2.高分子材料在肿瘤治疗中的应用-段友容剖析

1、高分子材料在肿瘤治疗中的应用第一节 概述在药物制剂领域中，高分子材料的应用具有久远的历史。人类从远古时代在谋求生存和与疾病斗争的过程中，广泛地利用天然的动植物来源的高分子材料，如淀粉、多糖、蛋白质、胶质等作为传统药物制剂的黏合剂、赋形剂、助悬剂、乳化剂。上世纪30年代以后，合成的高分子材料大量涌现，在药物制剂的研究和生产中的应用日益广泛。可以说任何一种剂型都需要利用高分子材料，而每一种适宜的高分子材料的应用都使制剂的内在质量或外在质量 得到提高。上世纪六十年代开始，大量新型高分子材料进入药剂领域，推动了药物缓控释剂型 的发展这些高分子材料以不同方式组合到制剂中，起到控制药物的释放速率 ，释放时

2、间以及释放部位的作用。随着众多不同作用机制的抗肿瘤药物的发现和肿瘤治疗技术的发展需求，抗肿瘤药物的缓控释给药系统以及靶向给药系统越来越成为药物制剂研究的热点课题。根据肿瘤发生和发展过程的生物学特征，研究者提出了不同的肿瘤靶向给药策略，如利用通透性增强与滞留 （EPR）效应、单抗识别、受体介导、血管生成机制等；许多新的高分子材料和给药载体已应用于抗肿瘤药物靶向给药系统的研究之中，其中代表性的给药系统有脂质体、纳米粒、微粒、纳米乳、聚合物胶束等。本章节参考某些期刊文献的基础上主要讨论高分子材料作为抗肿瘤 药物的缓释控释以及靶向肿瘤给药载体的新进展。药物（基因）给药系统图1给药途径（方式）第二节 高

3、分子材料在缓控释抗癌给药系统中的应用在缓控释制剂中， 高分子材料几乎成了药物在传递、 渗透过程中的不可分割的组成部分。 一种新辅料的应用， 可开发出一大批制剂产品， 并促进一大批制剂产品的质量提高， 取得十 分显著的经济效益和社会效应。 缓控释制剂作用机理有多种， 制备工艺也千差万别， 因此有 多种不同的分类方法。粗略说来，有下列几类：一、贮库型（膜控制型） 控释制剂该类制剂是在药库外周包裹有控制释药速度的高分子膜的一类剂型,根据需要 ,可以制备成多层型 ,圆筒型 ,球型或片型的不同形式 ,并有相应的制备方法。（一）微孔膜控释系统在药物片芯或丸芯上包衣，包衣材料为水不溶性的膜材料（如EC、丙烯

4、酸树脂等）与水溶性致孔剂（如聚乙二醇、羟丙基纤维素、聚维酮）的混合物。制剂进入胃肠道后，包衣 膜中水溶性致孔剂被胃肠液溶解而形成微孔。 胃肠液通过这些微孔渗入药芯使药物溶解， 被 溶解的药物溶液经膜孔释放。药物的释放速度可以通过改变水溶性致孔剂的用量来调节。（二）致密膜控释系统 这种膜不溶于水和胃肠液，但水能通过。胃肠液渗透进入释药系统，药物溶解，通过扩散作用通过控释膜释放。 药物的释放速度由膜材料的渗透性决定， 选用不同渗透性能的膜材 料及其混合物，可调节释药速度达到设计要求。常用膜材料有EC,丙烯酸树脂RL、RS型、醋酸纤维素等。（三）肠溶性膜控释系统 这种膜材料不溶于胃液,只溶于肠液,如

5、肠溶性丙烯酸树脂,羟丙甲纤维素酞酸酯等。为了达到缓控释目的，这类膜材常常与其它成膜材料混合使用，如不溶性的EC，水溶性的HPMC 等。在胃中药物释放很少或不释放,进入小肠后,肠溶材料溶解,形成膜孔,药物 可通过膜孔的扩散作用从释药系统释放。 药物的释放速度可通过调节肠溶性材料的用量加以 控制。如采用丙烯酸树脂肠溶H号、HPMC、EC等不同配比，制成的硫酸锌包衣颗粒，其体外释放时间可达 24 小时。二、骨架型（基质型）控释制剂该类制剂制备简单 ,不需控释膜 ,将药物直接分散在高分子材料形成的骨架中,药物释放速度取决于骨架材料的类型和药物在该材料中的扩散速度。 如以 PVA 和 PVP 为骨架的硝

6、酸甘 油贴膏， 以 HPMC 为骨架材料的各种缓释片剂、以 HPC/Carbopol 为粘附材料的黏膜粘附制 剂等。（一）不溶性骨架缓控释系统 采用无毒塑料如无毒聚氯乙烯、聚乙烯、聚氧硅烷等作为骨架基质材料，加入药物，再 用丙酮等有机溶剂为润湿剂制成软材，制粒， 压片。 这些材料口服后不被机体吸收， 无变化 地从粪便排出。 应用这类材料制成的释药系统一般适合于水溶性药物。 如国外有用聚氯乙烯 制成的硝酸异山梨酯、硫酸奎尼丁控释片上市。（二）亲水凝胶骨架缓控释系统采用亲水性高分子材料为片剂的主要辅料， 如甲基纤维素、 羟丙甲纤维素 （K4M ，K15M 、 K100M ）、Carbopol ，海

