动物生化蛋白质1

1、讲授内容 第一节 蛋白质在生命中的重要作用 第二节 蛋白质的化学组成 第三节 蛋白质的化学结构 第四节 蛋白质的高级结构 第五节 多肽、蛋白质结构与功能的关系 第六节 蛋白质的物理化学性质和分离提 纯 第七节 蛋白质分类 第一节 蛋白质在生命中的 重要作用 蛋白质的概念 “protein”是荷兰化学家Mulder首先使用的， 来自于希腊语“protos”，意为“第一”和 “最重要的” 蛋白质和核酸（DNA和RNA）都是生物大分子。 它们存在于动物、植物和微生物的细胞之中。 蛋白质是生命活动的物质基础，在机体内蛋白 质约占机体固体成分的45%，几乎在一切生命 过程中都起着关键作用 酶类 催化体内

2、生化反应 激素蛋白类 调节体内物质代谢，如Ins、 IGF-I、GH（Hormone） 运输蛋白类 运输代谢所需小分子、离子以及 电子，如血红蛋白 运动蛋白类 使细胞或生物体发生运动，如肌 球蛋白和肌动蛋白 防御蛋白类 抵抗入侵，保护机体，如抗体 （与细菌、病毒选择性结合）、补体（杀死细 菌、病毒）、干扰素（抑制病毒）；凝血酶和 血液纤维蛋白原参与血液凝固 受体蛋白类 存在于细胞各个部分，把激素、 神经递质信号传递给靶细胞，如膜受体 生长、分化的调节蛋白类 对细胞的生长、分 化、基因表达其调节作用。例如：组蛋白、阻 遏蛋白、表皮生长因子 营养和贮存类 卵清蛋白、乳中酪蛋白、小麦 种子中的醇溶蛋

3、白 结构蛋白类 机体的结构成分，如胶原蛋白、 角蛋白、硬蛋白、丝心蛋白、弹性蛋白 毒素蛋白类 极少量即可导致中毒，霍乱毒 素、毒蛇的毒素蛋白 膜蛋白类 生物膜的成分，可进行细胞的识 别、物质运输、信息传递等 蛋白质是生命活动所依赖的物质基础。 没有蛋白质就没有生命！ 第二节 蛋白质的化学组成 一、蛋白质的元素组成 碳50%55%、氢6%8%、氧20%23%、氮15%17%、硫0.3%2.5% 某些蛋白中，还含有微量的磷、铁、铜、钼、碘、锌等元素 各种蛋白质的氮的含量比较恒定，平均值为16% 蛋白质的含氮量 大多数蛋白质的含氮量接近于16%，这是蛋白质元素组成的一个特点，也是凯氏 （Kjedah

4、l）定氮法测定蛋白质含量的计算基础。 根据生物样品中的含氮量来计算蛋白质的大概含量： v 蛋白质含量=蛋白氮 6.25 v 6.25为蛋白质系数，即1克氮所代表的蛋白质量（克数） 二、蛋白质的基本结构单位和其它组分 蛋白质的基本结构单位是氨基酸 蛋白质分为两大类 简单蛋白质 水解后产生各种氨基酸 结合蛋白质 水解后还可产生其它组分， 如血红素、糖类、脂类、核酸、金属离子 等 C H COOHR NH2 氨基酸的结构通式 三、氨基酸 1.氨基酸的基本结构与构型 常见的氨基酸20种，除脯氨酸是-亚氨基酸外，其余19种都是-氨基酸。 COOHC H2C H2C NH C H H2 甘氨酸 结构式 H

5、 NH2 CCOOH H 除甘氨酸外，其余19种氨基酸都具有手性，天然蛋白中的所有氨基酸都是L-型 的。 但在某些微生物和植物体中常含有D-型氨基酸 C R COOH NH2H2NC R COOH HH L-型氨基酸 D-型氨基酸 根据R侧链极性和电荷不同，分四大 类 非极性 不带电极性 正电极性 负电极性 2.氨基酸的分类 非极性氨基酸 “丙、缬、亮、异亮、脯上色、苯、蛋” R基团具有疏水性。 Non-polar amino acids 不带电极性 “甘、丝、苏、半、酪、天冬、谷氨酰胺” R基团有极性，但不解离，或仅极弱地解离，它们的R基团有亲水性 Polar, uncharged amin

6、o acids 正电极性 “赖、精、组” R基团有极性，且解离，在中性溶液中显碱性，亲水性强 Basic amino acids 负电极性 “天冬、谷氨酸” R基团有极性，且解离，在中性溶液中显酸性，亲水性强 Acidic amino acids 3.稀有氨基酸 除了上述20种常见氨基酸以外，还有一些仅存在于少数蛋白质中的稀有L型氨 基酸 胶原蛋白和弹性蛋白中的4羟脯氨酸和5羟赖氨酸 甲状腺球蛋白中的二碘酪氨酸和L甲状腺素 肌球蛋白中的N甲基赖氨酸；-角蛋白中的胱氨酸 是常见氨基酸的衍生物,没有遗传密码，是在蛋白质生物合成以后，通过有关酶的 催化修饰而形成的。 4.非蛋白质氨基酸 有一些氨基酸

