基因工程原理与技术植物基因工程

1、植物基因工程植物基因工程 1983年，首次获得转基因植物年，首次获得转基因植物转基因烟草转基因烟草 现在，已获得现在，已获得200多种植物的转基因植株。多种植物的转基因植株。 第一节第一节 农杆菌及其转化体系农杆菌及其转化体系 一、根癌农杆菌一、根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciences)的生物学特征的生物学特征 1、形态、形态 细胞呈杆状，大小为细胞呈杆状，大小为 0.8 um 1.53.0um，14根周生根周生 鞭毛，菌落无色、光滑。鞭毛，菌落无色、光滑。 2、生长条件、生长条件 最适温度：最适温度：2530，28培养；最适培养；最适pH：6.09.0 3、宿主植物

2、、宿主植物 双子叶植物、裸子植物双子叶植物、裸子植物 4、侵染宿主的症状及原因、侵染宿主的症状及原因 冠瘿瘤，冠瘿瘤，Ti质粒质粒(tumor inducing plasmid)的的T-DNA。 T-DNA是指农杆菌质粒上一段能转移并整合到植物染色是指农杆菌质粒上一段能转移并整合到植物染色 体上的体上的DNA片段。片段。 二、二、Ti质粒的结构和功能质粒的结构和功能 1、Ti质粒的类型与分区质粒的类型与分区 环状双链环状双链 DNA分子，分子， 140235 kb。 根据其诱导植物细胞产生冠瘿碱的种类，分为根据其诱导植物细胞产生冠瘿碱的种类，分为章鱼碱型章鱼碱型、 胭脂碱型胭脂碱型、农杆碱型农

3、杆碱型、农杆菌素碱型农杆菌素碱型(琥珀碱型琥珀碱型)。 功能区功能区 毒性区(Vir区) T-DNA区 接合转移区 复制起始区 致毒区 Ti 质粒复制起始点 冠瘿碱代谢 酶编码基因 与 Ti 质粒转移功能 有关的遗传座位 冠瘿碱合成基因 T-DNA 区 右边界 生长素合成基因 细胞分裂素合成基因 左边界 章鱼碱型章鱼碱型 2、T-DNA的结构与功能的结构与功能 边界序列：边界序列：25bp，TGACACGATATATTGGCGGGTAAAC 右边界序列是完全保守的，对右边界序列是完全保守的，对T-DNA转移是必须的。转移是必须的。 T-DNA的编码基因 3、Vir区的结构与功能区的结构与功能

4、3040 kb，有，有virAvirM等操纵子。等操纵子。 virA操纵子操纵子：组成型，长约为：组成型，长约为2.8kb，virA基因。基因。VirA蛋蛋 白白(92kD)是内膜受体蛋白，感应并结合酚类化合物是内膜受体蛋白，感应并结合酚类化合物(乙酰丁香乙酰丁香 酮，酮，AS)，是一种，是一种自激酶并使自激酶并使VirG蛋白蛋白磷酸化而被激活。磷酸化而被激活。 virG操纵子操纵子：组成型，：组成型，1.0kb，virG基因。基因。VirG蛋白蛋白(30kD) 为转录激活因子，诱导其他为转录激活因子，诱导其他vir基因的表达。基因的表达。 virB操纵子操纵子：诱导型，：诱导型，virB1v

5、irB11基因。基因。VirB蛋白构成蛋白构成 跨膜复合体跨膜复合体(T-链复合体运输器链复合体运输器)供供T-DNA越膜转移。越膜转移。 virC操纵子操纵子：诱导型，：诱导型，virC1、virC2基因。基因。VirC1蛋白与蛋白与 超驱动序列超驱动序列(离右边界外侧离右边界外侧17bp处的一个处的一个24bp的保守序列的保守序列)结结 合，促进合，促进T-DNA加工。加工。 virD操纵子操纵子：诱导型，：诱导型，virD1virD4基因。基因。 VirD1(16kD)、 VirD2(47kD)蛋白参与蛋白参与T-DNA加工形成加工形成T-链链：首先：首先VirD1与与 25bp边界序列

6、亲和结合，使其松弛，然后使边界序列亲和结合，使其松弛，然后使VirD2在特异位在特异位 点剪切。点剪切。VirD2与与T-链的链的5端共价结合，并核定位信号，将端共价结合，并核定位信号，将T- 链复合体导向细胞核。链复合体导向细胞核。 virE操纵子操纵子：诱导型，：诱导型，virE1、virE2基因。基因。VirE2蛋白蛋白 (60.5kD)是是ssDNA结合蛋白，与结合蛋白，与T-链结合，参与链结合，参与T-链复合体形链复合体形 成，还具有核定位信号，引导成，还具有核定位信号，引导T-链复合体进入植物细胞核。链复合体进入植物细胞核。 virF操纵子操纵子：诱导型，：诱导型，virF基因。基