7、藻酸钠， 甲壳素等， 这些材料的特点是遇水以后经水合作用而膨胀， 在释药系统周围形成一层稠厚的凝胶屏障， 药物可以通过扩散作用通过凝胶屏障而释放， 释 放速度因凝胶屏障的作用而被延缓。 材料的亲水能力是控制药物释放的主要因素。 有报道研 制了一种双氯芬酸钾水凝胶骨架缓释片， 它以羟丙甲纤维素 （ HPMCK4M ）为主要骨架材料， 并辅以其它阻滞剂， 以调节释药速度。可供选择的疏水性阻滞剂有乙基纤维素、硬脂酸，肠 溶性丙烯酸树脂等。 为达到适宜的释药速度， 还可加入亲水性的材料作填充剂或致孔剂， 如 乳糖、微晶纤维素、聚维酮（PVP）。以上材料中若再加入一些蜡类和脂肪酸酯类，制成的 片剂比重小

8、于 1，服用后可在胃液或食糜中飘浮较长时间，有利于药物持久释放。一些主要 在胃内吸收或主要在胃中发挥治疗作用的药物制剂 （如抗幽门螺旋杆菌的抗生素） ，可考虑 制成胃内飘浮片。（三）溶蚀性骨架缓控释系统 这类骨架材料多采用脂肪和蜡类物质如蜂蜡、硬脂酸丁酯等。口服后，固体脂肪或蜡在 体液中逐渐溶蚀， 药物从骨架中释放。 释放速度取决于骨架材料的用量及其溶蚀性。 制备常 用方法是将药物趁热溶于或混悬于脂肪或蜡类物质材料中， 冷却后磨成颗粒装入胶囊或压制 成片。三、微囊和微粒型控释制剂可以看成是微型化的贮库制剂和骨架制剂 ，大小在1mm以下，更普遍的仅0.1 um或数 十微米。 可选用水溶或水不溶性

9、高分子材料。 随着高分子材料研究的进展， 生物降解性高分 子材料在微囊和微粒制剂中的应用也逐日增多。应用较广泛的高分子材料有明胶，淀粉 ，白蛋白，聚丙烯酸 -淀粉接枝物， 聚乳酸， 聚羟基乙酸 -乳酸共聚物， 聚甲酰胺， 聚甲基丙烯酸甲酯 ， 聚丙烯腈烷基酯，乙基纤维素等。新型缓控释制剂近年来新型高分子材料的研究和应用使缓控释制剂步入了定时，定向， 定位，速效、高效，长效的精密化给药的新途径。出现了口服渗透泵控释系统、脉冲释放型 释药系统、 pH 敏感型定位释药系统、结肠定位给药系统等新型缓控释制剂。第三节 抗癌药物靶向给药系统及策略靶向给药系统 （target-oriented drug d

10、elivery systems， TODDS） 亦称靶向制剂 ，是指用载 体、配体或抗体将药物通过局部给药、 胃肠道或全身血液循环而选择性地浓集于靶组织、 靶 器官、靶细胞或细胞内结构的制剂。TODDS不仅要求药物到达特定靶组织、靶器官、靶细胞甚至细胞内的结构， 而且要求有一定浓度的药物在靶位滞留足够长的时间， 以便发挥药效。 理想的靶向给药系统应具备：定位蓄积，控制释药，无毒可生物降解这4个要素。因此 ，靶向药物的载体系统至关重要 ， 它应具备以下特点：颗粒小，能在循环中通过毛细血管到达靶部 位;载体能够较好地负载药物 ，使药物的载药量足够高 ，以满足在靶区的治疗浓度 ;经过外包装 的药物在

11、靶位点释放 ，仍应具有足够的生物学活性 ;能够定位于靶位点 ;有足够的循环半衰期 以确保到达靶部位 ;载体的生物相容性好 ，其降解产物能被机体清除或对机体无害;抗原性小 ，热源性小 ，不易形成血栓。一、靶向制剂的分类药物的靶向传输从到达的部位讲可以分为三级：第一级指到达特定的器官或组织；第二级指到达器官或组织内的特定的细胞 （如肿瘤细胞而不是正常细胞，肝细胞而不是Kupffer细胞）；第三级指到达靶细胞内的特定的细胞器 （例如溶酶体）。从靶向传递机理分类，TODDS 大体可分为以下三类：（一）被动靶向制剂被动靶向制剂（passive trarget-oriented preparations）

