基因工程的原理和技术[专业技术]

1、1 遗传效应是指能转录为遗传效应是指能转录为mRNA，继而翻译为蛋，继而翻译为蛋 白质，或转录为核糖体白质，或转录为核糖体RNA、转运、转运RNA的功能。的功能。 什么是遗传效应？什么是遗传效应？ 2讲课课件 蛋白质蛋白质DNA基因基因 线性排列线性排列 脱氧核苷酸脱氧核苷酸 磷酸基脱氧核糖含氮碱基磷酸基脱氧核糖含氮碱基 遗传物质的遗传物质的 主要载体主要载体 （DNADNA的基本单位）的基本单位） 基因、基因、DNA、染色体、脱氧核苷酸的关系、染色体、脱氧核苷酸的关系 3讲课课件 RNA聚合酶聚合酶 结合位点结合位点 编码区：能转录为相应的编码区：能转录为相应的mRNA进而指导蛋白质的进而指

2、导蛋白质的 合成。合成。 非编码区：不能转录为相应的非编码区：不能转录为相应的mRNA但有调控遗传但有调控遗传 信息表达的核苷酸序列，位于编码区的信息表达的核苷酸序列，位于编码区的 上游和下游。上游和下游。 4讲课课件 区分：启动子与起始密码区分：启动子与起始密码 终止子与终止密码终止子与终止密码 起始密码起始密码终止密码终止密码 启动子启动子 终止子终止子 ATC 基因基因 转录区转录区 TAA 转录转录 ATC 转录转录 起始点起始点 翻译翻译 起始点起始点 转录转录 终止点终止点 RNA起点起点 RNA终点终点 5讲课课件 RNA聚合酶聚合酶 结合位点结合位点 外显子外显子内含子内含子

3、信使信使RNA 成熟的信使成熟的信使RNA 6讲课课件 7讲课课件 8讲课课件 为什么要有这一步为什么要有这一步 9讲课课件 主要是指主要是指的基因，例如的基因，例如，与生物与生物 抗逆性抗逆性相关的基因相关的基因、与与优良品质、生物药物优良品质、生物药物 和保健品、毒物降解以及工业用酶相关的基和保健品、毒物降解以及工业用酶相关的基 因因等等，也可以是一些具有，也可以是一些具有的因子。的因子。 10讲课课件 11讲课课件 12讲课课件 13讲课课件 文库类型文库类型cDNAcDNA文库文库基因组文库基因组文库 文库大小文库大小 基因中有无启动子基因中有无启动子 基因中有无内含子基因中有无内含子

4、 基因多少基因多少 物种间的基因交流物种间的基因交流 小小大大 无无 无无 有有 有有 可以可以部分基因可以部分基因可以 某种生物的某种生物的 部分基因部分基因 某种生物的某种生物的 全部基因全部基因 14讲课课件 v就像从图书馆借一本书，要知道书名、就像从图书馆借一本书，要知道书名、 作者、出版社或人物情节等信息一样作者、出版社或人物情节等信息一样 v获取目的基因前，要对这个基因的背景获取目的基因前，要对这个基因的背景 有一定程度的了解，（如核苷酸序列、有一定程度的了解，（如核苷酸序列、 基因的功能、位置以及基因的表达产物基因的功能、位置以及基因的表达产物 的特性等）然后通过恰当的技术手段将

5、的特性等）然后通过恰当的技术手段将 目的基因从基因文库中调取出来。目的基因从基因文库中调取出来。 15讲课课件 获取目的基因方法：获取目的基因方法： 利用利用PCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因 全称是：全称是：应应，在生物，在生物复制复制 的核酸合成技术。可以在短时间内大量扩增的目的基因。的核酸合成技术。可以在短时间内大量扩增的目的基因。 16讲课课件 DNA DNA复制的过程涉及复制的过程涉及。通常将。通常将DNADNA的羟基的羟基 （-OH-OH）末端称为）末端称为，而磷酸基团的末端称为，而磷酸基团的末端称为 5端端 3端端 3端端 5端端 17讲课课件 3端端 5端端 5端端3端端