7、不参与蛋 白质的组成，而是以游 离的状态存在于生物体 之中 。 瓜氨酸鸟氨酸 O CH2CH2CH2 NH2 CH COOH NH2 CH2CH2CH2 NH2 CH COOHNHCH2N LL 瓜氨酸鸟氨酸 O CH2CH2CH2 NH2 CHCOOH NH2 CH2CH2CH2 NH2 CHCOOHNHCH2N LL 5.必须氨基酸 从营养学角度还可以将氨基酸分为必需和非必需氨基酸。 八种必须氨基酸:必需氨基酸包括：赖氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、 亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸和精氨 酸，其中的组氨酸和精氨酸，虽然人体能自己合成，但效率较 低，尤其在婴幼儿时期，需要由外界供给

8、。 “一家写两三本书来”+精组 其余的10种氨基酸是非必需氨基酸：甘氨酸、丝氨酸、半胱氨 酸、酪氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、脯氨 酸和丙氨酸。 6.氨基酸的主要的理化性质 光吸收特性 在紫外光区色氨 酸、酪氨酸和苯 丙氨酸有吸收光 的能力。其最大 吸收波长()分别 为279、278、 259nm。 是利用紫外分光 光度计（在波长 280nm处）测 定蛋白质浓度的 基础。 氨基酸的两性解离及等电点 氨基酸COOH能放出质子，变成 COO ；NH 2能接受质子，而变 成NH3。 氨基酸是两性电解质(ampho1yte) 氨基酸两性解离示意图 氨基酸的等电点 溶液中氨基酸以两性离子的

9、形式 存在时，溶液的pH，称为该氨基酸的 等电点，用pI表示。 例如丙氨酸有两个可解离基团，a-COOH和a- NH3，它们的解离常数pK值分别是2.4（pK1） 和9.9（pK2）； 组氨酸有3个可解离基团，即a-COOH、a-NH3 和侧链基团咪唑基，pK值分别是1.8（pK1）、 9.3（pK2）和6.0（pKR）。 每一个pK值都是位于滴定曲线缓冲区的中心，当 丙氨酸处于pH2.4的缓冲液时，它的阳离子形式 和它的兼性离子形式 的摩尔浓度相等，同样在 pH9.9时，它的兼性离子形式 和它的阴离子形式 的摩尔浓度相等。 当氨基酸处于某一pH下，其净电荷为零时， 该pH即为该氨基酸的等电点

10、（pI）。pI可通过相 应的pK值计算出。 pI（pKx pKy）/2 pKx ，pKy为相应的两个可解离基团 对于一氨基、一羧基的氨基酸，上式中的pKx 和pKy为它的pK1和pK2； 而对于象天冬氨酸和谷氨酸那样的酸性氨基酸，pKx和pKy为它的pK1和 pKR； 而对于象赖氨酸、组氨酸和精氨酸那样的碱性氨基酸，pKx和pKy为它的 pKR和pK2。 一个氨基酸带电状况取决于所处溶液的pH，当pI pH时，带净的正电荷。 氨基酸氨基酸分子量分子量 a-COOH pKa a-NH3+R基团基团pI 蛋白质中蛋白质中 出现的几率出现的几率 (%)* 甘氨酸752.349.60 5.977.5

11、丙氨酸 892.349.69 6.019.0 缬氨酸 1172.329.62 5.976.9 亮氨酸1312.369.60 5.987.5 异亮氨酸1312.369.68 6.024.6 脯氨酸1151.9910.96 6.484.6 苯丙氨酸 1651.839.13 5.483.5 酪氨酸1812.029.1110.075.663.5 色氨酸2042.389.39 5.891.1 丝氨酸1052.219.15 5.687.1 苏氨酸1192.119.625.87 6.0 半胱氨酸1211.968.1810.285.052.8 蛋氨酸 1492.289.21 5.741.7 天冬酰胺1322.

12、028.08 5.414.4 谷氨酰胺1462.179.13 5.653.9 天冬氨酸 1331.889.063.652.775.5 谷氨酸1472.199.674.253.226.2 赖氨酸1462.188.9510.539.747.0 精氨酸1742.179.0412.4810.764.7 组氨酸 1551.829.176.007.592.1 氨基酸的等电点的作用 在一定的实验条件下，等电点是氨基酸的特征常数。不同的氨基酸，由于R基结构的不同，而有不同的等电 点。 当氨基酸处于等电点状态时，溶解度最小，容易发生沉淀；利用这一特性可以从各种氨基酸的混合物溶液 中分离制取某种氨基酸。 7.氨基

13、酸的重要化学反应 氨基酸与茚三酮的反应 氨基酸与茚三酮（ninhydrin）的反应是一个检测和定量氨基酸和蛋白质的重要反应。茚三酮在弱酸性溶液 中与氨基酸共热，具有游离氨基的氨基酸都生成紫色化合物（l470），而亚氨基酸，则生成黄色化合物 （l440）。在一定的反应条件下，产生的颜色的强度（溶液中的光吸收）与氨基酸浓度成比例，根据溶液 的吸光度，可以算出相应的氨基酸和蛋白质的浓度。 氨基酸与2,4-二硝基氟苯反应 2,4-二硝基氟苯（2,4-dinitrofluorobenzene, DNFB）也叫做Sanger试剂。 DNFB在弱碱性溶液中与氨基酸发生取代反应，生成黄色化合物二硝基苯基氨基酸