12、是依据机体不同生理学特性的器官（组织、细胞）对不同大小的微粒具有不同的阻留性，采用载体材料，将药物包裹或嵌入其中制成各种类型的可被不同器官（组织、细胞）阻留或摄取的胶体或混悬微粒制剂。这类给药制剂经静脉注射后，在体内的分布首先取决于微粒的粒径大小。通常小于50 nm的纳米囊与纳米球则缓慢积集于骨髓；小于7m时一般被肝、脾中的巨噬细胞摄取，200400 nm的纳米囊与纳米球集中于肝后迅速被肝清除；大于7m的微粒通常被肺的最小毛细血管床以机械滤过的方式截留，被单核白细胞摄取进入肺组织或肺气泡。除粒径外，微粒表面性质对分布也起着重要作用。迄今，研究最多的被动靶向给药制剂是脂质体、纳米粒（球、囊）、类

13、脂纳米粒、纳米乳、微球等。目前临床试验的一些抗癌药及其载体见表1。表1临床试验的部分抗癌药被动靶向给药制剂及其载体药物载体靶部位阿霉素脂质体肺癌及胰腺癌、乳腺癌、直肠癌或多发性骨髓瘤淀粉微球直肠和肝癌聚甲基丙烯酸酯纳米球肝细胞瘤卡莫司淀粉微球转移肝癌平阳霉素W/0乳剂乳腺癌、颈部水囊瘤脂质体大脑神经蚀质瘤顺铂白蛋白微球肝肉瘤氟尿嘧啶EC微囊上颚骨窦癌鳞状癌淀粉微球肝癌氟尿苷淀粉微球直肠癌、肝癌丝裂毒素C淀粉微球直肠癌、肝癌EC微囊乳腺癌、宫颈癌、胃癌、 癌、膀胱癌肝癌、前列腺癌、肾白蛋白微球肝癌米托蒽醌聚氰基丙烯酸正丁酯肝癌（二）主动靶向制剂主动靶向制剂 （active target-orie

14、nted preparations）是用修饰药物的载体作为导弹”将药物定向地运送到靶区浓集发挥药效。这种载体可以是受体的配体、单克隆抗体、对体内某些化学物质敏感的高分子物质等。粒径小于4m的被动靶向载药微粒表面经用受体的配体、单克隆抗体或其他化学物质修饰后，能避免巨噬细胞的摄取而到达特定的靶部位；将药物修饰成药理惰性的前体药物，也能在体内特定靶区激活发挥作用。（三）物理化学靶向制剂物理化学靶向制剂（physical and chemical target-oriented preparations）是用某些物理化学 方法使TODDS将药物传输到特定部位发挥药效。如应用磁性材料与药物制成磁导向给

15、药制 剂，在足够强的外磁场引导下，通过血管到达并定位于特定靶区；或使用对温度敏感的载体制成热敏感给药制剂，在热疗机的局部作用下，使热敏感给药系统在靶区释药；也可利用对pH敏感的载体制备pH敏感给药制剂，使药物在pH特定的靶区内释药。 用栓塞给药系统阻 断靶区的血供与营养，起到栓塞和靶向化疗的双重作用。二、肿瘤靶向给药的策略（一）利用或逃避网状内皮系统（RES）摄取的被动靶向肿瘤载药粒子进入循环系统后，根据其粒径和表面特征的不同，或者被网状内皮系统（RES）如 肝的枯否（Kupffer）细胞、脾的吞噬细胞等摄取，被动地蓄积在RES分布集中的肝、脾、淋巴 等部位，或者逃避其摄取而靶向其他组织和器官

16、。一般认为，粒径小于5卩m的微粒进入血液循环后，会被RES摄取而积集于肝、脾等器官 中;粒径小于50 nm时，能穿过肝脏内皮或淋巴传递到达骨髓。粒子的表面特征不同，被肝脾和其他器官中的RES摄取的机会也不一样。具有疏水性表面的颗粒易优先被肝脏摄取，其次是脾和肺。而亲水性的纳米粒不易被肝和脾摄取，是一种长循环的给药系统。许多研究证实，长循环纳米粒一般要求直径在100 nm或更小，同时应具有亲水的表面以免被 RES清除。通过接枝或嵌段共聚物的亲水区和疏水区形成的核-壳型胶束纳米粒，具有以上2个重要的特征，因而能达到能够避开 RES的摄取而在血液中长循环，最终被动靶向肿瘤部位。（二）通过EPR效应靶

17、向肿瘤肿瘤组织由于快速生长的需求，血管生成很快，导致新生血管外膜细胞缺乏、基底膜变形 , 因而纳米级的嵌段共聚物胶束能穿透肿瘤的毛细血管壁的缝隙”进入肿瘤组织，而肿瘤组织的淋巴系统回流不完善，造成粒子在肿瘤部位蓄积，这就是所谓的EPR效应（EPR effect），在实 体瘤中是一种非常典型的现象。这种策略属于被动靶向的一种，在当前的靶向制剂研究中有比较广泛的的应用。理论上认为，载药微粒在肿瘤组织中的分布主要取决于微粒在血液中的循环时间，因此长循环的微粒能够更好的利用EPR效应，增加在肿瘤组织的蓄积，但有时并不尽然。这是因为这种 EPR效应在不同的肿瘤组织中存在差异，因此单纯用这种策略的临床效果