7、因。 VirF蛋白蛋白(23kD)参与参与T- 链复合体的运输。链复合体的运输。 virH操纵子操纵子：诱导型，：诱导型，virH1、virH2基因。基因。VirH蛋白功能蛋白功能 是是降解植物伤口细胞产生的杀菌物质。降解植物伤口细胞产生的杀菌物质。 三、三、T-DNA转移至植物细胞的机理转移至植物细胞的机理(农杆菌介导转化的机理农杆菌介导转化的机理) 植物创伤反应与农杆菌对植物细胞的识别和附着；植物创伤反应与农杆菌对植物细胞的识别和附着； 信号分子的释放积累与信号分子的释放积累与VirA蛋白的感应；蛋白的感应； VirG蛋白激活与蛋白激活与vir基因的诱导表达；基因的诱导表达； T-链复合体

8、的形成；链复合体的形成； T-链链是指是指vir基因被诱导表达后加工基因被诱导表达后加工T-DNA而产生的而产生的 单链单链T-DNA。 T-链复合体链复合体是指结合了是指结合了VirD2、VirE2蛋白的蛋白的T-链。链。 T-链复合体的跨膜转运；链复合体的跨膜转运； 通过通过T-链复合体运输器链复合体运输器和和T菌毛菌毛进入植物细胞进入植物细胞。 T-DNA整合到植物染色体上。整合到植物染色体上。 四、四、Ti质粒的改造与转化载体系统的构建质粒的改造与转化载体系统的构建 野生型野生型Ti质粒质粒不能直接作为不能直接作为植物转化载体植物转化载体： Ti质粒分子过大，没有单一的限制性内切酶位点

9、，基质粒分子过大，没有单一的限制性内切酶位点，基 因操作困难，不能直接将外源基因插入其因操作困难，不能直接将外源基因插入其T-DNA中；中； T-DNA区的区的onc基因产物将干扰受体植物内源激素的基因产物将干扰受体植物内源激素的 平衡，导致冠瘿瘤的产生，阻碍细胞的分化和植株的再生；平衡，导致冠瘿瘤的产生，阻碍细胞的分化和植株的再生； 现已现已通过中间载体途径构建许多通过中间载体途径构建许多植物转化载体系统植物转化载体系统，主，主 要有要有共整合载体系统共整合载体系统、双元载体系统双元载体系统、隔端载体系统隔端载体系统。 1、共整合载体系统、共整合载体系统(cointegrate vector

10、 system) 由由卸甲卸甲Ti质粒载体质粒载体、中间表达载体中间表达载体组成。组成。 例如：例如：pGV3850、 pLGVneo1103 Ampr pLGVneo1103 Cointegrate plasmid 2、双元载体系统、双元载体系统(binary vector system) 由由微型质粒微型质粒、辅助辅助 Ti质粒质粒组成。组成。 例如：例如：Bin19、pAL4404 双元载体系统比共整合载体系统更优越双元载体系统比共整合载体系统更优越：插入外源插入外源 基因的操作较简单；基因的操作较简单； 转化效率较高。转化效率较高。 lacZ 3、隔端载体系统、隔端载体系统 与共整合载

11、体系统一样，由卸甲与共整合载体系统一样，由卸甲Ti质粒载体和中间表达质粒载体和中间表达 载体通过同源重组共整合成转化载体，但与基因转移相关载体通过同源重组共整合成转化载体，但与基因转移相关 的的T-DNA左右边界序列分别位于两个载体上。左右边界序列分别位于两个载体上。 共整合载体系统和隔端 载体系统统称为一元载体系 统或顺式载体系统。 双元载体系统也称为反 式载体系统。 五、五、Ri质粒载体系统质粒载体系统 发根农杆菌发根农杆菌(Agrobacterium rhiizogenes) Ri质粒分为农杆碱型、甘露碱型、黄瓜碱型质粒分为农杆碱型、甘露碱型、黄瓜碱型 Ri质粒的质粒的Vir区与区与Ti

12、质粒的高度同源，质粒的高度同源，T-DNA区的边界区的边界 序列与序列与Ti质粒的高度同源，只含有编码与生长素合成有关质粒的高度同源，只含有编码与生长素合成有关 的酶的酶(iaaM和和iaaH)和与冠瘿碱合成有关的酶，不具细胞分和与冠瘿碱合成有关的酶，不具细胞分 裂素合成相关的基因。裂素合成相关的基因。 共整合载体系统 双元载体系统 Ri质粒载体系统 第二节第二节 目的基因的导入植物目的基因的导入植物 一、植物转化受体系统及其考虑因素一、植物转化受体系统及其考虑因素 建立一个高效再生体系是植物遗传转化的关键。建立一个高效再生体系是植物遗传转化的关键。 1、植物转化受体系统、植物转化受体系统 植