14、 （dinitro phenyl amino acid, DNP氨基酸） 氨基酸与丹磺酰氯的反应 丹磺酰氯（dansyl chloride）是5-二甲基氨基萘-1-磺酰氯（5- dimethylaminonaphthalene-1 -sulfonyl chloride）的简称。丹磺酰氯与氨基酸 反应生成荧光性质强和稳定的磺胺衍生物，也常用于多肽链的N末端氨基酸的鉴定。 氨基酸与苯异硫氰酸酯反应 苯异硫氰酸酯（phenylisothiocyanate, PITC）在弱碱性条件下，与氨基酸反应生成苯乙内酰硫脲 （phenylthiohydantoin, PTH）衍生物，即PTH-氨基酸，这种衍生物

15、是无色的，可用层析法鉴定, 此反 应又称之Edman反应，该反应是蛋白质或多肽氨基酸序列测定常用的反应。 第三节 蛋白质的化学结构 蛋白质的化学结构 氨基酸组成 多肽链数目 末端氨基酸组成 氨基酸排列顺序 二硫键位置。 一、蛋白质的氨基酸组成 测定：用盐酸或NaOH对高纯度蛋白质样品进 行彻底水解，再用氨基酸自动分析仪测定。 组成：即所含氨基酸的种类和数量。有两种表 示方式： Aa g/100g 蛋白 Aa个/个蛋白（已知分子量情况下） 每一种蛋白质都有自己特定的氨基酸组成，氨 基酸组成不同，则蛋白质不同。 二、肽键和肽链 肽键(peptide bond)，一个氨 基酸的羧基与另一个氨基酸的

16、氨基之间失水形成的酰胺键， 所形成的化合物称为肽。 含有三个、四个、五个氨基酸 的肽，分别称为三肽、四肽、 五肽等。含有三个以上氨基酸 的肽，统称为多肽 (polypeptide) 由许多氨基酸残基通过肽键彼 此连接而成的链状多肽，称为 多肽链 (polypeptide chain) 肽键 肽键中的C-N键具有部分 双键性质，不能自由旋 转。 在大多数情况下，以反 式结构存在。 氨基酸残基 组成多肽的氨基酸成为不完整的分 子形式。被称为氨基酸残基(amino acid residue)。 R H H N O CC 氨基酸残基 三、蛋白质的一级结构 定义：就是蛋白质多肽链中氨基酸残基的排列顺序

17、(sequence) 是蛋白质最基本的结构。它是由基因上遗传密码的排 列顺序所决定的。 由于组成蛋白质的20种氨基酸各具特殊的侧链，侧链 基团的理化性质和空间排布各不相同，当它们按照不 同的序列关系组合时，就可形成多种多样的空间结构 和不同生物学活性的蛋白质分子。 蛋白质的一级结构决定了蛋白质的二级、三级等高级 结构。 从多肽的结构可以看出，多肽的大多数离子电荷都是由它的组成氨基酸残基的侧链贡献的。所以一个多肽 和蛋白质的离子特性和它的溶解性都取决于它的氨基酸组成。此外就象我们将在下面看到的那样，氨基酸 残基侧链之间的相互作用对于稳定一个蛋白质分子的三维结构有重要贡献。 有些肽比较大，例如胰岛

18、素就是含有51个氨基酸残基的多肽， 具有重要的生物学活性。但有些肽虽然比较小，也具有重要的 生理功能 例如加压素（9肽）和催产素（9肽）。一些神经多肽的类似物， 如内啡肽，就是一种天然的止痛药。还有一些非常简单的肽也 常用作食物的调味剂。如甜味剂Aspartame就是天冬氨酰苯丙 氨酸的甲基酯（右图）。它的甜度是蔗糖的200倍，所以广泛用 于食品饮料中。 多肽链的书写与名称 在多肽链中，肽链的一端保留着一个氨基，另一端保留一个羧基，带氨基的末端称氨基末端(N 端)；带羧基的末端称羧基末端(C端)。 肽链书写：一般从N末端向C末端书写，N端写于左侧，用H做标帜，C端于右侧用OH表示。肽命名时为某

19、 某酰某某酰某某酸。 甲硫脑啡肽命名举例 中文氨基酸残基命名法： 酪氨酰甘氨酰甘氨酰苯丙氨酰甲硫氨酸 中文单字表示法：酪甘甘苯丙甲硫 1 2 3 4 5 三字母符号表示法：TyrGlyGlyPheMet 单字母符号表示法：YGGFM 甲硫脑啡肽的结构式 肽键 H2NCO H CH3 S COOHNHCCO H NHCCO H NHCCO H NHC HHCH2 C H CH2 OH CH2 CH2 蛋白质一级结构的测定 Sanger于1953年完成了第一个蛋白质胰岛素的氨基酸 序列测定。每一种蛋白质都具有唯一的氨基酸序列，实际 上蛋白质的氨基酸序列是由DNA决定的。蛋白质的氨基酸 序列具有重要