18、并不是很理想，若能再结合肿瘤特异性靶向策略，药物靶向肿瘤的能力则更强。（三）肿瘤特异性靶向这种靶向策略主要是利用了肿瘤细胞和正常细胞的差异性，如恶性肿瘤细胞呈现出失控性增殖、对负性生长调控不敏感、血管生成、组织侵袭和转移、凋亡逃逸等生理特征。肿瘤 的主动靶向主要就是针对肿瘤细胞表面特异的分子标记和肿瘤组织部位的微环境，来实现药物特异性传递的。目前，主要有以下几种途径实现肿瘤的特异性靶向。1利用单克隆抗体靶向肿瘤表面抗原，而且作为理想靶点的肿瘤抗原只应存在于肿瘤细胞表面而不表达在正常的宿主细胞上应该是肿瘤细胞生存或行使功能所必需的,且不易产生突变。 迄今 ,FDA 已批准了若干靶向肿瘤的抗体。抗

19、体除了本身作为靶向治疗药物外 ,还可以作为抗肿瘤药物的靶向给药系统,或耦合在给药载体上 ,或与药物形成复合物 ,将抗肿瘤药物传送到肿瘤细胞,再通过内吞等方式进入肿瘤细胞 ,能大大增强疗效 ,同时减轻细胞毒抗肿瘤药物的不良反应。抗体介导的肿瘤靶向是一种更具有特异性的靶向策略,虽然一种单抗并不能对所有肿瘤类型具有特异性 ,但也有一些单抗能识别大部分肿瘤组织,如单抗 2C5 。许多专家认为 ,抗体介导的肿瘤靶向疗法在不久的将来一定会为肿瘤的治疗带来新的希望 。2受体介导的靶向在肿瘤细胞或肿瘤相关血管表面的受体与肿瘤生长增殖密切相关 ,并在一些肿瘤组织过 度表达 ,它们与特异性抗体或配体结合可诱导细胞

20、内化。这种特异性的受体为肿瘤靶向治疗 提供了靶点。传统的化疗药物与肿瘤特异性配体或抗体结合 ,可增强药物的肿瘤选择性并减 少药物的不良反应。目前 ,药物肿瘤靶向研究中常用的受体有转铁蛋白受体、细胞因子受体、叶酸受体、低密 度脂蛋白受体、 激素受体等 8 ;通过在给药载体上偶联相应的配体或直接将配体与药物耦合 配体与受体结合后诱导细胞内化进入肿瘤细胞 ,从而将药物靶向输送到肿瘤组织。 3肿瘤激活的原药这种靶向方法是将药物通过酸或酶易裂解的接头连接在一种对肿瘤组织有特异性的分子 上,形成的复合物是没有活性的。只要当复合物到达肿瘤部位 ,肿瘤特异性分子才能从复合物 中裂解出来 ,释放出有活性的药物

21、,造成了肿瘤组织局部活性药物浓度很高 ,从而达到杀灭肿 瘤细胞的目的。此给药系统理论上依赖无活性的复合物与肿瘤微环境和细胞表面相互作用 , 如肿瘤分泌的特异性的酶或比正常组织偏酸性的环境等。4通过肿瘤血管系统靶向肿瘤血管生成是实体瘤生长过程中的限速步骤,血管生成时会表达一些在正常状态下不表达或微量表达的分子标志物，如a v 3 3 , a V整合素、血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)、基质金属蛋白酶(MMP)等oVEGFR和整合素不仅是血管发生的标志物，而且还在血管发生中起 着重要的作用。因此通过配基靶向这些标志分子,则能实现肿瘤疾病的靶向治疗。( 1)通过血管生成机制靶向肿瘤肿瘤血管生成

22、涉及到许多血管生成刺激因子和抑制因子相互作用的平衡，是一种非常复杂的过程。这些刺激分子包括:血管内皮生长因子 (VEGF) 、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) 、血小板源性生长因子 (PDGF) 和基质金属蛋白酶 (MMP) 等; 而抑制因子有 : 干扰 素(INF a , 3，、丫凝血栓蛋白(thrombospondin21 ,2)、MMP 抑制剂、内抑素(endostatin)和 an giostat in等。因为有如此众多的分子参与了血管的形成，因此针对肿瘤血管生成的肿瘤靶向治疗将存在许多潜在的作用靶点。这些策略包括，在肿瘤部位限制血管内皮细胞增殖和移动、增加血管生成抑制因子的表达、降

