 每种培养物分别接种葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露糖、蔗糖、卫矛醇微量生 化培养管。每种糖一管，或穿洞接种每种糖的半固体糖培养基。蛋白胨水接种 每接种一管，培养后作吲哚试验。葡萄糖蛋白胨水接种 没见着接种两管，培养后一管作 MR试验，另一管作 VP试验。 尿素琼脂接种 每一纯培养接种一管，接种量可以大。枸橼酸盐琼脂接种 每一纯培养各接种一管，接种量要少。醋酸铅琼脂接种 每一纯培养接种一管，接种时应靠近管壁穿刺，以便于观察结果。 半固体琼脂接种 纯培养各穿刺接种一管，穿刺线应在培养基中央，一直刺到管底，拔出穿 刺针时应顺原穿刺线取出，切不可左右滑动，以免影响观察

6、结果。硝酸钾蛋白胨溶液接种 纯培养各接种一管。 以上培养基接种后，应在各管管壁上标记菌种号码，然后置入37 摄氏度恒温箱中培养2 3d,待下阶段实验结果。糖培养基按规定应每日观察一次，尿素培养基接种的细菌量多时，一般在培养后数小时内出现反应结果，但为了便于实验，都可在下次实验观察结果。阶段四1、 材料生化试剂 MR试剂、VP试剂、吲哚试剂、乙醚、硝酸盐还原试剂、生理盐水等。沙门氏杆菌诊断血清：AE群多价0血清及单因子血清。2、 内容与方法糖发酵 取经 23 天培养后的四种菌的 6 种培养管， 观察， 凡培养基变为黄色者， 表示该菌 发酵此糖产酸（ +）；凡培养基变黄且含气泡者，为发酵此糖产酸产

7、气（ +）；凡培养基不变色 者，表示该菌不发酵此糖（ -）。MR试验 取一支2-3天培养的葡萄糖蛋白胨水培养管，加入MR试剂数滴（2-5滴），凡液体呈红色者为阳性反应（ +），呈黄色者为阴性反应（ -），橙色者为可疑反应（） 。VP试验 取另一支葡萄糖蛋白胨水培养管，先加含甲萘酚的 VP试剂甲液3ml，再加VP试剂乙液（KOH40%） 1ml，摇匀后静置试管架上 1-2h后，观察结果。凡液体呈红色者为阳性， 不变色者为阴性。吲哚试验 取蛋白胨培养管先加乙醚少量，塞紧棉塞摇振试管使乙醚与培养液充分混匀，静 置试管架上片刻，待乙醚浮于液面上层时，沿管壁加入吲哚试剂2-3滴。凡在乙醚层内出现玫瑰红者

8、为阳性，不变色者为阴性反应。枸橼酸盐利用 观察经 2-3 天培养的枸橼酸盐琼脂管是否有细菌生长，并观察其颜色变化。 凡有生长，培养基为天蓝色者，为该菌利用枸橼酸盐，否则为阴性。硫化氢 观察经 2-3 天培养醋酸铅琼脂管， 凡沿穿刺线或者其周围出现黑色沉淀者， 为阳性， 无黑色者为阴性反应。运动力 观察半固体琼脂培养管， 凡细菌有鞭毛运动者， 则部分或者全部半固体琼脂变浑浊， 凡不运动者细菌仅在穿刺线上生长，穿刺线外围培养基仍然透明。硝酸盐还原试验 将硝酸钾蛋白胨溶液取出， 观察生长（应浑浊） ，每管沿管壁加入试液甲和 试液乙各两滴，红色者为阳性。将各反应结果记录。沙门氏菌血清学诊断玻板凝集法。分群：取一张清洁的薄皮，滴一小滴沙门氏菌AE群多价0血清至玻片上，再用接种环挑取疑为沙门氏菌的纯培养物少许，与玻片上的AE群多价0血清混匀呈浓菌液，混匀后摇动玻片如果在2min内出现凝集现象，即可初步诊断该菌为沙门氏菌。同样，应以生理盐 水代替多价血清作一对照，以免有自身凝集的细菌而使判断错误。进一步用代表各群的0因子血清作同样的玻片凝集反应，被哪一群0因子血清凝集，则确定被检沙门氏菌为该群。定型：菌群决定后，用该群所含的各种 H因子血清和被检菌作玻片凝集反应，以确定其