20、意义： n 蛋白质的氨基酸序列是阐明蛋白质生物活性的分子基础； n 蛋白质的一级结构决定它的空间结构； n 氨基酸序列的改变可以导致蛋白功能异常和疾病； n 通过对一些蛋白质的氨基酸序列的比较可以反应出一些生物亲缘关 系。 氨基酸的组成分析 一个已经纯化的蛋白质的氨基酸组成可以定量测定。首先通过酸 水解破坏蛋白质的肽键，典型酸水解的条件是：真空条件下， 110，用6M盐酸水解16至72小时。 然后水解的混合物（水解液）进行柱层析，通过柱层析可以将 水解液中的每一个氨基酸分离出来并被定量，这一过程称之氨基酸 分析（amino acid analysis）。其中一种氨基酸分析方法是用苯 异硫氰酸酯

21、（PITC）处理蛋白质水解液（pH9），生成苯硫脲 （PTC）-氨基酸衍生物，PTC-氨基酸混合物经HPLC（细硅胶柱）， 按照它们的疏水特性被分离。分离的每个PTC-氨基酸经测量 254nm（PTC-氨基酸吸收峰波长）光吸收，确定它们的浓度。下 图给出了PTC-氨基酸混合物HPLC的洗脱图，图中的峰用各个氨基 酸的吸收峰，用标准的单个字母表示。由于存在于水解液中每个氨 基酸的量是与洗脱峰的面积成比例的。 缺点: 酸水解虽然很有用，但酸水解条件下不能获得完整的氨基 酸分析，因为天冬酰胺和谷氨酰胺的侧链含有酰胺键，用 于切断蛋白质肽键的酸也可以将天冬酰胺转换为天冬氨酸， 谷氨酰胺转换为谷氨酸。所

22、以当使用酸水解时，层析图中 的谷氨酸和谷氨酰胺的总量用Glx或Z表示，而天冬氨酸 和天冬酰胺的总量用Asx或B表示。 由于水解温度比较高，色氨酸的吲哚环容易被空气氧化， 即使在密封的管中，色氨酸的吲哚环也几乎都被破坏了。 因此蛋白质的色氨酸含量往往是通过它的紫外吸收光谱估 计的，也可以通过碱水解分析色氨酸的含量。 半胱氨酸在酸水解中也不能精确测定，要精确测量需要在 蛋白质水解之前进行氧化或羧甲基化，形成的衍生物在酸 水解之后才能定量。 Edman降解 1950年P. Edman公布了一项新的氨基酸序列的测定技术，即运用上述苯异硫氰酸酯与氨基酸的反应 （Edman反应）。这种技术每次都只是从蛋白

23、质的N端解离和鉴定一个氨基酸残基，这是一项使蛋白质序 列分析革命化的技术。1967年Edman和Begg建成了多肽氨基酸序列分析仪。 过程 P. Edman降解测序主要涉及耦联、水解、萃取和转换等4 个过程。 首先使用苯异硫氰酸酯（PITC）在pH9.0的碱性条件下 对蛋白质或多肽进行处理，PITC与肽链的N-端的氨基酸 残基反应，形成苯氨基硫甲酰（PTC）衍生物，即PTC- 肽。 然后PTC-肽用三氟乙酸处理，N-端氨基酸残基肽键被有 选择地切断，释放出该氨基酸残基的噻唑啉酮苯胺衍生物。 接下来将该衍生物用有机溶剂（例如氯丁烷）从反应液中 萃取出来，而去掉了一个N-端氨基酸残基的肽仍留在溶

24、液中。萃取出来的噻唑啉酮苯胺衍生物不稳定，经酸作用， 再进一步环化，形成一个稳定的苯乙内酰硫脲（PTH）衍 生物，即PTH-氨基酸。 大蛋白被水解成肽段后再测序 Edman降解法测序每次只能测定几十个氨基酸残基，所以要测定较大蛋白质的氨基 酸序列，需要将其降解为一些肽段，经HPLC分离出各个肽段，然后再进行Edman 降解测序。蛋白质降解常用的是一些水解酶（如胰蛋白酶）和化学试剂（如溴化 氰）。一般都是采用两种酶（或化学试剂）解获得两组不同的肽段，以便最后拼出 完整的氨基酸序列。 溴化氰（BrCN）可以特异与蛋白质中的蛋氨酸残基反应生成一个C末端为高丝氨酸内酯的肽和一个带有新 的N末端残基的肽

25、。 胰蛋白酶特异地催化赖氨酸残基和精氨酸残基羧基侧的肽键的水解，而胰凝乳蛋白酶特异地催化苯丙氨酸、 酪氨酸和色氨酸三种芳香族氨基酸残基羧基一侧的肽键水解 蛋白质一级结构的比较可以揭示进化关系 蛋白质一级结构是由编码它的基因确定的，蛋白质一级结构之 间的差别可以反映出进化关系。亲缘关系密切的蛋白质的氨基 酸序列非常类似，一级结构中氨基酸残基序列差别越大，它们 的亲缘关系就越远。细胞色素c是由一条含有104至111个氨基 酸残基的多肽链组成的，由于细胞色素c几乎存在于所有的需氧 生物中，所以通过在分子水平上比较来自不同种属的细胞色素c， 可以看出它们之间的进化关系。 下图是根据不同种属的细胞色素c