23、低血管生成刺激因子的水平等措施。研究表明，一些肿瘤血管生成时，整合素a V 3在的新生血管内皮细胞上高表达，因此高表达的a V 3可以作为药物靶向肿瘤的靶点。最近,有研究者将脂质阳离子纳米粒的脂质分子上连接上一可以识别 a V3 3的靶向头基 ，发现载有突变 Raf 基因的纳米粒可以阻断内皮细胞的信 号传导 ，从而阻断了多种生长因子的血管生成刺激作用。(2)通过肿瘤血管特异的分子标记靶向肿瘤基于血管内皮存在分子的异质性，即不同组织或器官的血管壁上存在着不同的分子标志物与蛋白 ,Pasqualini 等用体内噬菌体展示技术筛选靶向肿瘤血管的配基 小分子多肽 ,获得了与肿瘤血管特异结合的小肽 ,这

24、些多肽小分子通过识别肿瘤组织血管内皮细胞上的受体而 靶向肿瘤组织。将这些小肽与给药载体或者直接与药物连接,也可以将化疗药物靶向递送到肿瘤组织。Arap等用肿瘤血管导向肽 NGR和RGD 4C与阿霉素结合，在小鼠的肿瘤模型中提高了 治疗效果。随后的实验中他们用相同的导向肽与前凋亡小肽结合在一起,这种双功能复合体可以有效内化并通过破坏细胞的线粒体膜诱导血管内皮细胞的凋亡，将此复合肽注入小鼠血管则抑制了体内肿瘤的生长和转移。最近的试验表明NGR与肿瘤坏死因子a (TNFa )的结合明显提高了 TNFa介导的肿瘤的消退。 这些结果说明，利用肿瘤血管表达的特异性受体来发展 靶向治疗的策略是可行的。(四)

25、 其他靶向策略除以上所提及的若干被动靶向和主动的方法外，还有一些其他策略 ，如通过物理化学方式介导的肿瘤靶向。这种靶向策略主要包括 3种类型 ，即磁性制剂的肿瘤靶向、栓塞靶向制剂、 热敏介导的靶向等。另外，还有环境响应性的靶向策略，如pH值敏感靶向胶束给药系统等。基于在靶区的反常pH值或温度的物理靶向。如在肿瘤或发炎组织。在发炎区域伴随有 酸中毒和过高热 ，这使得利用某些在较低 pH 值或较高温度刺激响应的药物载体分解，释放药物成为可能。目前pH依赖型释药系统主要通过用pH敏感材料进行包衣的方法来实现，不同的pH敏感材料，其溶解度、衣膜厚度不同。Khan等把一定比例德国Rohm公司生产的产品E

26、udragit S和Eudragit L制成共聚物，作为包衣材料，通过一定厚度衣膜的控制，达到了结肠靶 向的目的。Wein stein等证实，将抗癌药物甲氨碟呤热敏脂质体通过静脉注射注入移植肿瘤的 大鼠静脉内 ，其药物在肿瘤的聚集速度是正常组织的几倍，特别在肿瘤区域外部加热 ，其药物浓度将更高。在体外磁场作用下的磁性靶向给药。 它是由药物、 磁铁粒子及骨架材料组成。 该药物可 在外磁场引导下通过静脉 ，动脉导管 ，经口服给药或直接注射等途径选择性地到达并定位于肿 瘤靶区。Widder等人较早提出磁控靶向药物传递系统的概念，并率先开展了载药磁微球的制备和基础研究。结果表明 ，在足够强的体外磁场引

27、导下 ，磁微球通过血管时可避免网状内皮系 统的快速清除 ，选择性地到达并定位于肿瘤靶区，使药物在肿瘤组织的细胞或亚细胞水平上发挥药效 ，而对正常组织无太大影响。具有高效、低毒、高滞留性的特点。总之，靶向抗肿瘤药物的研究和发展很大程度上取决于相关研究领域的进展，如生物化学、免疫学、细胞及分子生物学、药动学、药理学及材料学。在今后，靶向治疗将成为肿瘤治疗的主流。为使其广泛应用于临床，还有以下问题有待解决 :1) 载体的筛选 ，以获得合适的释药速度和良好的缓释功能 ;2) 提高载体的载药量 ，减少在循环的降解 ，减少对正常组织的毒 副作用 ;3) 改善载体的表面性质 ，增强其主动靶向性 ，以减少网状

28、内皮细胞对它的吞噬 ;4) 探 寻靶向药物在体内的药物动力学规律 ;5) 找出血液变学指标及其它体内因素对微球定位、降 解与缓释的影响途径 ;6) 合适的用药途径 ，以发挥最佳的靶向效果 ;7) 对肿瘤的发病机理及肿 瘤部位特殊的生理生化变化仍需更透彻的了解。若以上问题得以解决，靶向药物用于人类肿瘤治疗则将更迈进一步。第四节 阳离子聚合物在基因载体系统中的应用目前 ，应用于基因治疗的载体主要有病毒载体和非病毒载体两种。病毒载体转染效率高 但存在免疫原性高、 毒性大、目的基因容量小、靶向特异性差、制备较复杂及费用较高等缺点 , 因此人们愈来愈重视非病毒载体的研究。非病毒载体安全性好,但存在转染、

