分子生物学遗传病基因诊断和治疗

1、分子生物学讨论三之 遗传病的诊断与肿瘤基因治疗 遗传病的基因诊断遗传病的基因诊断 一、什么是遗传病一、什么是遗传病 遗传病是指完全或部分由遗传因素决定的疾病，常为先天性的，也 可后天发病。 遗传病的类型遗传病的类型 1、染色体病或染色体综合征：遗传物质的改变在染色体水平上 可见，表现为数目或结构上的改变。 2、单基因病：指一对等位基因的突变导致的疾病，分别由显性 基因和隐性基因突变所致。 3、多基因病：涉及多个基因起作用，与单基因病不同的是这些 基因没有显性和隐性的关系，每个基因只有微效累加的作用， 因此同样的病不同的人由于可能涉及的致病基因数目上的不同， 其病情严重程度、复发风险均可有明显的

2、不同，且表现出家族 聚集现象，环境的影响较为显著。 二、基因诊断二、基因诊断 1.基因诊断概念 2.基因诊断特点 3. 基因诊断应用范围 4、基因诊断的发展过程 5、基因诊断遇到的问题 6、遗传病基因诊断的注意事项 基因诊断定义基因诊断定义 某些受精卵或母体受到环境或遗传等的影响，引起的下一代基因组发生了有害改 变，产生了疾病，为了有针对性的解决和预防，故需要通过实验室的基因诊断、 基因分析才能得到确认。又称DNA诊断或分子诊断。 基因诊断的特点基因诊断的特点 高特异性 高灵敏度 早期诊断性 应用广泛性 基因诊断应用范围基因诊断应用范围 1.检测病原生物的侵入，如肝炎、艾滋病等 2.诊断先天遗

3、传性疾患，产前诊断优生学 3.检测后天基因突变引起的疾病，如肿瘤 4.其他比如亲子鉴定，法医物证 基因诊断的发展过程基因诊断的发展过程 1976年美籍华裔科学家简悦威应用液相DNA分子杂交技术成功地进行了镰形细胞 贫血症的基因诊断 标志着人类遗传性疾病诊断开始进入基因诊断的新时代 发展过程发展过程 1、利用连锁分析和关联分析定位遗传病致病基因； 2、利用分子杂交技术进行遗传病的基因诊断； 3、利用PCR技术进行遗传病的基因诊断； 4、基因芯片用于基因诊断； 5、利用外显子组捕获技术诊断单基因遗传病； 6、利用全基因组（GWAS）关联分析定位及诊断多基因遗 传病易感基因 相关问题相关问题 1、标

4、准化问题：缺乏标准化的操作规程以及质量认证体系。各医疗机构的操作方法不统一，质量难保证； 2、伦理学问题； 3、所用资源及信息安全问题 需要相对明确临床诊断 需要及时向患者及其家属说明基因诊断的重要性，以 启发上述成员的理解与主动性 需要在基因诊断中建立家系观点 需要注意基因诊断中的伦理问题 需要正确理解基因诊断报告 需要充分理解产前基因诊断的风险 遗传病的基因诊断的注意事项 三、基因诊断方法三、基因诊断方法 1.核酸分子杂交 2.聚合酶链反应 3.单链构象多态性分析 4.限制性片段长度多态性连锁分析 5.DNA序列测定 6.单核苷酸多态性和全基因组关联分析 7.生物芯片 8.WESTERN免

5、疫印迹 9.环介导等温核酸扩增技术 10.免疫组织化学诊断 11.外显子组捕获技术 3.3.单链构象多态性单链构象多态性 单链DNA呈现一种由内部分子相互作用形成的三维构象，这种构象由碱基顺序决定。碱基变异则构象改 变。而构象影响了DNA在非变性凝胶中的迁移率。相同长度但不同核苷酸序列的DNA由于在凝胶中的不同 迁移率而被分离。迁移率不同的条带可被银染或者荧光标记引物检测，然后用DNA自动测序进行分析。 4.4.限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性 该技术是利用限制性内切酶能识别DNA分子的特异序列，并 在特定序列处切开DNA分子，即产生限制性片段的特性。 如果重排、缺失或者核苷酸置换使内