26、的氨基酸残基的差别绘制出的 进化树，每一个树杈的长度都与蛋白质中氨基酸残基的差别数 成比例。 例如人与黑猩猩的细胞色素c的氨基酸序列完全一样，但与 猴、狗、金枪鱼和酵母的细胞色素c相比，可变换的氨基酸残基 数依次为1、10、21和44。那些进化中不易改变的、保守的氨 基酸残基是维持细胞色素c功能所必需的。由同一个祖先进化来 的表现出序列相似性的蛋白质称之同源蛋白质。 1955年Sanger等人用酶和化学方法成功测定牛胰岛素全部化学结构 要求：纯度达到97%以上，样品的分子量和氨基酸组成必须事先测出 步骤： 末端测定 二硫键测定 两种裂解法制短肽 纯化短肽 自动蛋白测序仪分析 肽段序列重迭法排序

27、 确定二硫键位置 牛胰岛素的结构 小 结 蛋白质是由20种氨基酸组成的。氨基酸性质方面的差别 反映了它们侧链的不同。除了甘氨酸没有手性碳以外，其 他19种氨基酸都至少含有一个手性碳。 氨基酸的侧链可以按照它们的化学结构分为：脂肪族的、 芳香族的、含硫的、含醇的、碱性的、酸性的和酰胺类。 氨基酸和多肽的酸性和碱性基团的离子状态取决于pH。 许多氨基酸具有非极性的侧链，在水溶液中它们倾向于聚 集在一起，以减少与水相互作用的面积，这种倾向称为疏 水相互作用。 茚三酮与脯氨酸反应生成黄色化合物，与其它氨基酸生成 的都是紫色化合物。2,4-二硝基氟苯、丹黄酰氯和苯异硫 氰酸酯都能与氨基反应。 蛋白质中的

28、氨基酸残基是通过肽键连接的，残基的序列称 之为蛋白质的一级结构。肽和小的蛋白质可以利用液相或 固相合成法合成。 可以根据蛋白质溶解度、净电荷、大小以及结合特性上的 差异，从生物资源中纯化蛋白质。常用方法包括离子交换 层析、凝胶过滤层析、HPLC、SDS-PAGE、等电聚焦和 双向电泳等方法。 多肽的氨基酸序列可以通过Edman降解确定。利用蛋白 酶和化学试剂有选择地水解，结合Edman降解可确定大 的蛋白质的序列。 比较蛋白质的一级结构可以揭示进化关系，种属的不同常 反映在它们蛋白质的一级结构的差异上。 第四节 蛋白质的高级结构 学习目标 掌握a-螺旋、b-折叠和胶原的结构特征，二级、三级和四

29、级结构概念，维持蛋白质空间结构的主要作用力。 熟悉肌红蛋白和血红蛋白结构特征以及它们的氧饱和曲线和镰刀型细胞贫血病的起因。 大多数蛋白质可以分为两种主要类型：纤维蛋白（Fibrous proteins）和球蛋白（globular proteins）。纤维蛋白的主要 功能是维持和支撑单个的细胞和整个的有机体。a-角蛋白和胶 原蛋白是最常见的纤维蛋白，a-角蛋白是毛发和动物尾巴的主 要成分，而胶原蛋白是腱、皮肤、骨骼和牙齿的主要蛋白成分。 大多数球蛋白是水溶性的、多肽链紧密折叠、轮廓上象一个球 型的大分子。球蛋白典型特征是它有一个疏水的内部环境和一 个亲水的表面. 概 念 蛋白质分子：蛋白质中具有

30、完整生物功能的最 小结构单位。有的包含一条多肽，有的包含多 条多肽。 蛋白质高级结构（构象）：一条或数条多肽链 上所有原子在三维空间中的排布。 构型的改变是由于共价键的变化产生的，构想 的改变是由于单键的旋转产生的。 一、蛋白质的结构层次 由于蛋白质是个生物大分子，结构比 较复杂，所以其结构是通过四种水平 描述的。其中包括蛋白质的一级结构 （primary structure）、二级结构 （secondary structure）、三级结 构（tertiary structure）和四级结 构（quaternary structure）。 X-射线晶体结构分析法能测定晶体中蛋白分子构象；二维核

31、磁共振法能分析水 中蛋白分子构象。 一级结构就是共价连接的氨基酸残基的序列，它描述的是蛋白 质的线性（或一维）结构。蛋白质的三维结构是通过另外三种 水平：二级结构、三级结构和四级结构描述的。形成和维持 （或称之稳定）这三种水平结构的力主要是非共价键。 二级结构是通过肽键中的酰胺氮和羰基氧之间形成的氢键维持 的，通常二级结构指的是a-螺旋和b-折叠。 三级结构是指一条多肽链形成紧密的一个或多个球状单位或结 构域，三级结构的稳定依赖于非相邻的氨基酸残基侧链的相互 作用。 四级结构并不是每个蛋白质都具有的，只有那些由两条或两条 以上多肽链组成的蛋白质才具有四级结构，每一条肽链也称为 亚基，肽链可以是

32、相同的，也可以是不同的。 一般来说纤维蛋白的特性通过它的二级结构就可表现出来，但球蛋白的生物学功能通常都是以三级结构表 现出来的，而某些球蛋白的生物学活性则需要四级结构。 二、肽单位平面结构和二面角 肽单位的特征 二面角 角(dihedral angle)。二 面角决定多肽链主链骨架的 构象。 维持蛋白质分子构象的化学键 氢键 范德华引力 疏水作用力 离子键 二硫键 配位键 二级结构 定义：指多肽链主链在一级结构的基础上进一步 盘旋或折叠形成的有规律构象 维系二级结构的力是氢键。二级结构不涉及氨基 酸残基的侧链构象。 主要类型 -螺旋 -折叠片 -转角（回折） 无规卷曲 -螺旋(-helix)