13、物转化受体系统植物转化受体系统是指用于植物遗传转化的再生体系或是指用于植物遗传转化的再生体系或 繁殖体系。繁殖体系。 植物转化的受体系统 愈伤组织受体系统 原生质体受体系统 胚状体受体系统 直接分化受体系统 生殖细胞受体系统 2、建立植物转化受体系统的主要考虑因素、建立植物转化受体系统的主要考虑因素 具有稳定的外植体来源具有稳定的外植体来源； 具有高效稳定的再生能力具有高效稳定的再生能力； 具有较好的遗传稳定性具有较好的遗传稳定性； 对选择性抗生素敏感对选择性抗生素敏感。 二、植物基因转移的方法二、植物基因转移的方法 1、农杆菌介、农杆菌介导法导法 一般程序一般程序：制备工程农杆菌侵染液：制备

14、工程农杆菌侵染液 农杆菌侵染外植体农杆菌侵染外植体 共培养共培养 筛选与分化培养筛选与分化培养 获得抗性植株获得抗性植株 分子检测分子检测 转基因植株转基因植株 1、工程农杆菌的制备、工程农杆菌的制备 把构建好的中间载体导入到农杆菌的方法：把构建好的中间载体导入到农杆菌的方法： 三亲交配法三亲交配法 含有中间载体质粒的大肠杆菌、含有迁含有中间载体质粒的大肠杆菌、含有迁 移质粒的大肠杆菌、含有移质粒的大肠杆菌、含有Ti质粒的农杆菌质粒的农杆菌 直接转化法直接转化法 如电击法、液氮冷冻法。效率低，但简如电击法、液氮冷冻法。效率低，但简 单、快速。单、快速。 2、农杆菌转化植物的操作方法、农杆菌转化

15、植物的操作方法 整株感染法整株感染法 创伤整株感染法、非创伤整株感染法创伤整株感染法、非创伤整株感染法 优点：优点：免去了组织培养过程，操作简单。免去了组织培养过程，操作简单。 外植体转化法外植体转化法 如：叶盘转化法、子叶柄转化法、原生质体转化法如：叶盘转化法、子叶柄转化法、原生质体转化法 叶盘转化法 2、基因枪法、基因枪法 (微弹轰击法微弹轰击法、粒子轰击法粒子轰击法) 原理原理 利用火药爆炸、高压利用火药爆炸、高压 放电或高压气体作驱动力放电或高压气体作驱动力， 将载有外源将载有外源DNA的金粉的金粉(钨钨 粉粉)等金属微粒加速射入受等金属微粒加速射入受 体细胞，从而将外源体细胞，从而将

16、外源DNA 分子导入细胞并实现转化。分子导入细胞并实现转化。 基因枪的类型基因枪的类型 火药爆炸基因枪火药爆炸基因枪(1987年年 Sanfrod等等)：污染、可控性低：污染、可控性低 高压气体基因枪高压气体基因枪(杜邦公司的杜邦公司的PDS-1000HE型型)：无污染、：无污染、 可控性较高可控性较高 高压放电基因枪高压放电基因枪：无污染，可控性最高：无污染，可控性最高 操作步骤操作步骤 a、受体细胞或组织的预处理；、受体细胞或组织的预处理； 高渗高渗(甘露醇、山梨醇甘露醇、山梨醇)培养培养 b、DNA微弹的制备；微弹的制备； 钨粉微粒的直径一般为钨粉微粒的直径一般为0.71um，金粉微粒的

17、直径一，金粉微粒的直径一 般为般为11.6um。金粉对细胞的伤害、毒性小，但较贵。金粉对细胞的伤害、毒性小，但较贵。 c、受体材料的轰击；、受体材料的轰击； 根据基因枪操作说明选择适当大小外植体、装配根据基因枪操作说明选择适当大小外植体、装配DNA 微弹等。微弹等。无菌操作无菌操作 d、过渡培养与筛选培养、过渡培养与筛选培养 过渡培养：无选择、高渗培养，过渡培养：无选择、高渗培养，12周周 3、花粉管通道法、花粉管通道法 花粉管通道法是利用植物受精过程中形成的花粉管通道花粉管通道法是利用植物受精过程中形成的花粉管通道 将外源将外源DNA导入植物的技术。导入植物的技术。 1983年周光宇等提出并

18、建立。年周光宇等提出并建立。 原理原理 授粉一定时间后，将外源授粉一定时间后，将外源DNA加在柱头上，外源加在柱头上，外源DNA 能沿着花粉管通道渗入，经过珠心进入胚囊，转化尚不具能沿着花粉管通道渗入，经过珠心进入胚囊，转化尚不具 备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞。备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞。 操作方法操作方法 a、柱头切除法；、柱头切除法；b、柱头涂抹法；、柱头涂抹法；c、花粉粒携带法。、花粉粒携带法。 优点优点 操作简单、无需组织培养、操作简单、无需组织培养、避免了组培中无性变异带避免了组培中无性变异带 来的优良农艺性状丧失。但受植物花器、花期的限制。来的优良农艺性状丧失。但