6、切酶识别序列变成了不 能识别序列或是这种差别使本来不是内切酶识别位点的DNA序 列变成了内切酶识别位点。这样就导致了用限制性内切酶酶切 该DNA序列时，就会少一个或多一个酶切位点，结果产生少一 个或多一个的酶切片段。这样就形成了用同一种限制性内切酶 切割不同物种DNA序列时，产生不同长度大小、不同数量的限 制性酶切片段这种变化即可作为诊断指标。 6.6.单核苷酸多态性和全基因组关联分析单核苷酸多态性和全基因组关联分析 单核苷酸多态性： 主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。 7.7.生物芯片生物芯片 又称为基因芯片又称为基因芯片(gene chip)(gene ch

7、ip)、DNADNA微阵列微阵列(DNA microarray)(DNA microarray) DNA DNA芯片技术基础是核酸分子杂交芯片技术基础是核酸分子杂交 应用微电子加工工艺，在玻璃、塑料、硅片等材 料上制备用于生物样品分离、反应或分析的微细结构 目前主要有两大类： 1. 生物活性微阵列 (bioactive microarray) 2. 基因芯片 (gene chip), DNA微阵列 (DNA microarray) 包括多肽、蛋白质、病毒、 细胞等。 蛋白质芯片可直接从体液中检测生物分子（免疫芯 片只需少量样品可一次完成对成千上万种抗原或抗 体等致病因素或生物样品的检测分析)。

8、为最重要的生物芯片，广泛用于基因表达谱分析、 新基因发现、基因突变及多态性分析、疾病诊断、 药物筛选、基因测序等。 9.环介导等温核酸扩增技术 其特点是针对靶基因的6 个区域设计4 种特异引物,利用一种链置换DNA 聚合酶(Bst DNA polymerase) 在等温条件(65 左右) 保温几十分钟,即可完 成核酸扩增反应 10.免疫组织化学诊断 对于某些基因表达水平发生改变的疾病可以采取免疫组织化学方法进行诊 断，优点是在不改变细胞结构的情况下，对基因表达终产物蛋白质水平及细 胞中的部位进行分析 外显子捕获(exon trapping) 是构建一种载体，从其插入片段中识别和回收外显子 序列

9、，从而克隆目的基因。 遗传病的基因诊断遗传病的基因诊断 典型案例 主要内容 甲型血友病 脆性X染色体综合征 成年型多囊肾病 DMD/BMD的缺失型 脊髓小脑性共济失调 甲型血友病甲型血友病 血友病为一组遗传性凝血功能障碍的出血 性疾病。其共同的特征是活性凝血活酶生 成障碍，凝血时间延长，终身具有轻微创 伤后出血倾向，重症患者没有明显外伤也 可发生“自发性”出血。 血友病可分为甲型、乙型、丙型和血管性 假血友病4种。其中甲型发病率占人类先天 性血液系统疾病的85%。甲型血友病，即 因子促凝成分（：C）缺乏症，也称 AGH缺乏症，是一种性联隐性遗传疾病， 女性传递，男性发病。 甲型血友病的基因诊断

10、主要鉴定患者家系 中的携带者或对未出生的胎儿进行产前诊 断。 甲型血友病的基因诊断 1. 1.F 基因到位的DNA印记分析： 1）将基因组用限制性内切核酸酶消化 2）用特异探针杂交，放射自显影分析 2. F 基因突变直接检测： 1）依赖于F 基因内或旁侧的多态性的连锁分析 2）RFLP连锁分析 3）VNTR分析 4）STR连锁分析 对于甲型血友病进行基因诊断首先寻找有无基因到位，其次利用基因内 的遗传标志进行连锁分析，最后采用PCRSSCP或PCRDGGE分析。 脆性X染色体综合征 脆性X染色体综合征导致患者 智障（Martin-Bell综合征）， 脆性X综合症是由于在人体内X 染色体的形成过

11、程中的突变所 导致。在X染色体的一段DNA， 由于遗传的关系有时会发生改 变。一种为完全改变，另一种 为DNA过度甲基化。如果这两 种改变的程度较小，那么患者 在临床表现方面可以没有特殊 的症状或者只有轻微的症状。 反之，如果这两种改变的程度 较大，就可能出现如下所述的 脆性X综合症的种种症状。 脆性X染色体综合征基因诊断 常用的方法： （1）PCRASO （2）DNA连锁链分析 （3）Southern印迹杂交法 （4）PCR扩增 成年型多囊肾病 成年型多囊肾病是一种常染色体显性遗传病，发病 率高，约1000人中有1名致病基因的携带者，起病较晚， 多在30岁以后，主要为肾和肝中出现多发性囊肿，