29、整合效率低等缺点。常用的非病毒载体包括裸 DNA(naked DNA) 、脂质体载体及阳离子多聚物载体等。 与脂质体及其它非病毒载体相比,阳离子多聚物载体比较稳定 ,结构灵活 ,易调整其分子量、 聚合物合成、多聚物形状 (线形、星形、无规网状、嵌段、接枝等) ,可以通过引入侧链和特异靶向性基团来修饰多聚物骨架 ,进而调整和改善载体的性能 ,因此阳离子多聚物载体具有较大 的发展空间 ,引起材料学家的广泛关注 ,成为研究的热点。根据多聚物的生物特性 ,可将阳离子多聚物基因载体分成人工合成型和生物型。常见的人工合成型阳离子多聚物型载体有多聚左旋赖氨酸 poly( L-lysine), PLL, 多聚

30、乙烯亚胺 (polyethylenimine , PEI) 和星状树突体 Polyamidoamine (PAMAM) dendrimers 等 ;天然生物 型阳离子多聚物基因载体主要有壳聚糖及其衍生物和明胶等。一、纳米阳离子多聚物基因载体系统阳离子聚合物结构上的一个共同特点是分子内含有许多氨基,在生理 pH 下会发生质子化这些质子化的氨基可以与 DNA 的磷酸基团的负电荷之间的静电吸附作用而发生电性中和 , 使DNA自组装成稳定的多聚复合物(polyplexes),使DNA分子由伸展结构压缩为体积相对较小 ,不易被核酸酶降解的 DNA 粒子 ,并可防止大的复合物在短时间内沉淀,进而提高转染效

31、率。此外,复合物大小约50500nm ,带正电荷，可与细胞表面带负电荷的受体结合，因此能有效被细胞内吞摄入介导基因转移。然而阳离子多聚物 PDNA 复合物纳米微粒进入体内后 ,在达 到靶细胞的过程中需要克服许多障碍 ,如调理素 (血清抗体、补体 ) 、吞噬系统、胞外基质、 降解酶等 。因此,对阳离子多聚物 /DNA 复合物纳米微粒表面要接上细胞表面特异表达的受 体来解决靶向性问题 ,使复合物能穿越重重障碍 ,安全无损到达靶细胞。运载系统到达靶细胞 后,首先遇到的是胞膜 ,其亲疏性、通透情况直接影响载体进入胞内。如果通过胞吞作用进入 内吞小泡后，则会受到内吞小泡中酶的降解或进入溶酶体腔室中被降解

32、，为促使DNA从内吞小泡和溶酶体中释放 ,可加入溶酶体抑制剂如氯喹或利用非病毒本身的特点如采用有侧链的 阳离子多聚物如 PEI 和星状树突体等来破坏内吞小泡膜以释放其中的 DNA ; 也可以利用病 毒或病毒蛋白、细菌蛋白、短肽等。 DNA 转运对于许多非病毒介导的转染来说都是一个限 速步骤 ，可以通过共价偶联上靶向基因及富含赖氨酸和精氨酸的核定位信号(NLS) 序列，便于复合物进入核中进行转录 ，从而提高转染效率。 Foster 等将人表皮生长因子 (HER2) 抗体与 多聚赖氨酸共价耦联 ，然后用于荧虫酶基因表达质粒(pRSVLuc) 非共价结合 ，发现其转染效率提高了 186 倍。 Zen

33、ke 等利用转移蛋白多聚赖氨酸结合外源质粒 ，通过转铁蛋白受体 ，成 功将外源基因导入造血细胞。而对于聚阳离子载体的毒性机制目前主要有两种代表性的观点，其一认为毒性的产生主要是阳离子聚合物的正离子与细胞膜的相互作用而对细胞产生损伤或引起细胞的凝聚，另外一种则认为阳离子聚合物进入细胞后激活细胞内信号转导系统导致的。Fischer 等对聚合物进行了体外细胞毒性试验 ，发现阳离子聚合物载体的毒性具有结构依赖性，与阳离子聚合物的分子量、电荷密度、空间构型以及阳离子聚合物 DNA 复合物的表面电位等因素有关。对 于结构相似的阳离子聚合物 ，分子量和载体表面电荷的密度是影响载体毒性的关键因素 ，分子 量越

34、高 ，载体表面的电荷密度越大 ，载体的毒性越大 ;对于结构不同的聚合物 ，影响载体毒性的 因素较复杂。 Fischer 在测试了常见的几种阳离子聚合物载体的毒性后 ，发现聚乙烯亚胺和聚 赖氨酸的毒性最大 ，而聚酰胺胺型树状物载体的毒性较小。Gebhart 亦通过转染一组细胞比较了常见的阳离子聚合物 ，和脂质体的毒性 ，在研究中发现大部分阳离子聚合物载体的毒性 比阳离子脂质体的毒性小。且阳离子聚合物的结构特点使其易于通过修饰降低毒性。、合成型纳米阳离子多聚物基因载体系统合成型阳离子多聚物基因载体主要分为多肽类和多聚季铵盐类,常用的载体有 : 多聚左旋赖氨酸 (PLL), 多聚乙烯亚胺 (PEI)