19、受植物花器、花期的限制。 4、聚乙二醇法、聚乙二醇法(PEG法法) 原理原理 PEG可通过改变细胞膜表面的电荷，引起细胞膜透性变可通过改变细胞膜表面的电荷，引起细胞膜透性变 化，并促进化，并促进DNA与膜接触、粘连，同时与膜接触、粘连，同时Ca2+离子与离子与DNA结结 合成合成DNA-磷酸钙复合物而沉积于原生质体的膜表面，从而磷酸钙复合物而沉积于原生质体的膜表面，从而 促进外源大分子进入原生质体。促进外源大分子进入原生质体。 优点优点 a、实验成本低廉，不需要特殊的仪器设备；、实验成本低廉，不需要特殊的仪器设备； b、受体植物不受种类的限制；、受体植物不受种类的限制； c、嵌合体很少；、嵌合

20、体很少； d、结果比较稳定，重复性也较好；、结果比较稳定，重复性也较好； e、转化效率较高，可达、转化效率较高，可达10-3。 5、电击法、电击法 优点：操作简便、不需制备原生质体、转化效率较高、优点：操作简便、不需制备原生质体、转化效率较高、 无受体限制。无受体限制。 6、显微注射法显微注射法 显微注射法是利用显微注射显微注射法是利用显微注射仪将外源仪将外源DNA直接注入受直接注入受 体细胞而实现转化的方法。体细胞而实现转化的方法。 固定受体细胞的方法：固定受体细胞的方法：琼脂糖包埋法、多聚琼脂糖包埋法、多聚-L-赖氨酸赖氨酸 粘连法、吸管支持法。粘连法、吸管支持法。 优点：转化效率高、不受

21、植物种类的限制优点：转化效率高、不受植物种类的限制 缺点：工作效率低、不能规模化转化、需要昂贵仪器缺点：工作效率低、不能规模化转化、需要昂贵仪器 7、浸渍法、浸渍法(浸泡法浸泡法) 浸渍法浸渍法是指将叶子、胚、胚珠、子房、花粉粒、幼穗、是指将叶子、胚、胚珠、子房、花粉粒、幼穗、 悬浮细胞甚至幼苗等直接浸泡在外源悬浮细胞甚至幼苗等直接浸泡在外源DNA溶液中，利用溶液中，利用渗渗 透作用透作用把外源基因导入受体细胞并得到整合与表达的一种把外源基因导入受体细胞并得到整合与表达的一种 转化方法。转化方法。 优点优点：简单、快速、便宜、可规模化转化简单、快速、便宜、可规模化转化 缺点缺点：转化频率低、重

22、复性差：转化频率低、重复性差 8、其他转化方法：其他转化方法： 超声波导入法、激光微束法、碳化硅纤维法、脂质体介超声波导入法、激光微束法、碳化硅纤维法、脂质体介 导法、病毒介导法、转座子介导法导法、病毒介导法、转座子介导法 常常 用用 植植 物物 转转 化化 方方 法法 比比 较较 评价内容评价内容 植植 物物 转转 化化 方方 法法 农杆菌农杆菌 法法 PEG法法电击法电击法微注射法微注射法 基因枪基因枪 法法 花粉管通花粉管通 道法道法 受体材料受体材料外植体外植体原生质体原生质体悬浮细胞悬浮细胞细胞或组织细胞或组织外植体外植体卵细胞卵细胞 宿主限制宿主限制有有无无无无无无无无开花植物开花

23、植物 培养条件培养条件简单简单复杂复杂复杂复杂复杂复杂简单简单无无 转化频率转化频率10-210-110-510-410-510-410-210-110-310-210-1101 嵌嵌 合合 体体有有无无无无无或有无或有多多无无 操操 作作简单简单简单简单复杂复杂更复杂更复杂复杂复杂简单简单 设备要求设备要求便宜便宜便宜便宜昂贵昂贵昂贵昂贵昂贵昂贵简便简便 工作效率工作效率高高低低低低更低更低高高低低 第三节第三节 外源基因的表达、检测与遗传特性外源基因的表达、检测与遗传特性 一、转基因植物的外源基因表达及其调控一、转基因植物的外源基因表达及其调控 转基因沉默转基因沉默是指转入植物的外源基因不

24、表达或表达水平很是指转入植物的外源基因不表达或表达水平很 低的现象。低的现象。 1、转基因沉默的原因及其克服措施转基因沉默的原因及其克服措施 分为分为转录沉默转录沉默、转录后沉默转录后沉默，或分为，或分为同源依赖性沉默同源依赖性沉默、位位 置依赖性沉默置依赖性沉默。 同源依赖性沉默同源依赖性沉默是由于转基因出现多拷贝而发生转基因之是由于转基因出现多拷贝而发生转基因之 间或转基因与内源基因之间相互作用而诱发的转基因沉默。间或转基因与内源基因之间相互作用而诱发的转基因沉默。 位置依赖性转基因沉默位置依赖性转基因沉默是指由于转基因整合到宿主基因组是指由于转基因整合到宿主基因组 的一定位置而引起的转基