12、临床 表现为腰疼、蛋白尿、血尿、高血压、肾盂肾炎、肾结 石等，最终可导致肾功能衰竭和尿毒症。 诊断：本病基因定位在16p13，与珠蛋白基因3端 相邻，但致病基因尚未克隆，基因产物的生化性质和疾 病发病机理也尚未阐明。因此，只能用连锁分析来进行 基因的发病前诊断和产前诊断。由于通过家系分析，已 证实APKD的致病基因与珠蛋白基因3端附近的一段 小卫星DNA序列即3HVR(3 hypervariable region)紧 密连锁，而后者在人群中具有高度多态性，因此可以通 过RFLP连锁分析进行诊断。 DMD/BMD的缺失型 DMD/BMD是一种连锁隐性遗传的神经肌肉系统 受累的致死性遗传病。DMD

13、/BMD有70%左右为缺失型。 诊断：此基因很大，缺失可发生在不同部位，因此应 尽可能采用多对引物作PCR扩增（多重PCR）来检测。 如扩增产物电泳后发现有带纹的缺失，即可作出诊断并 对缺失定位（图139），在进行产前诊断时，一般可 先通过检测家系中有关成员，即确定先证者的缺失区， 然后有针对性地作PCR扩增，包括缺失部分的两端，以 判断胎儿或有关患儿是否也获得了相同的基因缺失，但 非缺失型不能用此法查出。 脊髓小脑性共济失调 脊髓小脑性共济失调是以小脑性共济失调为主要症状 的常染色体显性遗传性疾病，病理改变以小脑、脊髓、 脑干变性为主，临床主要特征为小脑性共济失调，可伴 有构音障碍、震颤、锥

14、体束征以及痴呆等。 诊断：依据神经系统临床检查的程序来判断患者是否 存在小脑及脊髓神经失调的临床体征，然后会查问他的 家族史（包括已故的亲人），最后结合磁共振（MRI） 及基因测试，排除其他累及小脑和脑干的变性病，才能 判断患者是否患上脊髓小脑性共济失调。 遗传病的基因诊断遗传病的基因诊断 以血红蛋白病为例 血红蛋白病 血红蛋白病（hemoglobinopathy）是由于血红蛋白分子结构异常（异常血红蛋白病），或珠蛋白肽链合 成速率异常（珠蛋白生成障碍性贫血，又称海洋性贫血）所引起的一组遗传性血液病。 临床可表现溶血性贫血、高铁血红蛋白血症或因血红蛋白氧亲和力增高或减低而引起组织缺氧或代偿性红

15、 细胞增多所致紫绀。 异常血红蛋白病 镰刀状红细胞贫血（Hbs） 不稳定血红蛋白病（unstable hemoglobinpathies） 血红蛋白M病（HbM） 氧亲和力改变的血红蛋白病 地中海贫血 地中海贫血（-thalassemia,简称地贫） 地中海贫血（梩halassemia,简称地贫） 镰刀状红细胞贫血（Hbs） 异常血红蛋白链的第6位谷氨酸被缬氨酸所代替。这个疏水氨基酸正好适合另一血红蛋白分子链EF角上 的“口袋”，这使两条血红蛋白链互相“锁”在一起，最终与其他血红蛋白链共同形成一个不溶的长柱形 螺旋纤维束，使红细胞扭旋成镰刀形。 诊断方法 镰刀形细胞性贫血症的基因诊断可采用PC

16、R-限制性内切酶谱分析法。 先用PCR从患者基因组DNA扩增含突变位点的珠蛋白基因片段。 再选择适当的限制性内切酶水解PCR产物,根据酶切产物在电泳图谱上的片段数量和大小做出判断.也可与特 意的寡核苷酸探针进行Southern印记杂交分析,根据杂交图谱做出判断. 限制性内切酶 采集制备血液DNA 内切酶Mst消化 电泳 转膜 P32标记的珠蛋白cDNA杂交 放射自显影 PCR/限制性内切酶 设计引物 PCR扩增 产物进行限制性内切酶酶切 电泳 EB染色 直接观察 地中海贫血 地中海贫血(-mediterranean anemia)是指 链的合成受部分或完全抑制的一组血红蛋白病。 患儿出生时无症

