基因工程程序课时课件

1、基因工程程序课时1 1.21.2基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序 基因工程程序课时2 一、基因工程的基本操作程序一、基因工程的基本操作程序 1目的基因的获取。目的基因的获取。 2_的构建。的构建。 3将目的基因导入将目的基因导入_。 4目的基因的检测与鉴定。目的基因的检测与鉴定。 基因表达载体基因表达载体 受体细胞受体细胞 基因工程程序课时3 一、为什么要有一、为什么要有“目的基因的获取目的基因的获取”这一步？这一步？ 二、为什么要有二、为什么要有“表达载体的构建表达载体的构建”这一步？这一步？ 有了目的基因，我们才能赋予一种生有了目的基因，我们才能赋予一种生 物以另一种生物的遗传

2、特性物以另一种生物的遗传特性 单独的单独的DNA片段片段目的基因是不能稳定目的基因是不能稳定 遗传的。构建表达载体的目的是为了使目遗传的。构建表达载体的目的是为了使目 的基因在受体细胞中的基因在受体细胞中稳定存在稳定存在，并且可以，并且可以 遗传给下一代遗传给下一代，同时使目的基因能，同时使目的基因能表达和表达和 发挥作用发挥作用。 基因工程程序课时4 三、为什么要有三、为什么要有“目的基因导入受目的基因导入受 体细胞体细胞”这一步？这一步？ 四、为什么要有四、为什么要有“目的基因的检测与目的基因的检测与 鉴定鉴定”这一步？这一步？ 含有目的基因的表达载体只有进入受含有目的基因的表达载体只有进

3、入受 体细胞，并且体细胞，并且维持稳定和表达维持稳定和表达，才能，才能 实现一种生物的基因在另一种生物中实现一种生物的基因在另一种生物中 的转化的转化 因为目的基因是否真正插入因为目的基因是否真正插入受体细胞的受体细胞的DNA 中中，是否能够在受体细胞中，是否能够在受体细胞中稳定遗传和正确稳定遗传和正确 表达表达，只有通过检测、鉴定才能得知。，只有通过检测、鉴定才能得知。 基因工程程序课时5 2.2.基因文库的构建方法基因文库的构建方法 鸟枪法：鸟枪法： 供体细胞中的供体细胞中的DNADNA 许多许多DNADNA片段片段 运载体运载体 限制酶限制酶 与载体连接与载体连接 载入载入 受体细胞受体

4、细胞 产生特定性状产生特定性状 导入导入 外源外源DNADNA扩增扩增 目的基因目的基因 分离分离 ( (直接分离法直接分离法) ) ( (一一) )从基因文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因 基因工程程序课时6 反转录法：反转录法： 以目的基因转录成以目的基因转录成 的信使的信使RNARNA为模板，反为模板，反 转录成互补的单链转录成互补的单链DNADNA， 然后在酶的作用下合成然后在酶的作用下合成 双链双链DNADNA，从而获得所，从而获得所 需的基因。需的基因。 目的基因的目的基因的mRNAmRNA 杂交双链杂交双链 ( (单链单链RNA/RNA/单链单链DNA)DNA) 单链单链

5、DNADNA 反转录酶反转录酶 核酸酶核酸酶H H 2.2.基因文库的构建方法基因文库的构建方法 DNADNA聚合酶聚合酶 双链双链DNADNA ( (目的基因目的基因) ) 基因工程程序课时7 根据已知的氨基酸序列合成根据已知的氨基酸序列合成DNADNA法法 ： 根据已知蛋白质根据已知蛋白质 的氨基酸序列，推测的氨基酸序列，推测 出相应的信使出相应的信使RNARNA序序 列，然后按照碱基互列，然后按照碱基互 补配对原则，推测出补配对原则，推测出 它的结构基因的核苷它的结构基因的核苷 酸序列，再通过化学酸序列，再通过化学 方法，以单核苷酸为方法，以单核苷酸为 原料合成目的基因。原料合成目的基因