25、因失活。的一定位置而引起的转基因失活。 DNA甲基化甲基化 常发生在外源基因的启动子区，是转录沉默或位置依赖常发生在外源基因的启动子区，是转录沉默或位置依赖 性转基因沉默的直接诱因。性转基因沉默的直接诱因。 导致外源基因失活的机制导致外源基因失活的机制： a、甲基化序列与甲基化、甲基化序列与甲基化DNA结合蛋白结合，后者再与结合蛋白结合，后者再与 协同抑制蛋白协同抑制蛋白mSin3A、组蛋白去乙酰酶等形成多蛋白抑制复、组蛋白去乙酰酶等形成多蛋白抑制复 合物，阻碍了转基因启动子与转录因子的接触，从而引起转合物，阻碍了转基因启动子与转录因子的接触，从而引起转 录抑制。录抑制。 b、甲基化导致、甲基

26、化导致DNA构象转变为构象转变为Z型，从而降低转录水平，型，从而降低转录水平， 造成转基因失活。造成转基因失活。 多拷贝整合多拷贝整合 重复诱导的转基因沉默重复诱导的转基因沉默是指外源基因多拷贝整合而引起是指外源基因多拷贝整合而引起 转基因表达水平降低或失活的现象。转基因表达水平降低或失活的现象。 顺式失活顺式失活是指相互串联或紧密连锁的转基因间产生的失是指相互串联或紧密连锁的转基因间产生的失 活。活。 反式失活反式失活是指非同一染色体上转基因间引起的失活。是指非同一染色体上转基因间引起的失活。 导致外源基因失活的机制导致外源基因失活的机制： a、转基因间异位配对，形成三链或四链结构，导致染色

27、转基因间异位配对，形成三链或四链结构，导致染色 体异染色质化，阻碍了转录因子与转基因启动子的结合，从体异染色质化，阻碍了转录因子与转基因启动子的结合，从 而使转录受到抑制；而使转录受到抑制； b、转基因转基因mRNA的特异降解的特异降解(空载空载tRNA触发机制触发机制、反义反义 RNA触发机制触发机制)。 位置效应位置效应 a、外源基因整合在异染色质区和转录不活跃区域、外源基因整合在异染色质区和转录不活跃区域(占植占植 物基因组物基因组90%)； b、外源基因整合在外源基因整合在非等容线位点非等容线位点，被宿主的特定识别，被宿主的特定识别 机制识别而被甲基化，导致转基因沉默。机制识别而被甲基

28、化，导致转基因沉默。 后成修饰作用后成修饰作用 后成修饰作用后成修饰作用是指转基因的表达在个体发育的某一阶段是指转基因的表达在个体发育的某一阶段 受到细胞内因子的修饰作用而关闭。受到细胞内因子的修饰作用而关闭。 与内源基因竞争性结合某些转录、翻译因子与内源基因竞争性结合某些转录、翻译因子 克服转基因沉默的措施克服转基因沉默的措施： a、单拷贝插入；、单拷贝插入；b、建立位点特异整合的转基因体系；、建立位点特异整合的转基因体系； c、采用非甲基化启动子；、采用非甲基化启动子；d、外源基因的密码子优化；、外源基因的密码子优化；e、 将核基质结合区序列置于外源基因两侧，使其成为一个独立将核基质结合区

29、序列置于外源基因两侧，使其成为一个独立 的表达结构；的表达结构；f、筛选稳定表达的转基因植株。、筛选稳定表达的转基因植株。 2、提高外源基因表达水平的策略、提高外源基因表达水平的策略 启动子的选择和改造；启动子的选择和改造； 组成型启动子、组织特异性启动子、诱导型启动子组成型启动子、组织特异性启动子、诱导型启动子 人工杂合启动子人工杂合启动子 利用增强子序列；利用增强子序列； 利用真核基因的翻译调控序列；利用真核基因的翻译调控序列； 如：如：5端端因子、因子、 kozak序列、序列、 3端端poly(A)信号序列、信号序列、 内含子等内含子等 利用定位信号序列；利用定位信号序列； 如：内质网定

30、位信号如：内质网定位信号 KDEL的编码序列的编码序列 叶绿体转化。叶绿体转化。 a、叶绿体、叶绿体DNA拷贝数多；拷贝数多；b、具原核表达方式，可直接、具原核表达方式，可直接 表达来自原核生物的基因；表达来自原核生物的基因；c、能以多顺反子的形式表达多、能以多顺反子的形式表达多 个基因。个基因。 二、外源基因表达的检测二、外源基因表达的检测 Northern杂交、杂交、RT-PCR、酶联免疫吸附分析酶联免疫吸附分析(ELISA)、 Western杂交、杂交、报告基因检测法报告基因检测法。 1、gus基因的检测基因的检测 底物：底物：5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚-D葡萄糖苷酸酯葡萄糖苷酸酯