17、状，多于婴儿期发病，生后36 个月内发病者占50%，偶有新生儿期发病者。发病年龄愈 早，病情愈重。严重的慢性进行性贫血，需依靠输血维持生命，34 周输血1 次，随年龄增长日益明显。 地中海贫血基因诊断 PCR/ASO斑点杂交法 合成两对PCR引物 合成等位特异寡核苷酸探针 制备DNA样品 PCR扩增 斑点印迹杂交 RFLP分析法 肿瘤基因治疗肿瘤基因治疗 基本策略和常用方法基本策略和常用方法 基本策略 (一)治疗性基因的获得 (二)基因载体的选择 (三)靶细胞的选择 (四)基因转移方法 (五)转导细胞的选择鉴定 (六)回输体内 （一）目的基因的选择和制备 基因治疗的首要问题是选择用于治疗疾病的

18、目的基因。 要求：在体内仅有少量的表达就可显著改善症状；该基因的过 高表达不会对机体造成危害。 在抗病毒和病原体的基因治疗中。所选择的靶基因应在病毒和 病原体的生活史和起重要的作用并且该序列是特异的。 制备目的基因：正向表达的基因可以是cDNA（complementary DNA），也可是基因组DNA(genomic DNA)片段。可用传统的方法（ 人工合成）获取，也可采用多聚酶链式反应(polymerase chain reaction PCR)等新技术进行体外扩增。部分反义基因也可采用此法 获得，但多数情况下采用人工合成的方式制备。 （二）基因的转运 目前已有多种基因转运的方式，其基本原则

19、是将外源基因运到细胞 内。已使用的有病毒载体和非病毒载体两大类。 病毒载体： 病毒具有一些独特的性质如多数病毒可感染特异的细胞，在细胞内不易降解；RNA病毒 能整合到染色体以及基因水平较高等。因此病毒载体是良好的基因转运载体。目前已被用 作载体的病毒有逆转录病毒、腺病毒、腺相关的病毒。疱疹病毒和肝炎病毒等。 【逆转录病毒用作载体时需进行几步改造 （1）将天然的野生型RNA前病毒转变成DNA载体，并插入欲转移的相关外源基因。其基 本原则是用标记基因和外源基因替代病毒的编码基因示。 （2）制备辅助细胞为载体DNA提供其丧失的功能。 （3）将载体DNA导入辅助以产生病毒载体。 （4）病毒载体感染靶细

20、胞，外源基因在细胞内得以表达。】 非病毒载体： 这类载体的发展较快，目前主要是脂质体， 载体优点缺点 逆转录病素毒 基因组小并且简单 可稳定整合于宿主基因组 生物学特性清楚 可高效转入复制中的细胞 对宿主细胞无害 仅感染分裂细胞 随机整合（可能导致突 变） 常常只有短暂表达 病毒滴度低（107pfu/ml） 可能会与有复制能务的 病毒重组插入容量有限 （10kb） 腺相关病毒 基因组小（5kb） 可特异整合于人19号染色体 以人细胞作为宿主 无毒、无致病性 尚未研究清楚 需腺病毒辅助复制 携带外源基因能力有限 （4kb） 难得到高滴度病毒 常见基因转运载体的优缺点 腺病毒 适于原位使用，尤其是

21、肺 (在不分裂细胞中可进行高效率的体内 感染) 病毒滴度高（1010pfu/ml） 生物学特性清楚 不与宿主基因组整合(只有短 暂表达) 载本基因组复杂 病毒蛋白可能引起免疫反应及 炎症反应 插入外源基因能力有限（7- 8kb） 脂质体 无感染能力 理论上无DNA大小限制 毒性低 无特异性靶细胞 转染效率低 仅有短暂表达 体内应用困难 受体介导的转运 无感染能力 特异性转染靶细胞 理论上无DNA大小限制 构建灵活 转染效率低 体内应用困难 可能有免疫原性 只有短暂表达 （三）靶细胞的选择 理论上讲，无论何种细胞均具有接受外源DNA的能力，目前基因治疗中禁 止使用生殖细胞作为靶细胞，而只能使用体

