液相色谱柱的使用注意事项及再生讲解

1、液相色谱柱的使用注意事项及再生 1、色谱柱的使用说明： （1）、色谱柱使用前注意事项：色谱柱的储存液无特殊说明，均为评价报告所示的流动相。在使用前，一定要注意色谱柱的储存液与要分析样品的流动相是否互溶。在反相色谱中，如用高浓度的盐或缓冲液作洗脱剂，应先用10左右的低浓度的有机相洗脱剂过渡一下，否则缓冲液中的盐在高浓度的有机相中很容易析出，堵塞色谱柱。（2）、流动相：流动相中所使用的各种有机溶剂要尽可能使用色谱纯，配流动相的水最好是超纯水或全玻璃器皿的双蒸水。如果将所配得流动相再经过0.45m的滤膜过滤一次则更好，尤其是含盐的流动相。另外，装流动相的容器和色谱系统中的在线过滤器等装置应该定期清洗

2、或更换。以常规硅胶为基质的键合相填料通常的PH值适用范围是2.0-8.0，BDS C18适合于碱性化合物，PH值适用范围为2.0-10.0。当必须要在PH值适用范围的边界条件下使用色谱柱时，每次使用结束后立即用适合于色谱柱储存并与所使用的流动相互溶的溶剂清洗，并完全置换掉原来所使用的流动相。（3）、样品：样品也要尽可能清洁，可选用样品过滤器或样品预处理柱（SPE）对样品进行预处理；若样品不便处理，要使用保护柱。在用正相色谱法分析样品时，所有的溶剂和样品应严格脱水。2、色谱柱的保存 （1）、反相色谱柱每天实验后的保养：使用缓冲液或含盐的流动相，实验完成后应用10%的甲醇/水冲洗30分钟，洗掉色谱

3、柱中的盐，再用甲醇冲洗30分钟。注意：不能用纯水冲洗柱子，应该在水中加入10%的甲醇，防止将填料冲塌陷。（2）、长期保存色谱柱：如色谱柱要长时间保存，必须存于合适的溶剂下。对于反相柱可以储存于纯甲醇或乙腈中，正相柱可以储存于严格脱水后的纯正己烷中，离子交换柱可以储存于水（含防腐剂叠氮化钠或柳硫汞）中，并将购买新色谱柱时附送的堵头堵上。储存的温度最好是室温。3、色谱柱的再生 因为色谱柱是消耗品，随着使用时间或进样次数的增加，会出现色谱峰高降低，峰宽加大或出现肩峰的现象，一般来说可能是柱效下降。（1）、反相柱的再生：依次采用20-30倍的色谱柱体积的甲醇：水=10：90 （V/V），乙腈，异丙醇作

4、为流动相冲洗色谱柱，完成后再以相反顺序冲洗色谱柱。（2）、正相柱的再生：依次以20-30倍色谱柱的体积的正己烷、异丙醇、二氯甲烷、甲醇作为流动相冲洗色谱柱，然后再以相反的顺序冲洗色谱柱。要注意上述溶剂必须严格脱水。4、色谱柱在使用过程中易出现的问题和解决办法 色谱柱在使用中最常见的问题就是柱压升高，如果柱压是在长时间使用过程中缓慢增加，属于正常现象。但柱压在使用过程中突然升高（系统管路堵塞及压力传感器故障除外），可能的原因有如下几点：（1）、色谱柱头的过滤筛板堵塞或污染；（2）、色谱柱头的填料被样品污染；（3）、色谱柱内缓冲液中的盐遇到高浓度的甲醇或其他有机溶剂，形成结晶析出；（4）、流动相P