6、18讲课课件 DNADNA聚合酶不能从头开始合成聚合酶不能从头开始合成DNADNA，只能从，只能从3 3端端 延伸延伸DNADNA链。因此，链。因此，DNADNA复制需要复制需要。当引物与。当引物与DNADNA 母链通过碱基互补配对结合后，母链通过碱基互补配对结合后，DNADNA聚合酶就能从引聚合酶就能从引 物的物的3 3端开始延伸端开始延伸DNADNA链。链。 DNADNA的合成方向总是从子链的的合成方向总是从子链的端向端向端延伸端延伸 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 35 19讲课课件 DNA复制的过程复制的过程 1.1.解旋解旋: :利用细胞提供的能量利用细胞提供

7、的能量 边解旋、边复制边解旋、边复制 2.2.配对配对: :分别以每条单链为模分别以每条单链为模 板板, ,以四种游离的脱氧核以四种游离的脱氧核 苷酸为原料苷酸为原料, ,利用碱基互利用碱基互 补配对原则合成两条新的补配对原则合成两条新的 子链子链 3.3.螺旋：两条子链分别与对应螺旋：两条子链分别与对应 的模板链绕成螺旋型，构的模板链绕成螺旋型，构 成两个新的成两个新的DNADNA分子分子 20讲课课件 思考：思考： DNA复制需要哪些成分和反应条件？复制需要哪些成分和反应条件？ 如何在体外设置一个类似的如何在体外设置一个类似的DNA复制环境？复制环境？ 参与的组分参与的组分在在DNA复制中

8、的作用复制中的作用 解旋酶解旋酶打开打开DNA双链双链 DNA母链（模板链）母链（模板链）提供提供DNA复制的模板复制的模板 4种脱氧核糖核苷酸种脱氧核糖核苷酸合成子链的原料合成子链的原料 DNA聚合酶聚合酶催化合成催化合成DNA子链子链 引物引物 使使DNA聚合酶能够从聚合酶能够从3端开始连接端开始连接 脱氧核苷酸脱氧核苷酸 21讲课课件 DNADNA双链复制的原理双链复制的原理（遵循（遵循原则）原则） 含待扩增目的基因片段的含待扩增目的基因片段的； 根据目的基因双链各一端序列片段合成根据目的基因双链各一端序列片段合成 与两条模板链相结合的与两条模板链相结合的； 要有要有； 四种单核苷酸（四

9、种单核苷酸（）。）。 DNADNA热变性的原理热变性的原理 前提条件：有一段已知目的基因的核苷酸序列前提条件：有一段已知目的基因的核苷酸序列 22讲课课件 55-60 ：加热至：加热至 ， DNA片段片段受热后受热后 断裂，形成断裂，形成 ：冷却至冷却至， 引物结合到互补引物结合到互补DNA链；链； ：加热至：加热至， 耐热的耐热的从引物从引物 起始引导互补链的合成。起始引导互补链的合成。 目的基因以目的基因以方式扩增，即方式扩增，即 23讲课课件 获取目的基因方法获取目的基因方法 DNA合成仪用化学方法直接人工合成合成仪用化学方法直接人工合成 24讲课课件 为什么要有这一步为什么要有这一步

10、25讲课课件 26讲课课件 目的基因目的基因 标记基因 27讲课课件 质粒质粒DNADNA分子分子 两个切口两个切口 获得目的基因获得目的基因 重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒） 同种同种 一个切口一个切口 两个黏性末端两个黏性末端 为什么不能将目的基因直为什么不能将目的基因直 接导入受体细胞？接导入受体细胞？ 通过通过cDNAcDNA文库获得的目的文库获得的目的 基因有启动子和终止子吗？基因有启动子和终止子吗？ 在构建表达载体（重组在构建表达载体（重组DNADNA分子）过程中需要分子）过程中需要 什么分子工具？什么分子工具？ 只考虑两两结合，可产生只考虑两两结合，可产生 几