22、细胞，用于转基因的体细胞必须取材 方便，含量丰富，容易培养，寿命较长。可选择的细胞有淋巴细胞、造血细胞、 上皮细胞、角质细胞、内皮细胞、成纤维细胞、肝细胞、肌肉细胞和肿瘤细胞等 。在实际上应用中应具体根据目的条件选择。 （四）细胞转染 这是将外源性基因导入 细胞内的一种专门技术。随 着基因与蛋白功能研究的深 入，转染目前已成为实验室 工作中经常涉及的基本方法。 转染大致可分为物理介导、 化学介导和生物介导三类途 径。电穿孔法、显微注射和 基因枪属于通过物理方法将 基因导入细胞的范例；化学 介导方法很多，如经典的磷 酸钙共沉淀法、脂质体转染 方法、和多种阳离子物质介 导的技术；生物介导方法， 有

23、较为原始的原生质体转染， 和现在比较多见的各种病毒 介导的转染技术。 名称机制转染效率用途优缺点影响因素 磷酸钙转染法内吞作用 20%细胞被转 染 瞬时表达 1、简单有效 2、 适用于贴壁、 非贴壁细胞 3、常作首选 方法 1、Ca2+，DNA浓 度 2、PH值，沉 淀反应时间 3、氯喹，甘油 和丁酸钠处理 DEAE葡聚糖转 染法 抑制核酸酶 内 吞作用 在BDC-1，CV-1 和COS细胞中 较高 瞬时表达操作简单 1、需高浓度DNa 2、DEAE葡聚糖 浓度 3、温育时间 Poly-brene转染 法 不清楚 低分子量DNA 转染率高于磷 酸钙法 CHO细胞的稳 定转化子 能得到较多的 稳

24、定转化子 1、受体细胞类 型 2、转染调控 信号 3、DNA浓度 原生质体融合胞膜融合 50-100%转染， 稳定子得率为 0.2-0.02% 瞬时表达 稳定表达 1、操作复杂 2、不 能进行共转染 3、慎用于筛选营养 缺陷型变异株 1、溶菌酶、PEG 浓度 2、温育时 间 电穿孔 高压在膜上 形成微孔 效率较高 瞬时表达 稳定转化 1、需精密仪器 2、 可用于动物、植物 细胞和细菌 1、电场强度 2、 脉冲长度 3、温度，DNA浓 度 4、培养液 脂质体脂膜融合50-60%转染 瞬时表达 稳定转化 1、操作简单 2、可 用于体内试验 1、脂质体质量 2、 DNA浓度 胞核微注射法直接注射50

25、-100%转染稳定转化 1、需要特殊仪器 2、处理样品数量少 3、高效 1、注射技术 2、 DNA浓度 （五）外源基因的表达及检测 在筛选出转化分子后还需要鉴定转导细胞中外源基因的表达 状况。其中包括对目的基因和标记基因表达的鉴定。常用方法有原 位杂交，Northrn杂交，NRA打点杂交，免疫组织化学染色等，前 几项是检测外源基因转录出的mRNA，后者则是检测外源基因翻译 出的蛋白质。 常用方法 补偿性基因治疗 补偿性基因治疗是指向缺失某种抑癌 基因的细胞内导入正常的抑癌基因，逆 转肿瘤细胞的表型、抑制细胞增殖、诱 导细胞凋亡，以达到治疗目的。 用基因替代等方法可恢复和增强肿瘤 抑制基因的功能

26、，如将克隆的抑癌基因 Rb、p53、p16等导人肿瘤细胞，可以逆 转其恶性行为，诱导细胞凋亡。 但是由于肿瘤发生、发展的机制十分 复杂，涉及多种癌基因和抑癌基因的多 步骤改变，因而难以通过拮抗某一种癌 基因完全控制肿瘤的恶性行为。 抗肿瘤血管形成基因治疗 肿瘤的生长、转移与新生血管的形成密切相关，因此抗血管形 成基因治疗是非常有潜力控制肿瘤生长的治疗方法。抗肿瘤血管形 成基因治疗的研究主要包括：针对血管形成生长因子及其受体的基 因治疗，血管形成抑制因子基因治疗，针对肿瘤血管内皮细胞的自 杀基因治疗等。 肿瘤耐药基因治疗 即化疗保护性基因治疗，是指化疗前 向骨髓内导入耐药基 因，保护骨髓细胞不