5、H值过大或过小使固定相结构破坏或溶解。解决办法如下：（1）、如确定是色谱柱头的过滤筛板被污染，可以将色谱柱反方向用甲醇冲洗至正常压力，或者卸下色谱柱头，将其放在10的稀硝酸内超声清洗10分钟，后再用纯水超声10分钟，重新装入色谱柱。（2）、如确定色谱柱头的填料被污染，将柱头螺丝卸下，挖出柱内前段被污染的填料，用相同的柱填料重新填入，仔细修复后，重新安装上柱头螺丝。（3）、如确定定是盐结晶，用10%的甲醇/水冲洗色谱柱使柱内盐全部溶解，再换高浓度甲醇。（4）、如果因PH值使用不当，很难恢复。HPLC的故障及处理 一) 保留时间变化1.柱温变化 柱恒温2.等度与梯度间未能充分平衡 至少用10倍柱体

6、积的流动相平衡柱3.缓冲液容量不够 用25mmol/L的缓冲液4.柱污染 每天冲洗柱5.柱内条件变化 稳定进样条件,调节流动相6.柱快达到寿命 采用保护柱(二) 保留时间缩短1.流速增加 检查泵,重新设定流速2.样品超载 降低样品量3.键合相流失 流动相PH值保持在37.5检查柱的方向4.流动相组成变化 防止流动相蒸发或沉淀5.温度增加 柱恒温(三) 保留时间延长1.流速下降 管路泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡2.硅胶柱上活性点变化 用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化柱3.键合相流失 同前(二)34.流动相组成变化 同前(二)45.温度降低 同前(二)5(四) 出现肩峰或分叉1.样品

7、体积过大用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的15%2.样品溶剂过强采用较弱的样品溶剂3.柱塌陷或形成短路通道更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件4.柱内烧结不锈钢失效更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品5.进样器损坏更换进样器转子(五) 鬼峰1.进样阀残余峰每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗2.样品中未知物处理样品3.柱未平衡重新平衡柱,用流动相作样品溶剂 (尤其是离子对色谱)4.三氟乙酸(TFA)氧化(肽谱)每天新配,用抗氧化剂5.水污染(反相)通过变化平衡时间检查水质量，用HPLC级的水(六) 基线噪声1.气泡(尖锐峰)流动相脱气,加柱后背压2.污染(随机噪声)清洗柱,净化样品,用H

8、PLC级试剂3.检测器灯连续噪声更换氘灯4.电干扰(偶然噪声)采用稳压电源,检查干扰的来源(如水浴等)5.检测器中有气泡流动相脱气,加柱后背压(七) 峰拖尾1.柱超载降低样品量,增加柱直径采用较高容量的固定相2.峰干扰清洁样品,调整流动相3.硅羟基作用加三乙胺,用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相PH值,钝化样品4.同前(四)4同前(四)45.同前(四)35.同前(四)36.死体积或柱外体积过大连接点降至最低,对所有连接点作合适调整,尽可能采用细内径的连接管7.柱效下降用较低腐蚀条件,更换柱,采用保护柱(八) 峰展宽1.进样体积过大同(四)12.在进样阀中造成峰扩展进样前后排出气泡以降低

9、扩散3.数据系统采样速率太慢设定速率应是每峰大于10点4.检测器时间常数过大设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的10%5.流动相粘度过高增加柱温,采用低粘度流动相6.检测池体积过大用小体积池,卸下热交换器7.保留时间过长等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱8.柱外体积过大将连接管径和连接管长度降至最小9.样品过载进小浓度小体积样品液相色谱仪(hplc)的保养 1HPLC的日常操作条件： 温度：1030； 相对湿度80； 最好是恒温、恒湿，远离高电干扰、高振动设备。 2泵的保养： 1)使用流动相尽量要清洁； 2)进液处的沙芯过滤头要经常清洗； 3)流动相交换时要防止沉淀； 4)避免泵内堵塞或有气泡; 3进样器的保养： 1)每次分析结束后，要反复冲洗进样口，防止样品的交叉污染； 4柱的保养： 1)柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动； 2)当柱子和色谱仪联结时， 阀件或管路一定要清洗干净； 3)要注意流动相的脱气； 4)避免使用高粘度的溶剂作为流动相； 5)进样样品要提纯； 6)严格控制进