WB技术服务报告模板

1、wb技术服务报告模板正式实验客户姓名：报告日期：一、客户样品及抗体登记1样品种属来源：2样品标记：组织细胞样品名称备注3抗体名称：抗体来源：抗体cat.及lot号：二、材料和方法1试剂及耗材蛋白抽提试剂（改进型ripa配方）bca蛋白定量试剂盒2mg/mlbsa标准品5还原样品缓冲液10tris-glycine-sds电泳缓冲液考马斯亮蓝染色液10tbstph8.0中分子量蛋白marker（7条带）中分子量预染蛋白marker（7条带）湿转缓冲液nc膜，0.45um孔径丽春红染色液bsapmsfmilliporeamrescoamresco蛋白酶抑制剂磷酸酶抑制剂脱脂奶粉eclrocheroc

2、he伊利milliporestrippingbuffer（抗体洗脱液）（抗体需要选择，选择后把余外的删除）山羊抗兔igg（h+l），hrp山羊抗小鼠igg（h+l），hrp兔抗山羊igg（h+l），hrpbeta-actin兔多抗beta-actin鼠单抗beta-tubulin兔多抗beta-tubulin鼠单抗gapdh兔多抗gapdh鼠单抗2实验仪器fresco低温冷冻离心机multiskan3酶标仪minip-4电泳槽湿转电泳槽电泳仪半干槽水平脱色摇床酸度计ph211电动组织匀浆器三、实验方法及结果3.1蛋白抽提3.1.1组织蛋白抽提jacksonjacksonjacksontherm

3、othermocavoycavoybio-radbio-rad其林贝尔hannafluka预冷ripa蛋白抽提试剂，加入蛋白酶抑制剂（磷酸化蛋白需要同时加入磷酸酶抑制剂）。在蛋白抽提开始前加入0.1mpmsf母液，pmsf终浓度1mm。称取组织重量以重量：裂解液体积=1:9比例加入裂解液，用眼科剪剪碎组织块，fluka电动组织匀浆器15000rpm转速进行匀浆，每次10s，间隔10s，进行三次匀浆。匀浆时ep管需要浸入冰水混合物中进行降温。匀浆完成后在冰上孵育20min，4度离心，13000rpm，20min。离心完成后取上清，分装储存，待测。3.1.2细胞蛋白抽提预冷ripa蛋白抽提试剂，加

4、入蛋白酶抑制剂（磷酸化蛋白需要同时加入磷酸酶抑制剂）。在蛋白抽提开始前加入0.1mpmsf母液，pmsf终浓度1mm。细胞计数，以细胞数量1107加入1ml裂解液，用枪头吹打充分悬起细胞，完成后在冰上孵育20min，4度离心，13000rpm，20min。离心完成后取上清，分装储存，待测。3.2bca法蛋白定量预备bca工作液a液：b液=50:1，稀释好各个提取bsa标准品。样品用pbs进行稀释。样品：bca工作液=1:8，混匀后37度孵育30min或者室温孵育60min，酶标仪570nm波长滤光片读取od值。蛋白浓度运算见下表：3.3蛋白浓度调整以ripa调整蛋白浓度，加入5还原样品缓冲液后

5、样品终浓度为2-4mg/ml（不同样品具体确定）。煮沸变性5min。样品蛋白浓度调整见下表：3.4sds-page3.4.1按照目的蛋白的分子量，配制12%分离胶，浓缩胶浓度为5%。3.4.2待检测蛋白样品上样量：上样20ug3.4.3电泳条件：浓缩胶恒压90v，约20min，溴酚蓝进行分离胶界面；分离胶恒压160v，电泳至溴酚蓝到凝胶底部。3.4.4用考马斯亮蓝染色液进行染色。染色结果见下图：3.5目的蛋白wb正式实验3.5.1按照目的蛋白的分子量，配制%分离胶，浓缩胶浓度为5%。3.5.2待检测蛋白样品上样量：3.5.3电泳条件：浓缩胶恒压90v，约20min；分离胶恒压160v，通过预染

6、蛋白marker来确定电泳停止时刻。3.5.4湿转法，转膜条件：300ma恒流；0.45um孔径nc膜，转膜时刻h。转膜完成后丽春红染色试剂对膜进行染色，观看转膜成效。同时做好泳道标记，预备预实验时进行按照纵向泳道剪膜。3.5.5封闭：将膜完全浸没5%脱脂奶粉-tbst中室温轻摇60min。3.5.6一抗孵育：用5%脱脂奶粉-tbst稀释稀释一抗，室温孵育10min，放4过夜。膜编号一抗名称稀释比例稀释后体积备注：按照预实验中确定的稀释度进行正式实验。选择一种内参进行同步预实验。3.5.7翌日从4度拿出膜，在室温孵育30min。洗膜：tbst洗膜5次，每次3min。3.5.8二抗孵育：用5%脱

7、脂奶粉-tbst稀释二抗，山羊抗兔igg（h+l）hrp山羊抗小鼠igg（h+l）hrp，1:10000，室温轻摇40min。洗膜：tbst洗膜6次，每次3min。3.5.9ecl加到膜上后反应3-5min，胶片曝光：10s-5min（曝光时刻随不同光强度而调整），显影2min，定影。胶片扫描后结果如下：3.6内参蛋白wb正式实验3.6.1strippingbuffer洗膜，37洗膜30min（如果目的蛋白与内参蛋白分子量相差在10k以上，能够不用strippingbuffer洗膜这一步）。3.6.2洗膜：去离子水洗膜3次。3.6.3洗膜：tbst洗膜3次，每次3min3.6.4将膜完全浸没3%bsa-tbst中室温轻摇30min。3.6.5孵育内参：加beta-actin兔多抗，用5%脱脂奶粉-tbst稀释抗体，1：3000稀释，室温孵育2h。3.6.6洗膜：tbst洗膜5次，每次3min。3.6.7二抗孵育：用5%脱脂奶粉-tbst稀释二抗，山羊抗兔igg（h+l）hrp山羊抗小鼠igg（h+l）hrp，1:10000，室温轻摇40min。洗膜：tbst洗膜6次，每次3min。3.6.8洗膜：tbst洗膜5次，每次3mi