27、受抗肿瘤药物的损害。 有实验表明，将药物剂量提高510 倍可以克服肿瘤细胞的抗药性，但大剂量 化疗对人体正常组织及造血系统的损害较 重，限制了化学药物的用量。 多耐药基因 (MDRl)编码P糖蛋白的跨膜蛋 白，它有抗肿瘤药物位点和 ATP位点2个结合 位点，通过ATP供能可将细胞内药物泵出 从而 保护正常细胞免受药物损害。 目前，肿瘤耐药基因治疗的方案是转 入 MDRI基因、DHFR基因、MGMT基因等，或 者联合使用2 种或多种耐药基因转入造血干细 胞，使造血干细胞获得广谱抗 药性。 自杀基因疗法 自杀基因疗法又称为病毒导向的酶解 前药疗法 其原理是将一些病毒或细菌基因组中 的前 药转换酶基

28、因（也叫自杀基因)导入肿 瘤细胞，该基因 编码特殊的酶可将原先对 高等动物无毒性的前药在 肿瘤细胞中代谢 为毒性产物，从而引起这些细胞自 杀。 其作用是：促进免 疫效应细胞的分化 增殖、加强对肿瘤的杀伤力；直接杀伤癌 细 胞；增加肿瘤细胞的免疫原性。 基因联合治疗 由于肿瘤是多因素、多环节、多阶段 的复杂疾病，依靠单一 方法并不能达到理 想的抗肿瘤效果，因此多种治疗联合、针 对 肿瘤的不同特征进行治疗已经成为基因 治疗发展的一个趋势。 促细胞凋亡的基因疗法促细胞凋亡的基因疗法 定义： 通过人为手段改变肿瘤细胞的某些相关基因来使其尽 早启动凋亡程序，达到消灭肿瘤细胞的目的。 分类：促细胞凋亡的基

29、因治疗主要包括通过反义核酸 技术抑制凋亡抑制基因以及向癌细胞导入凋亡活化基 因两种方式。 一、通过反义核酸技术抑制凋亡抑制基因： Tietze用表达核转录因子的抑制子封闭KappaB的活性， 使TNh介导的凋亡明显增加。 由于Survivin是凋亡抑制剂，可用其反义基因腺病毒 载体治疗直肠癌模型，使癌细胞凋亡明显增加，并使 化疗药物敏感性上升 促细胞凋亡的基因疗法促细胞凋亡的基因疗法 向癌细胞导入凋亡活化基因： 1. 还有研究将VEGFR 2细胞外区、跨膜区与Fas受 体的胞质区联合在一起形成复合受体VEGFR2 Fas，作为VEGF触发的死亡受体，用VEGF治疗 可迅速导致细胞凋亡，VEGF

30、R2 Fas可有效地将 VEGF的作用逆转，发挥抗肿瘤的作用。 2. Fas和TNF均可诱导凋亡，用腺病毒载体输送 Fas配体GFP融合蛋白和TNF凋亡相关诱导配体 转染脑膜瘤细胞可使凋亡水平明显升高。 3. 还有其他利用端粒酶、IFN7、p53、IL24基因 等进行的诱发凋亡的治疗。 抑制细胞信号传导道路抑制细胞信号传导道路 定义： 抑制细胞信号传导道路通过抑制细胞信号传 导道路可抑制肿瘤细胞的增殖。 信号传导道路中酪氨酸激酶与肿瘤的发生、 发展有关，主要有EG-FR、VEGFR、DDGFR、Scr、 Bcr、Abl等。 如：Kim等采用表达c met核酶的腺病毒载体 转染前列腺癌细胞时发现，Scr激酶活性明显下降， 并认为靶向C met信号通路的治疗对于控制前列腺 癌生长和转移有重要意义。 还有研究采用EGFR反义RNA治疗胶质瘤也取得 明显疗效。 Bookout等