31、(X-Gluc) 组织化学法组织化学法、分光光度法、荧光法、分光光度法、荧光法 2、NPT-II基因的检测基因的检测 底物：底物：-32PATP 凝胶原位检测法凝胶原位检测法、点渍法、层析法、点渍法、层析法 3、荧光素酶基因的检测、荧光素酶基因的检测 底物：荧光素底物：荧光素 荧光分光光度法、荧光显微镜法荧光分光光度法、荧光显微镜法 4、胭脂碱和章鱼碱的检测胭脂碱和章鱼碱的检测 纸电泳分析法纸电泳分析法 菲醌菲醌(荧光染料荧光染料)染色染色 5、cat基因的检测基因的检测 底物：乙酰底物：乙酰CoA、氯霉素、氯霉素 分光光度计法分光光度计法 6、pat基因的检测基因的检测 PPT乙酰转移酶乙酰

32、转移酶 底物：乙酰底物：乙酰CoA、PPT 分光光度计法分光光度计法 三、外源基因的遗传特性三、外源基因的遗传特性 1、外源基因的遗传稳定性、外源基因的遗传稳定性 一旦外源基因整合，就随植物基因组而稳定遗传。一旦外源基因整合，就随植物基因组而稳定遗传。 但也会发生但也会发生外源基因丢失外源基因丢失。其原因是：转基因植株。其原因是：转基因植株 是嵌合体；减数分裂同源染色体对等交换；有丝分裂是嵌合体；减数分裂同源染色体对等交换；有丝分裂 的同源重组和基因重排；外源基因整合在细胞器基因组的同源重组和基因重排；外源基因整合在细胞器基因组 中，在随后的细胞质分裂中丢失。中，在随后的细胞质分裂中丢失。 2

33、、外源基因的遗传规律、外源基因的遗传规律 孟德尔式遗传孟德尔式遗传 单拷贝整合单拷贝整合 多拷贝整合多拷贝整合 第四节第四节 植物基因工程的应用植物基因工程的应用 一、植物基因工程在植物分子生物学研究中的应用一、植物基因工程在植物分子生物学研究中的应用 1、转座子标签法、转座子标签法 玉米的玉米的Ac/Ds、En/Spm和金鱼草的和金鱼草的Tam转座子系统转座子系统 Ds 农杆菌介导转化农杆菌介导转化 Ac 转转Ac植株植株转转Ds植株植株 Ac/ /Ds植株植株 从从F2代筛选代筛选Ds插入目标突变植株插入目标突变植株 自交自交 突变植株基因组文库突变植株基因组文库 突变基因克隆突变基因克隆

34、 以以Ds制备探针筛选文库制备探针筛选文库 野生型植株基因组文库野生型植株基因组文库 以突变基因制备探针筛选文库以突变基因制备探针筛选文库 目标基因目标基因 2、T-DNA标签法标签法 野生型植株野生型植株 T-DNA插入突变植株插入突变植株 农杆菌农杆菌 转化转化 突变植株基因组文库突变植株基因组文库 以以T-DNA制备制备 探针筛选文库探针筛选文库 突变基因克隆突变基因克隆 野生型植株基因组文库野生型植株基因组文库 以突变基因以突变基因制备探针筛选文库制备探针筛选文库 目标基因目标基因 3、反义、反义RNA技术技术 反义反义RNA技术是指将某反义基因转入植物而抑制其相应技术是指将某反义基因

35、转入植物而抑制其相应 内源基因表达的技术。内源基因表达的技术。 原理：反义原理：反义RNA与内源目标与内源目标RNA互补结合形成稳定的双互补结合形成稳定的双 链，从而影响链，从而影响RNA加工和翻译，导致基因表达被抑制。加工和翻译，导致基因表达被抑制。 转查尔酮合成酶反义基因的矮牵牛，开白色花。转查尔酮合成酶反义基因的矮牵牛，开白色花。 4、位点特异性重组技术、位点特异性重组技术 Cre/ /loxP 位点特异重组系统位点特异重组系统 应用：应用：删除转基因植株的选择标记删除转基因植株的选择标记 NPT II目的基因目的基因 引入引入Cre酶酶 (与与cre植株杂交植株杂交) 目的基因目的基因

36、 基因敲除 转基因的活化 (与特异表达Cre酶的转基因植株杂交) 二、改良植物品种二、改良植物品种 基因工程育种的优势：基因工程育种的优势： 目的性强目的性强； 育种周期短育种周期短； 打破物种界限，扩大育种基因资源库打破物种界限，扩大育种基因资源库。 1、抗虫转基因植物、抗虫转基因植物 Bt毒蛋白基因毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、蛋白酶抑制剂基因(豇豆胰蛋白酶抑制剂豇豆胰蛋白酶抑制剂)、 淀粉酶抑制剂基因淀粉酶抑制剂基因(菜豆菜豆淀粉酶抑制剂基因淀粉酶抑制剂基因)、植物凝集素基、植物凝集素基 因因(雪莲花凝集素基因雪莲花凝集素基因)、昆虫特异性神经毒素基因、昆虫特异性神经毒素基因 防止或延缓