11、种重组几种重组DNADNA分子？分子？ 28讲课课件 为什么要有这一步为什么要有这一步 29讲课课件 目的基因进入受体细胞内，并在受体目的基因进入受体细胞内，并在受体 细胞中维持稳定和表达的过程，称为细胞中维持稳定和表达的过程，称为 动植物细胞和动植物细胞和、枯草杆菌、枯草杆菌、 酵母菌等微生物。酵母菌等微生物。 借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。 30讲课课件 v农杆菌特点：生活在土壤中，能够在自然条件下感农杆菌特点：生活在土壤中，能够在自然条件下感 染染植物和植物和植物，受植物体伤口处的细胞植物，受植物体伤口处的细胞 分泌的分泌的大量大量的吸引，农杆菌中的的吸引，

12、农杆菌中的 上的上的可转移至受体细胞，并整合到受体细胞可转移至受体细胞，并整合到受体细胞 上。上。 1 1）将目的基因导入植物细胞）将目的基因导入植物细胞 a.农杆菌转化法（采用最多的方法）农杆菌转化法（采用最多的方法） v 原理：将原理：将插入到插入到，通过农杆菌转化，通过农杆菌转化 ，使目的基因进入植物细胞，并将其插入到植物细胞，使目的基因进入植物细胞，并将其插入到植物细胞 上。使目的基因的遗传特性得以稳定的维持和表达。上。使目的基因的遗传特性得以稳定的维持和表达。 v 优点及应用：此法比较经济和有效，约优点及应用：此法比较经济和有效，约80%的转基因植物都是的转基因植物都是 通过这种方法

13、获得。通过这种方法获得。 31讲课课件 v我国科学家独创的一种方法我国科学家独创的一种方法 v实例：实例：我国的我国的 v（1）常用于常用于 的基因的基因转化转化 v（2）缺点：缺点： 基因枪法基因枪法 花粉管通道法花粉管通道法 32讲课课件 2 2）将目的基因导入动物细胞）将目的基因导入动物细胞 提纯基因表达载体提纯基因表达载体 体外显微注射入受精卵体外显微注射入受精卵 经胚胎早期培养后经胚胎早期培养后 移植到雌性体内移植到雌性体内 受体细胞：受体细胞： 显微注射技术显微注射技术 基本操作程序：基本操作程序： 受精卵受精卵 最常用的方法最常用的方法: 33讲课课件 34讲课课件 思考思考4:

14、利用大肠杆菌能生产人的糖蛋白吗利用大肠杆菌能生产人的糖蛋白吗? v有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链, 这些糖链是在内质网和高尔基体上加这些糖链是在内质网和高尔基体上加 工完成工完成.大肠杆菌是原核生物大肠杆菌是原核生物,不存在这不存在这 两种细胞器两种细胞器,因此在大肠杆菌生产这种因此在大肠杆菌生产这种 糖蛋白是不可能的糖蛋白是不可能的. 35讲课课件 1.1.将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞 农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法 2.2.将目的基因导入动物细胞将目的基因导入动物细胞 显微注射技术显微注射技术（最多、最有效）（最多、最有效） 3.

15、3.将目的基因导入微生物细胞将目的基因导入微生物细胞 Ca2+处理处理 花粉管通道法花粉管通道法 36讲课课件 为什么要有这一步为什么要有这一步 37讲课课件 38讲课课件 39讲课课件 40讲课课件 是一小段单链是一小段单链DNADNA或者或者RNARNA片段（片段（约约2020到到500bp500bp），）， 用于检测与其互补的核酸序列。用于检测与其互补的核酸序列。 根据重组质粒上目的基因的部分根据重组质粒上目的基因的部分DNADNA序列，人工合成序列，人工合成 （或（或PCRPCR技术合成）与之互补的一小段单链技术合成）与之互补的一小段单链DNADNA（或（或RNA) ,RNA) , 利

16、用带有利用带有32P-32P-磷酸的磷酸的dATPdATP使其标记上放射性同位素，这一使其标记上放射性同位素，这一 小段与目的基因的部分序列互补的核酸分子称为小段与目的基因的部分序列互补的核酸分子称为DNADNA探针探针。 互补碱基序列的互补碱基序列的DNADNA分子，可以通过碱基对之分子，可以通过碱基对之 间形成氢键等，形成稳定的双链区。间形成氢键等，形成稳定的双链区。 DNADNA分子杂交的双方是所使用的分子杂交的双方是所使用的和和 DNADNA分子杂交的理论基础是：分子杂交的理论基础是： 41讲课课件 基因探针与目的基因杂交，观察标记有无基因探针与目的基因杂交，观察标记有无 杂交带杂交带