33、 -折叠 平行 反平行 回折 - 一个氨基酸残基的CO和 第三个氨基酸残基的NH 之间形成氢键，称为31 氢键。 无规卷曲 超二级结构 结构域 SS SS SS S S VM H L CM1 CL 抗原结合部位 补体结合部位 VL CM2 CM3 分子的12个结构域IgG 三级结构 四级结构 寡聚蛋白 次级键 亚基单独没有生物功能 血红蛋白 四亚基两两相同，分别称 为1 、2、1、2； 第五节 多肽、蛋白质结构与功能的关系 一、多肽结构与功能的关系 牛催产素 Cys Tyr Ile Gln Asn Cys Pro Leu Gly NH 2 Cys Tyr Phe Gln Asn Cys Pro

34、 Arg Gly NH 2 . . . SS 123456789 SS 牛加压素 二、同功能蛋白质结构的种属差 异与保守性 细胞色素C一级结构 亲缘关系越远的生物氨基 酸差异越大。 蛋白质的激活 使前体变成活性蛋白的过程，被称为（activation） 胰岛素的激活 w它是最早认识的一种分子病。 流行于非洲，死亡率极高， 大部分患者童年时就夭折， 活过童年的寿命也不长，它 是由于遗传基因突变导致血 红蛋白分子结构的突变。 正常细胞 镰刀形细胞 卟啉铁 -Val-His-Leu-Thr-Pro-Lys - -Val-His-Leu-Thr-Pro-Lys - (了解)由于缬氨酸上的非极性基团与相

35、邻非极性基团 间在疏水力作用下相互靠拢，并引发所在链扭曲为束 状，整个与氧结合功能丧 失， 导致病人窒息甚至死亡， 血红蛋白变构与运输氧功能 在寡聚蛋白分子中， 一个亚基，由于与配 体结合，而发生的构 象变化，引起相邻其 它亚基的构象和与配 体结合的能力亦改变 的现象。 血红蛋白 (R) relaxed state (T) tense state 血中氧分子的运送： Lung Muscle 静脉 动脉 环境氧高时 Hb 快速吸收氧分子 环境氧低时 Hb 迅速释放氧分子 释放氧分子后 Hb 变回 T state 任何一个亚基接受氧分子后，会增进其它亚基吸附氧分子的能力 蛋白质的变性 生物活性丧失

36、；溶解度降低，对于球状蛋白粘度增加；生化反 应易进行；光吸收系数增大；组分和分子量不变。 引起蛋白质变性的主要因素 蛋白质的复性 定义：当变性因素除去后，变性蛋白质又可恢复到天然构象，这一现象称为蛋白 质的复性（renaturation）。 蛋白质变性的预防和利用：医疗方面；食品方面；蛋白质制备；酶制剂保存等。 第六节 蛋白质的物理化学性 质和分离提纯 1 蛋白质的分子量 沉降速度法 ：一种蛋白质分子在单位离心力场里的沉降速度为恒定值， 即沉降系数（S，Svedberg） 凝胶过滤法 仅适用于球状蛋白 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法 它决定于蛋白质分子的大小 2 蛋白质的两性解离和等电点 蛋白质除

37、了肽链末端基团外，还有各种侧链集团，是多价的两性电解质 不同的蛋白质有不同的等电点 电 泳 （electrophoresis） 在直流电场中，带正 电荷的蛋白质分子向 阴极移动，带负电荷 的向阳极移动，这种 现象称为 3 蛋白质的胶体性质 蛋白质分子量已达到胶粒1 100nm范围之内，在水中形 成水溶胶。 胶体稳定的因素 球状蛋白质的表面多亲水基团， 使蛋白质分子形成水化膜，从而 阻止蛋白质颗粒的相互聚集 每个水化球状分子带有相同电荷 由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用 将非蛋白的小分子杂质除去。 ：以半透膜提纯蛋白质的方法叫 ：只允许溶剂小分子通过，而溶质大分子不能通过，如

38、羊皮纸、火棉胶、玻璃纸等 蛋白质的沉淀 等电点沉淀法、盐 析法和有机溶剂沉淀法 ， 可逆沉淀 蛋白质的颜色反应 二个以上的肽键 Tyr的酚基将福林试剂还原 -氨基酸中的氨基和羧基 蛋白质的紫外吸收 二、蛋白质分离纯化的一般步骤 前处理 粗分级 细分级 质量鉴定 几种常见的纯化蛋白质的方法 1 透析方法 通常是将浓缩液装在一个用赛咯吩（cellophane）制造的透析 袋内，两端都密封好，然后将透析袋悬浮在一个装有很多缓冲 液的容器内进行透析（下图）。因为赛咯吩膜是半通透的膜， 蛋白质等大分子不能透过膜，仍然留在袋内，但蛋白质周围的 小分子可以与缓冲液进行交换，通过多次更换透析液，就可除 去小分