37、害虫产生耐受性的方法防止或延缓害虫产生耐受性的方法： 采用特异性的启动子，使目的基因在适当的时间和特采用特异性的启动子，使目的基因在适当的时间和特 定的组织进行表达；在同一植物中转入两种以上抗虫基因；定的组织进行表达；在同一植物中转入两种以上抗虫基因； 在种植模式上控制昆虫的抗性。在种植模式上控制昆虫的抗性。 2、抗病转基因植物、抗病转基因植物 抗病毒病转基因植物抗病毒病转基因植物 病毒外壳蛋白基因病毒外壳蛋白基因、病毒卫星、病毒卫星RNA、病毒复制酶突变基、病毒复制酶突变基 因、病毒反义因、病毒反义RNA基因基因 抗真菌病转基因植物抗真菌病转基因植物 几丁质酶基因几丁质酶基因、葡聚糖酶基因葡

38、聚糖酶基因、核糖体失活蛋白基因、核糖体失活蛋白基因、 PR基因、植物抗真菌蛋白基因基因、植物抗真菌蛋白基因 抗细菌病转基因植物抗细菌病转基因植物 溶菌酶基因、溶菌酶基因、抗菌肽基因抗菌肽基因、植物抗病基因、植物抗病基因(Xa21) 3、抗除草剂转基因植物、抗除草剂转基因植物 抗除草剂基因工程的策略：抗除草剂基因工程的策略： 过量表达靶标酶或靶标蛋白质，使作物吸收除草剂后，过量表达靶标酶或靶标蛋白质，使作物吸收除草剂后， 仍能进行正常代谢作用；导入除草剂不敏感靶标酶或蛋仍能进行正常代谢作用；导入除草剂不敏感靶标酶或蛋 白的突变基因；产生能修饰除草剂的酶，使除草剂降解白的突变基因；产生能修饰除草剂

39、的酶，使除草剂降解 或解毒。或解毒。 除草剂除草剂 机理机理 靶标酶或蛋白靶标酶或蛋白 基因基因 草丁膦草丁膦 (PPT) 谷氨酰胺合成谷氨酰胺合成谷氨酰胺合成酶谷氨酰胺合成酶 bar 或或pat 草甘膦草甘膦芳香氨基酸合成芳香氨基酸合成 5-烯醇式丙酮酰莽草酸烯醇式丙酮酰莽草酸-3- 磷酸合成酶磷酸合成酶(EPSP) aroA(细菌细菌EPSP突突 变基因变基因) 磺酰脲磺酰脲支链氨基酸合成支链氨基酸合成乙酰乳酸酶乙酰乳酸酶(ALS)植物植物ALS突变基因突变基因 阿特拉津阿特拉津光合系统光合系统IIQB蛋白蛋白QB蛋白突变基因蛋白突变基因 溴笨腈溴笨腈光合作用光合作用?腈水解酶基因腈水解酶

40、基因 4、抗逆境转基因植物、抗逆境转基因植物 导入抗渗透胁迫相关基因导入抗渗透胁迫相关基因 甘露醇、果聚糖、甜菜碱、海藻糖、脯氨酸等小分子的合甘露醇、果聚糖、甜菜碱、海藻糖、脯氨酸等小分子的合 成酶基因成酶基因 导入抗冻蛋白基因导入抗冻蛋白基因 导入胚胎发育后期丰富蛋白导入胚胎发育后期丰富蛋白(LEA)基因基因 LEA蛋白表面有丰富带电基团，可中和因脱水而增加的蛋白表面有丰富带电基团，可中和因脱水而增加的 离子，因此，离子，因此，LEA蛋白的积累与植物抗旱性有关。蛋白的积累与植物抗旱性有关。 导入氧化胁迫相关酶的基因导入氧化胁迫相关酶的基因 超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶(SOD)基因、过氧化物

41、酶基因基因、过氧化物酶基因 5、改良营养品质转基因植物改良营养品质转基因植物 导入富含人体必需氨基酸蛋白质的基因导入富含人体必需氨基酸蛋白质的基因 巴西豆巴西豆2S清蛋白基因清蛋白基因 导入淀粉合成相关酶的基因导入淀粉合成相关酶的基因 ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因葡萄糖焦磷酸化酶基因 导入脂肪酸合成相关酶的基因导入脂肪酸合成相关酶的基因 月桂酰载体蛋白基因月桂酰载体蛋白基因 导入提高维生素和矿物质含量的相关基因导入提高维生素和矿物质含量的相关基因 转铁蛋白基因水稻转铁蛋白基因水稻 转植酸酶基因水稻转植酸酶基因水稻(增加肠道吸收铁增加肠道吸收铁) 转八羟番茄素合酶基因水稻转八羟番茄素合酶基因水稻

42、(-胡萝卜素胡萝卜素) 6、转基因、转基因“工程三系工程三系” TA29-barnase-bar TA29-bastar 7、改变花形花色的转基因植物、改变花形花色的转基因植物 查尔酮合成酶基因查尔酮合成酶基因(chs) 玉米的二氢黄酮醇玉米的二氢黄酮醇-4-还原酶基因还原酶基因矮牵牛矮牵牛橙色花橙色花 黄酮黄酮-3,5-羟化酶基因羟化酶基因玫瑰玫瑰兰色兰色 三、转基因植物作为生物反应器三、转基因植物作为生物反应器 优点优点：安全、廉价、高效、规模化：安全、廉价、高效、规模化 1、转基因植物生产疫苗、转基因植物生产疫苗 1990年年Curtiss等人利用转基因烟草表达链球菌表面蛋白等人利用转基