17、 42讲课课件 将标记的核酸探针与将标记的核酸探针与的核酸的核酸 进行杂交进行杂交 43讲课课件 44讲课课件 分子分子 水平水平 检测检测 45讲课课件 46讲课课件 以上检测是以上检测是水平，有时还需进行水平，有时还需进行 水平的鉴定，如对植物的抗虫抗病水平的鉴定，如对植物的抗虫抗病 特性的鉴定等。特性的鉴定等。 47讲课课件 是否赋予个体新的遗传特性是否赋予个体新的遗传特性 分子分子 水平水平 检测检测 48讲课课件 基基 因因 工工 程程 的的 基基 本本 操操 作作 程程 序序 1 1、目的基因的获取、目的基因的获取 2 2、形成重组、形成重组DNADNA分子；分子； 3 3、将目的

18、基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞 4 4、筛选含有目的基因的受体细胞、筛选含有目的基因的受体细胞、 目的基因表达目的基因表达 1、从基因文库中获取目的基因、从基因文库中获取目的基因 2、利用、利用PCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因 3、化学方法人工合成、化学方法人工合成 农杆菌转化法、基因枪法、显微注射法、农杆菌转化法、基因枪法、显微注射法、CaCa2+ 2+处理法 处理法 DNADNA分子杂交技术、抗原分子杂交技术、抗原抗体杂交技术抗体杂交技术 分子检测外的个体水平鉴定分子检测外的个体水平鉴定 49讲课课件 50讲课课件 将目的基因插人土壤农杆菌的质粒，构建表达载体，将目的基因插

19、人土壤农杆菌的质粒，构建表达载体， 通过农杆菌的转化导人香蕉受体细胞，成功转化的通过农杆菌的转化导人香蕉受体细胞，成功转化的 香蕉细胞通过组织培养形成植株。香蕉细胞通过组织培养形成植株。 生态安全问题包括：生态安全问题包括： 外源基因扩散到其他物种（外源基因漂移）；外源基因扩散到其他物种（外源基因漂移）； 转基因植株扩散影响生态系统的结构和功能；转基因植株扩散影响生态系统的结构和功能； 转基因植株扩散对生物多样性的影响；转基因植株扩散对生物多样性的影响； 转基因植物残体或分泌物对环境的影响。转基因植物残体或分泌物对环境的影响。 如何利用目的基因，通过转基因技术获得抗寒能力如何利用目的基因，通过

20、转基因技术获得抗寒能力 提高的香蕉植株？在运用转基因香蕉的过程中，在提高的香蕉植株？在运用转基因香蕉的过程中，在 生态安全方面可能会出现什么问题？（列举两点）生态安全方面可能会出现什么问题？（列举两点） 51讲课课件 成熟的编码蛋白成熟的编码蛋白 的的mRNAmRNA分子分子 加入逆转录酶，反转录加入逆转录酶，反转录 mRNAmRNA，合成一条与其互，合成一条与其互 补的补的DNADNA单链分子单链分子 在在DNADNA聚合酶的作用下，聚合酶的作用下， 以第一条以第一条DNADNA单链为模单链为模 板合成第二条单链板合成第二条单链 52讲课课件 53讲课课件 RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结

21、合位点 非编码区非编码区编码区编码区非编码区非编码区 外显子外显子外显子外显子内含子内含子内含子内含子外显子外显子 A B BC CD DE E 真核生物基因的结构真核生物基因的结构 A AB BC CD DE E A AC CE E 加工加工 翻译翻译 初级初级RNARNA mRNAmRNA 蛋白质（多肽）蛋白质（多肽） 基因控制蛋白质的合成基因控制蛋白质的合成 转录转录 54讲课课件 所谓所谓是指一种全体的集合是指一种全体的集合 则是指某一生物全部基因的集合。则是指某一生物全部基因的集合。 构建基因文库的意义不只是使生物的遗传信息构建基因文库的意义不只是使生物的遗传信息 以稳定的重组体形式贮存起来，更重要的是它是以稳定的重组体形式贮存起来，更重要的是它是 的主要