35、 和星状树突体 (PAMAM) 等。(一) PEI 介导的纳米基因载体系统PEI 是近年来研究最为广泛的阳离子多聚物非病毒基因载体。 PEI 有两种形式 :线性和支 链。支链型的 PEI 是一种高度分枝的聚合物 ,具有强大的缓冲能力 ,能抑制晚期内吞小泡的酸 化并因而导致肿胀引起内吞小泡膜的破裂释放其中的载体 DNA 。PEI 与 DNA 通过静电作用形成复合物 ,并且新形成的复合物表面电荷与 PEI 的相比显著 降低,有利于与细胞膜的融合 ,并降低载体的毒性。其 PEI 缩合 DNA 的能力取决于二者量的 比例(N: P),缩合后形成的复合物粒径一般在2040nm ,个别大粒子达到240nm

36、。纳米级的粒径有助于实现载体的靶向性和穿入细胞的有效性。目前发现影响复合物转染效率的主要因素有PEI的氨基与DNA的磷酸基的比例(N/P)、PEI的分子相对质量、PEI的支化度、复合物的粒径及表面电荷密度等。Boussif等的研究表明支化 PEI 的转染效率在 N/P 为9 13.5 时达到最大。 这可能是由于复合物中大量的氨基增 强了复合物的缓冲能力 ,使之更有效地从内吞小泡中释放而到达核内进行转录表达。Godbey等研究发现随着 PEI 分子相对质量的增加 ,DNA 的转染效率增加 ,但细胞毒性也增大。 Ogris 等报道粒径较小 (40nm) 的转运铁蛋白 -PEI/DNA 复合物与粒径

37、较大 (100nm) 的复合物相比 , 转染效率低，这可能是较小的粒径有利于复合物的降解。另外，使PEI与靶向性配体连结有利于提高 DNA 的转染效率 ,乳糖化多聚乙烯亚胺 (L-PEI) 能将 DNA 选择性的投放干细胞 ,具有 靶向性 ，对受体阳性的 Huh7 细胞具有较高的转染效率。(二) PLL 介导的基因纳米控制系统PLL 是一种简单的合成型多聚物。由于带有氨基基团，可以使分子链带正电荷 ，而与表面带负电荷的 DNA 通过静电吸附作用形成纳米微粒。 研究表明影响复合物稳定性和尺寸的因 素主要有溶液的pH、N/P、PLL的尺寸、PLL的改性程度等。在N/P小于0.8时,PLL与DNA

38、的键合作用依赖于pH，但N/P较大时,二者的作用与pH无关。PLL的分子相对质量是影响 PLL与DNA相互作用的重要因素，在较小的N/P下,分子相对质量越高的 PLL与DNA结合 越完全，当N/P = 12时，复合物的尺寸和尺寸分布随着 PLL相对分子质量的增大而增大。由于外源基因进入核内所需要的核定信号序列中含有较多的碱性氨基酸，因此多聚赖氨酸可能参与核定位过程，而使PLL-DNA复合物的转染效率比其它阳离子多聚物基因复合物 的高。然而由于 PLL 较低的转染效率和较高的细胞毒性，需要对 PLL 进行改性 ，使其成为亲水性、生物相容性并具有靶向性的高分子材料来提高它的转染效率 ，降低毒性 ，

39、如将 PLL 与亲 水性的聚合物嵌段PEG、右旋糖苷PEG、右旋糖苷pHPMA接枝。因此可以通过改变聚合 物的物理化学及生物性能来调节其作为基因载体的转运性能。靶向化PLL可以将其乳糖化，如在研究中发现脂质体或乳糖化多聚赖氨酸包埋的重组表 达质粒经腹腔途径导入人体内后 ，均以肝脏为主要分布器官 ，而糖化多聚赖氨基酸的肝脏靶向 导入作用优于脂质体。也可以将完整的EGF或合成的EGFC环肽段与对DNA有结合力的多聚赖氨酸极性化学偶联来作为 DNA 转移载体 ，起到靶向性作用。(三) PAMAM 树状大分子介导的基因纳米控释系统PAMAM 树状大分子是一类新型纳米级的合成高分子，它们高度枝化的结构和

40、独特的单分散特性为这类化合物带来一系列不同寻常的性质和行为。其纳米超微小体积，可以携带药物、基因等通过任何毛细血管 ，到达靶部位并进入组织间隙 ，被细胞吸收 ，因此是一种理想的导 向载体。一般说来 ,树枝链大分子作为药物载体的载药方式有以下两种: (1) 药物分子可以被物理捕捉到树枝链大分子的内部 ;(2) 药物分子可以通过共价键结合到树枝链大分子的表面或者 其他部位的功能基上形成树枝链大分子-药物结合体。1物理捕捉法适当设计的树枝链大分子的内部“空腔”可以被用来诱捕药物分子从而实现可控释放的 可能性。 研究表明树枝链大分子的内部具有捕捉小分子的能力。 例如树枝链大分子中可以利 用树枝链大分子