39、子（如硫酸铵）。经硫酸铵分级纯化、透析的粗分级的 蛋白质样品可以通过以下一些常用的分离纯化技 2.凝胶层析 凝胶层析是按照蛋白质分子量大小进行分离的技术，又称 之凝胶过滤，分子筛层析或排阻层析。单个凝胶珠本身象 个筛子。不同类型凝胶的筛孔的大小不同。如果将这样 的凝胶装入一个足够长的柱子中，作成一个凝胶柱。当含 有大小不同的蛋白质样品加到凝胶柱上时，比凝胶珠平均 孔径小的蛋白质就要连续不断地穿入珠子的内部，这样的 小分子不但其运动路程长，而且受到来自凝胶珠内部的阻 力也很大，所以越小的蛋白质，把它们从柱子上洗脱下来 所花费的时间越长。凝胶中只有很少的孔径可接受大的蛋 白。因此，大的蛋白质直接通

40、过凝胶珠之间的缝隙首先被 洗脱下来。凝胶过滤所用的凝胶孔径大小的选择主要取决 于要纯化的蛋白质分子量。（下图）给出了凝胶过滤分离 蛋白质的示意图。 3 电泳SDSPAGE SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE） 4 等电聚焦电泳 等电聚焦电泳（Isoelectric focusing electrophoresis, IFE） 等电聚焦电泳是一种电泳的改进技术，实际上是利用聚丙烯酰 胺凝胶内的缓冲液在电场作用下在凝胶内沿电场方向制造一个 pH梯度。所用的缓冲液是低分子量的有机酸和碱的混合物，该 混合物称之两性

41、电解质（ampholytes）。当蛋白质样品在这样 的凝胶上电泳时，每种蛋白质都将迁移至与它的pI 相一致的pH 处（下图），具有不同pI的各种蛋白质最后都迁移至凝胶中相 应的pH处，达到分离的目的。 5 双向电泳 双向电泳（two-dimensional electrophoresis） 如果将等电聚焦电泳与SDS-PAGE结合起来，就是分辨率 更高的一种双向电泳了（下图）。双向电泳后的凝胶经染色蛋 白呈现二维分布图，水平方向反映出蛋白在pI上的差异，而垂 直方向反映出它们在分子量上的差别。所以双向电泳可以将分 子量相同而等电点不同的蛋白质以及等电点相同而分子量不同 的蛋白质分开。 3.离子

42、交换层析 离子交换层析，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有 正电荷的称之阴离子交换树脂；而带有负电荷的称之阳离子树 脂。离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化。由于蛋白 质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也 不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋 白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施， 将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被 洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结 合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液 的pH值洗脱下来。 第七节 蛋白质分类 从蛋白质形状上分为 球状蛋白质 纤维状蛋白质

43、 从组成上可分为 单纯蛋白质(分子中只含氨基酸残基) 清蛋白(又名白蛋白)、球蛋白、谷蛋白、醇溶谷蛋白、精蛋白、组蛋白、 硬蛋白等。 结合蛋白质(分子中除氨基酸外还有非氨基酸物质，后者称辅基) 核蛋白、磷蛋白、金属蛋白、色蛋白等。 名词术语 构型（configuration）： 一个有机分子中各个原子特有的固定的空间排列。这种排列不 经过共价键的断裂和重新形成是不会改变的。构型的改变往往使分 子的光学活性发生变化。 构象（conformation）： 指一个分子中，不改变共价键结构，仅单键周围的原子旋转所 产生的原子的空间排布。一种构象改变为另一种构象时，不要求共 价键的断裂和重新形成。构象改

44、变不会改变分子的光学活性。 肽单位（peptide unit）： 又称之肽基（peptide group），是肽链主链上的重复结构。 是由参与肽键形成的氮原子和碳原子和它们的4个取代成分：羰基氧 原子、酰胺氢原子和两个相邻的-碳原子组成的一个平面单位。 蛋白质二级结构（protein secondary structure）: 在蛋白质分子中的局部区域内氨基酸残基的有规则的排列，常见的二 级结构有-螺旋和-折叠。二级结构是通过骨架上的羰基和酰胺基团之 间形成的氢键维持的。 蛋白质三级结构（protein tertiary structure）: 蛋白质分子处于它的天然折叠状态的三维构象。三级结

45、构是在二级结 构的基础上进一步盘绕、折叠形成的。三级结构主要是靠氨基酸侧链之间 的疏水相互作用、氢键范德华力和盐键（静电作用力）维持的。 蛋白质四级结构（quaternary structure）: 多亚基蛋白质的三维结构。实际上是具有三级结构的多肽链（亚基） 以适当方式聚合所呈现出的三维结构。 -螺旋(-helix)： 蛋白质中常见的一种二级结构，肽链主链绕假想的中心轴盘绕成螺旋 状，一般都是右手螺旋结构，螺旋是靠链内氢键维持的。每个氨基酸残基 （第n个）的羰基氧与多肽链C端方向的第4个残基（第n4个）的酰胺氮 形成氢键。在典型的右手-螺旋结构中，螺距为0.54nm，每一圈含有3.6 个氨基