6、。 蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列 mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列 结构基因的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列 推测推测 推测推测 目的基因目的基因 化学合成化学合成 2.2.基因文库的构建方法基因文库的构建方法 基因工程程序课时8 ( (二二) )利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因 基因工程程序课时9 1. 1. 概念：概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物_ _ 复制复制_ _ 的核酸合成技术的核酸合成技术 2.2.原理：原理：_ 4.4.方式：方式：以以_方式扩增，即方式扩增，即_（n n为扩增为扩增 循循 环的次数）环的次数） 5

7、.5.结果：结果： 聚合酶链式反应聚合酶链式反应 体外体外 特定特定DNADNA片段片段 DNADNA复制复制 指数指数 2 2n n 使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增 ( (二二) )利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因 3.过程过程:(变性、退火、延伸变性、退火、延伸) 基因工程程序课时10 条件：条件： 四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸 一对引物一对引物 热稳定热稳定DNADNA聚合酶聚合酶( (TaqTaq酶酶） DNADNA的两条链为模的两条链为模板板 温度控制温度控制 PCR技术的前提是要有一段已知目的基技术的前提是要有一

8、段已知目的基 因的核苷酸序列，以便根据这一序列合因的核苷酸序列，以便根据这一序列合 成引物。成引物。 基因工程程序课时11 点点生物学教学 寻根问底 （1 1）为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的）为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的 生物体内提取不行吗？生物体内提取不行吗？ 提示：提示：构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并 不是惟一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，不是惟一的方式。如果所需要的目的基因序列已知， 就可以通过就可以通过PCR方式从含有该基因的生物的方式从含有该基因的生物的DNA中，中， 直接获得，也可以通过反转录，用直

9、接获得，也可以通过反转录，用PCR方式从方式从mRNA 中获得，不一定要构建基因文库。但如果所需要的目中获得，不一定要构建基因文库。但如果所需要的目 的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一 段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道 这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想 知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什 么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往么不同，或者想得到一种生物的

10、全基因组序列，往往 就需要构建基因文库。就需要构建基因文库。 基因工程程序课时12 1. 1. 作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完 成任务吗？为什么？成任务吗？为什么？ 答：不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥答：不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥 作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记 基因等。必须构建上述元件的主要理由是：基因等。必须构建上述元件的主要理由是： （1 1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基生物之间进行基因交流，只有使用受体生

11、物自身基 因的启动子才能比较有利于基因的表达因的启动子才能比较有利于基因的表达；（；（2 2）通过通过cDNAcDNA 文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体 生物中无法转录生物中无法转录；（；（3 3）目的基因是否导入受体生物中需目的基因是否导入受体生物中需 要有筛选标记要有筛选标记；（；（4 4） 为了增强目的基因的表达水平，往为了增强目的基因的表达水平，往 往还要增加一些其他调控元件，如增强子等；往还要增加一些其他调控元件，如增强子等； （5 5） 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什有时需要确定目的基因表达的产物存在

12、于细胞的什 么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目 的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等 。 基因工程程序课时13 目的：使目的基因在受体细胞中稳定存目的：使目的基因在受体细胞中稳定存 在，并且可以遗传给下一代，同时使目在，并且可以遗传给下一代，同时使目 的基因能够表达和发挥作用。的基因能够表达和发挥作用。 a、目的基因、目的基因 b、启动子、启动子 c、终止子、终止子 d、标记基因、标记基因 基因工程程序课时14 编码区上游编码区下游 RNA聚合 酶结合位点 RNA聚

13、合 酶结合位点 编码 蛋白质 调控 调控 原核细胞原核细胞 真 核 细 胞 真核细胞真核细胞 基因工程程序课时15 1.启动子：启动子：一段有特殊结构的一段有特殊结构的DNA片片 段，位于基因的首端，是段，位于基因的首端，是RNA聚合酶聚合酶 识别和结合的部位，驱动基因转录识别和结合的部位，驱动基因转录. 2.终止子：终止子：一段有特殊结构的一段有特殊结构的DNA片片 段，位于基因的尾部，起终止转录的段，位于基因的尾部，起终止转录的 作用作用. 基因工程程序课时16 1.1.用一定的用一定的_切割切割 质粒，使其出现一个切质粒，使其出现一个切 口，露出口，露出_。 2.2.用用_切断目切断目