41、与分子之间的各种非共价键化学相互作用(例如氢键的作用 ) 进行物理捕捉。Frechet等制备出了具有疏水的内核和连有亲水基团外壳的树枝链大分子，这种树枝链大分子具有单分子胶束的性质 ,可以使多种疏水的小分子化合物溶于水溶液中。树枝形单分子 胶束为设计新的药物载体系统提供了机会，由于树枝形单分子胶束所特有的内在稳定性和所具有的包裹小分子的能力 ，使其有望成为性能良好的新型药物载体。2树枝链大分子 -药物结合体制备树枝链大分子 -药物结合体的最简单的方法是将药物分子直接连接到树枝链大分子 的“表面 ”。由于每个树枝链大分子具有多个表面功能基团，因此每个树枝链大分子可以连接多个药物分子。 每个树枝链

42、大分子所连接的药物分子的数量随着树状分子代数的多少和连接 条件的改变而改变。研究表明不同代数的树枝链大分子在相同条件下对药物的释放能力不 同。该复合物除可在体内或体外获得高水平的 DNA 转染效率 ，还有一系列优良特性。首先 ， PAMAM/DNA 复合物具有很高的稳定性和溶解性。 Delong 等研究发现 PAMAM 并不改变 DNA 的结构 ，保证复合物结构的稳定性和 DNA 的活性。另外复合物在水溶液中可稳定存在 长达几周时间 ，并且在较大的 pH 值范围内和不同的缓冲液条件下稳定存在，并不解离。只有采用离子清洁剂SDS(十二烷基硫酸钠)时才能解离DNA-树状大分子复合物。DNA-树状大

43、分 子复合物对限制性内切酶也很稳定，这就使得 DNA 在体内存活时间延长。与裸露的 DNA 或现有的阳离子脂质体系统介导的转染技术相比 ，核酸分子 (反义寡核苷酸、 反义 cDNA 质粒与 表达质粒等)与PAMAM分子的复合物可在体外转染大量不同类型的真核细胞，并具有普遍的高效性。其次,PAMAM树状大分子能缓冲内吞小泡中的pH值,而且热处理使之活化后由于除去一些分枝而灵活多变 ，其转染效率提高 50倍左右。由于他们的分支中含有大量氨基，因此可共价偶联一些配体并可迅速内吞。 最后,对真核细胞转染效率的大小与复合物分子的大小、 形状、表面电荷密度、pKa (树状大分子的酸性解离常数 )及PAMA

44、M与DNA分子的电荷比等因素有关。 因此,在合成 PAMAM 时我们可以通过控制内核分子、 代数和活化时间来调整和 控制其转移基因的特性 ,增强 DNA 的转染效率。除了上述三类经典的合成多聚阳离子载体外 ,近年来也报道了很多用于基因载体的新载 体材料，同样取得了很好的转染效果。如 lim等报道人工合成的聚2-(4-氨基丁基-L-乙醇酸) (PAGA)与DNA以电荷比为1 : 1的组成，能形成自组装生物可降解的复合物，PAGA体内降解最终产物为L-氧化赖氨酸，它的转染效率约为PLL/DNA复合物的2倍多。Wen等报道用 生物可降解两亲聚磷酸酯 Poly(PhosPhoester) 为主链 ，胆

45、固醇为支链阳离子聚合物 PCEP 与挂 有红色荧光蛋白 (red fluorescont protein ,RFP)形成大小为100 - 120nm , Zeta电位为20 30mV的纳米粒PCEP/ pRFP作为基因给药系统。在体外 ，Caco-2细胞实验中，呈现很高的细 胞转染率。 用口服管饲法 (oral gavage) 观察到大鼠小肠中有很高的 RFP 表达。 Fonseca 等报 道用聚2-(二甲基氨基)-乙基丙烯酸甲酯(PDMAEMA)阳离子为载体进行 仆葡糖醛酸酶基 因治疗，发现该载体有压缩(condense) pDNA作用，在0VCAR-3细胞上呈现有效转染作用，比 商品阳离子脂质 (HPofectamine) 转染率高 30 %。三、纳米天然生物高聚物基因载体系统生物高聚物如明胶和壳聚糖也属于阳离子复合物 ，是生物可降解材料 ，广泛用作缓释材料 ， 能与DNA形成大小为200700nm的微球体。(一) 壳聚糖介导的基因纳米控释系统壳聚糖是一种无毒、无副作用的物质，具有生物粘附性、生物相容性和可降解性。目前可以利用硫酸钠盐诱导的共沉淀法制备壳聚糖与 DNA 复合