46、酸残基，每个残基沿着螺旋的长轴上升0.15nm。 -折叠(-sheet)： 是蛋白质中的常见的二级结构，是由伸展的多肽链组成的。折叠片的 构象是通过一个肽键的羰基氧和位于同一个肽链或相邻肽链的另一个酰胺 氢之间形成的氢键维持的。氢键几乎都垂直伸展的肽链，这些肽链可以是 平行排列（走向都是由N到C方向）；或者是反平行排列（肽链反向排列）。 -转角（-turn）: 也是多肽链中常见的二级结构，连接蛋白质分子中的二级结构（-螺 旋和-折叠），使肽链走向改变的一种非重复多肽区，一般含有216个 氨基酸残基。含有5个氨基酸残基以上的转角又常称之环（loops）。常见 的转角含有4个氨基酸残基，有两种类型

47、。转角I的特点是：第1个氨基酸残 基羰基氧与第4个残基的酰胺氮之间形成氢键；转角II的第3个残基往往是 甘氨酸。这两种转角中的第2个残基大都是脯氨酸。 超二级结构（super-secondary structure）： 也称之基元（motif）。在蛋白质中，特别是球蛋白 中，经常可以看到由若干相邻的二级结构单元组合在一起， 彼此相互作用，形成的有规则、在空间上能辨认的二级结 构组合体。 结构域(domain)： 在蛋白质三级结构内的独立折叠单元。结构域通常都 是几个超二级结构单元的组合。 纤维蛋白(fibrous proteins)： 一类主要的不溶于水的蛋白质，通常都含有呈现相同 二级结构的

48、多肽链。许多纤维蛋白结合紧密，并为单个细 胞或整个生物体提供机械强度，起着保护或结构上的作用。 球蛋白(globular proteins)： 一类蛋白质，许多都溶于水，球蛋白是紧凑的、近似 球形的、含有折叠紧密的多肽链。典型的球蛋白含有能特 异识别和结合其它化合物的凹陷或裂隙部位。 疏水相互作用(hydrophobic interaction)： 非极性分子之间的一种弱的、非共价的相互作用。这些非极性分子（如一些中性氨 基酸残基，也称之疏水残基）在水相环境中具有避开水而相互聚集的倾向。 伴娘蛋白（chaperone）(了解)： 与一种新合成的多肽链形成复合物并协助它正确折叠成具有生物功能构象

49、的蛋白质。 伴娘蛋白可以防止不正确折叠中间体的形成和没有组装的蛋白亚基的不正确的聚集，协 助多肽链跨膜转运以及大的多亚基蛋白质的组装和解体。 二硫键（disulfide bond）： 通过两个（半胱氨酸）巯基的氧化形成的共价键。二 硫键在稳定某些蛋白的三维结构上起着重要的作用。 范德华力（van der Waals force）： 中性原子之间通过瞬间静电相互作用产生的一种弱的 分子之间的力。当两个原子之间的距离为它们的范德华半 径之和时，范德华引力最强。强的范德华排斥作用可以防 止原子相互靠近。 蛋白质变性（denaturation）： 生物大分子的天然构象遭到破坏导致其生物活性丧失 的现象

50、。蛋白质在受到光照、热、有机溶剂以及一些变性 剂的作用时，次级键受到破坏，导致天然构象的破坏，使 蛋白质的生物活性丧失。 复性（renaturation）： 在一定的条件下，变性的生物大分子恢复成具有生物活性的天 然构象的现象。 血红蛋白（hemoglobin）： 是由含有血红素辅基的4个亚基组成的寡聚蛋白。血红蛋白负责 将氧由肺运输到外周组织，它的氧饱和曲线为S型。 波尔效应（Bohr effect）(了解)： CO2浓度的增加降低细胞内的pH，引起红细胞内血红蛋白的氧 亲和力下降的现象。 别构效应（allosteric effect）： 又称之变构效应。是寡聚蛋白与配基结合改变蛋白质的构象

51、， 导致蛋白质生物活性改变的现象。 镰刀型细胞贫血病（sickle-cell anemia）：血红蛋白分子遗传缺 陷造成的一种疾病，病人的大部分红细胞呈镰刀状。其特点是病人 的血红蛋白-亚基N端的第6个氨基酸残基是缬氨酸，而不是正常的 谷氨酸残基。 蛋白质可以分为纤维蛋白和球蛋白。纤维蛋白一般都不溶于水，有 一定的强度，具有简单重复的二级结构元件，在生物体内主要起着 结构构件的作用。球蛋白是水溶性的，具有更复杂的三级结构，在 一条多肽链中都含有几种类型的二级结构，多肽链折叠紧凑，疏水 氨基酸残基一般都位于球蛋白的内部，外形大致呈球状的大分子。 多肽链中相邻氨基酸残基通过肽键连接，肽键具有部分双键特性， 所以整个肽单位是一个极性的平面结构。由于立体上的限制，肽键 的构型大都是反式构型。绕N-C和C-C键的旋转赋予了多肽链构 象上的柔性。 蛋白质结构水平分为四级，一级结构指的是氨基酸序列，二级结构 是指在局部肽段中相邻氨基酸的空间关系，三级结构是整个多肽链 的三维构象，四级结构是指能稳定结合的两条或两条以上多肽链 （亚基）的空间关系。蛋白质具有有基因确定的唯一的氨基酸序列， 一级结构决定了蛋白质的构象。 小 结 蛋白质存在几种不同的二级结构，其中包括-螺旋，