43、因烟草表达链球菌表面蛋白 抗原抗原A，用该转基因烟草饲喂小鼠，能引起免疫反应。，用该转基因烟草饲喂小鼠，能引起免疫反应。 植物表达系统生产疫苗的特点植物表达系统生产疫苗的特点： 成本低廉；成本低廉； 免疫活性高；免疫活性高； 安全性好；安全性好； 易于贮存和运输；易于贮存和运输； 使用方便。使用方便。 包括：包括：稳定表达系统稳定表达系统、暂态表达系统暂态表达系统 2、转基因植物生产抗体、转基因植物生产抗体 1989年年Haiti获得分别表达抗体重链和轻链的转基因烟获得分别表达抗体重链和轻链的转基因烟 草植株，杂交后在杂种中获得了与抗原结合的抗体。草植株，杂交后在杂种中获得了与抗原结合的抗体。

44、 迄今，不同类型的完整抗体如迄今，不同类型的完整抗体如IgG1、IgM、IgA、 Fab 抗体、抗体、 IgG1/ /IgA嵌合抗体、单链抗体嵌合抗体、单链抗体(scFv)和单域抗体和单域抗体 (VH)等基因都先后转入烟草、拟南芥、伞藻和大豆等作物等基因都先后转入烟草、拟南芥、伞藻和大豆等作物 中，并得到表达。中，并得到表达。 3、转基因植物、转基因植物生产其他多肽类药物生产其他多肽类药物 1988年比利时年比利时PGS公司首次利用转基因烟草生产神经公司首次利用转基因烟草生产神经 肽。肽。 4、利用、利用转基因植物生产糖类、脂类物质转基因植物生产糖类、脂类物质 将将枯草杆菌果糖转移酶基因转入烟

45、草和马铃薯，在转基枯草杆菌果糖转移酶基因转入烟草和马铃薯，在转基 因烟草中获得的果糖可达植物干重的因烟草中获得的果糖可达植物干重的38，转基因马铃，转基因马铃 薯叶中果糖含量达到了叶片干重的薯叶中果糖含量达到了叶片干重的13，在块茎可达到，在块茎可达到 17。 将大肠杆菌的甘露醇将大肠杆菌的甘露醇-1-磷酸脱氢酶基因转入烟草，转基磷酸脱氢酶基因转入烟草，转基 因植株中的甘露醇含量可因植株中的甘露醇含量可达达 6 mol/ /g鲜重，而且转基因植物鲜重，而且转基因植物 的耐盐、耐旱能力也大大提高。的耐盐、耐旱能力也大大提高。 Calgene公司已经用转基因油菜生产用于润滑剂和洗涤剂公司已经用转基

46、因油菜生产用于润滑剂和洗涤剂 生产的生产的12碳的碳的脂肪酸以及润滑剂和尼龙生产的芥酸。脂肪酸以及润滑剂和尼龙生产的芥酸。 5、利用转基因植物生产可降解生物塑料、利用转基因植物生产可降解生物塑料 聚聚-3-羟基链烷酸酯可用于制造可降解的生物塑料。目前羟基链烷酸酯可用于制造可降解的生物塑料。目前 主要是细菌发酵生产，成本很高，难以推广。主要是细菌发酵生产，成本很高，难以推广。 virD操纵子操纵子：诱导型，：诱导型，virD1virD4基因。基因。 VirD1(16kD)、 VirD2(47kD)蛋白参与蛋白参与T-DNA加工形成加工形成T-链链：首先：首先VirD1与与 25bp边界序列亲和结

47、合，使其松弛，然后使边界序列亲和结合，使其松弛，然后使VirD2在特异位在特异位 点剪切。点剪切。VirD2与与T-链的链的5端共价结合，并核定位信号，将端共价结合，并核定位信号，将T- 链复合体导向细胞核。链复合体导向细胞核。 virE操纵子操纵子：诱导型，：诱导型，virE1、virE2基因。基因。VirE2蛋白蛋白 (60.5kD)是是ssDNA结合蛋白，与结合蛋白，与T-链结合，参与链结合，参与T-链复合体形链复合体形 成，还具有核定位信号，引导成，还具有核定位信号，引导T-链复合体进入植物细胞核。链复合体进入植物细胞核。 virF操纵子操纵子：诱导型，：诱导型，virF基因。基因。 VirF蛋白蛋白(23kD)参与参与T- 链复合体的运输。链复合体的运输。 virH操纵子操纵子：诱导型，：诱导型，virH1、virH2基因。基因。VirH蛋白功能蛋白功能 是是降解植物伤口细胞产生的杀菌物质。降