粉防己碱干预大鼠急性缺血再灌注肾损伤中的细胞凋亡变化.

1、粉防己碱干预大鼠急性缺血再灌注 肾 损伤中的细胞凋亡变化由于急性缺血 - 再灌注肾损伤时组织细胞凋亡明显增多，国外一些学者 已经开始使用某些药物抑制细胞凋亡水平以减轻组织损伤 Am J Physiol,1996,271:F477 。中药粉防己碱是一种传统利水渗湿药，对急性缺血 性再灌注肾损伤有保护性作用南京医科大学学报，1998，18：5，然而有关该药在急性缺血再灌注肾损伤中的作用以及与细胞凋亡关系的研究至今尚未见 报道。为此，我们制备了急性缺血再灌注肾损伤的模型，采用肾组织光镜检 查、DNA片段分析及原位末端转移酶标记（TUNEL等技术，以探讨粉防己碱干预 急性缺血 - 再灌注肾损伤过程中细

2、胞凋亡的变化。一、材料与方法1. 动物分组与处理：雄性SD大鼠，随机分为用药与对照组，钳夹大鼠双侧 肾蒂 45分钟制备肾缺血动物模型，按不同再灌注时间 （12、 24、 48和 72小时） 再分为四组。分别于模型制备术前 30 分钟及制备后 4、 22、 46、 70 小时灌胃药 液粉防己碱（以pH 7.4磷酸盐缓冲液新鲜配制，浓度 20 mg/ml），对照组以磷 酸盐缓冲液 0.3 ml/100g 替代。分别于各时间段宰杀大鼠留取肾脏标本。一部分4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，用做 TUNEL标记及HE染色。另一部分用于肾 组织DNA片断分析。2. 方法：采用TUNEL法定量分析肾组织细胞凋亡，

3、按 BoehringerMannheim公司In Situ Cell Detection Kit,AP,试剂盒方法进行，并在计算机像分析系统的高倍视野（X 400）下，每片随机取10个视野，计数所有阳性显色 的细胞核。同时设立阳性对照（标记前DNA酶处理）、阴性对照组（标记液中只含 dNTP标记缓冲液而不加TdT酶溶液）。肾细胞DNA片段分析则采用琼脂糖凝胶 电泳法。组织学变化观察：取HE切片在计算机像分析系统的高倍视野（X 400） 下，随机观察病变最明显的皮髓交界处 100个肾小管的组织形态，并计数其中 损伤肾小管数。二、结果1. 肾组织DNA片段分析：缺血再灌注后肾组织 DNA的电泳呈现

4、180 bp及其 倍体的梯形条带。2. 组织学的观察结果：病变肾组织可见肾小管上皮细胞核固缩、核碎裂、 核贴膜、核消失；细胞浆浓缩、染色嗜酸性增强；细胞分解为数块；部分肾小 管轮廓结构消失，有些管腔内蛋白管型形成等，但无炎症细胞浸润现象。各组 大鼠肾小管的损伤程度见表 1。表 1 用药组与对照组皮髓交界损伤肾小管数的比较 （s）再灌注时间用药组对照组P值12小时37.67 11.02(6)59.33 2.94(6)v 0.00524小时33.33 6.62(6)49.83 9.37(6)v 0.0148小时15.17 3.49(6)27.67 2.88(6)v 0.00172小时4.67 1.

5、15(3)11.67 2.89(3)v 0.05注：括号内为大鼠数3.TUNEL实验结果：见表 2表2用药组、对照组、正常组大鼠肾小管细胞凋亡水平 (个/视野)的比较( s)再灌注时 间正常组对照组用药组3.67 0.72(3)12小时24.45 2.81(6) *16.88 0.56(6) 24小时20.45 1.38(6) *14.32 1.78(6) 48小时13.80 1.37(6) *9.12 1.03(6) 72小时9.50 0.79(3) *5.67 0.68(3) 括号内为每组大鼠数；与正常组比，* P v0.001 ;与对照组比， P v0.005 , P v 0.001三、

6、讨论近年来，细胞凋亡在急性缺血-再灌注肾损伤病理生理中的作用已经引起了肾脏病学术界的极大关注。中药粉防己碱对急性缺血再灌注肾损伤 的保护性作用，能够明显降低血清肌酐和尿素氮水平，改善肾小球滤过率与肾 血浆流量。我们采用钳夹大鼠双侧肾蒂45分钟，制备了缺血再灌注肾损伤模型，从肾组织HE染色切片中观察到，急性缺血再灌注肾损伤时肾小管损伤以皮 髓交界处最为明显；粉防己碱用药组肾小管损伤程度明显低于对照组，从形态 学角度证实了中药粉防己碱对于急性缺血再灌注肾损伤的保护性作用。同时， 肾组织HE染色切片中观察到的受损肾小管上皮细胞形态学变化与Gobe G等New con cept and therape

7、utic strategies.New York:ChurchillLivi ngsto ne Press,1995:143描述的细胞凋亡的形态学特征相一致，因而提示，细胞凋亡是缺血再灌注肾损伤时细胞死亡的形式。进一步采用TUNE法定量分析肾小管的细胞凋亡水平，结果表明正常大鼠肾组织细胞凋亡水平很低， 缺血再灌注1272小时各时相凋亡细胞均显著增多(P均v 0.001)，而用药组 肾小管上皮细胞凋亡水平却明显低于对照组 (P均v 0.005)，因而提示粉防己碱 在急性缺血性肾损伤过程中可通过降低肾小管上皮细胞凋亡，达到减轻肾组织 细胞损伤、促进肾组织修复的作用。肾组织 DNA片段分析则发现，正常大鼠肾 组织并不出现DNA弟形，而缺血再灌注后肾组织出现了特征性的 DNA弟形格 局。有关粉防已碱减少肾