14、的基因，使其产生的基因，使其产生_ _ _。 核心核心 3.3.将切下的目的基因片段插入质粒的将切下的目的基因片段插入质粒的_处，处， 再加入适量再加入适量_，形成了一个重组，形成了一个重组 DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒） 限制酶限制酶 黏性末端黏性末端 同一种限制酶同一种限制酶 的黏性末端的黏性末端 切口切口 DNADNA连接酶连接酶 相同相同 ( (二二) )基因表达载体的构建基因表达载体的构建 基因工程程序课时17 质粒质粒DNADNA分子分子 一个一个切口切口 两个两个黏性末端黏性末端 两个两个切口切口 获得目的基因获得目的基因 DNA DNA 连接酶连接酶 重组重组DN

15、ADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒） 同一种同一种 限制酶限制酶 基因工程程序课时18 特别提醒特别提醒 用限制酶切割载体和含目的基因的用限制酶切割载体和含目的基因的 DNA分子时，可以使用不同的限制性核酸内切酶分子时，可以使用不同的限制性核酸内切酶, 但是必须切出相同黏性末端。但是必须切出相同黏性末端。 不同基因可以拼接的原因：不同生物的基因具不同基因可以拼接的原因：不同生物的基因具 有相同的结构和化学组成，都是双螺旋结构，都有相同的结构和化学组成，都是双螺旋结构，都 由四种脱氧核糖核苷酸组成，都遵循相同的碱基由四种脱氧核糖核苷酸组成，都遵循相同的碱基 互补配对原则：互补配对原则：AT，

16、GC。 基因工程程序课时19 下图为某种质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限下图为某种质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限 制性内切酶制性内切酶EcoREcoR、BamHBamH的酶切位点，的酶切位点，ampRampR为青霉为青霉 素抗性基因，素抗性基因，tctRtctR为四环素抗性基因，为四环素抗性基因，P P为启动子，为启动子，T T 为终止子，为终止子，oriori为复制原点。已知目的基因的两端分为复制原点。已知目的基因的两端分 别有包括别有包括EcoREcoR、BamHBamH在内的多种酶的酶且位点。在内的多种酶的酶且位点。 “汉水丑生的生物同行”超级群大型公益活动： 历年高考题PPT

17、版制作。本课件为公益作 品，版权所有，不得以任何形式用于商业 目的。2012年1月15日，汉水丑生标记。 基因工程程序课时20 目的基因目的基因- -载体连接物载体连接物 载体载体- -载体连接物载体连接物 目的基因目的基因- -目的基因连接物目的基因连接物 分离纯化分离纯化 （1 1）将含有目的基因的）将含有目的基因的DNADNA与质粒表达载体分别用与质粒表达载体分别用 EcoREcoR酶切，酶切产物用酶切，酶切产物用DNADNA连接酶进行连接后，其中连接酶进行连接后，其中 由两个由两个DNADNA片段之间连接形成的产物有片段之间连接形成的产物有 、 、 三三 种。若要从这些连接产物中分离出

18、重组质粒，需要对种。若要从这些连接产物中分离出重组质粒，需要对 这些连接产物进行这些连接产物进行 。 “汉水丑生的生物同行”超级群大型公益 活动：历年高考题PPT版制作。本课 件为公益作品，版权所有，不得以任 何形式用于商业目的。2012年1月15日， 汉水丑生标记。 基因工程程序课时21 启动子启动子 mRNA EcoREcoR和和BamHBamH （3 3）目的基因表达时，）目的基因表达时，RNARNA聚合酶识别和结合的位点聚合酶识别和结合的位点 是是 ，其合成的产物是，其合成的产物是 。 （4 4）在上述实验中，为了防止目的基因和质粒表达载）在上述实验中，为了防止目的基因和质粒表达载 体

19、在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用体在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用 的酶是的酶是 。 “汉水丑生的生物同行”超级群大型公益 活动：历年高考题PPT版制作。本课 件为公益作品，版权所有，不得以任 何形式用于商业目的。2012年1月15日， 汉水丑生标记。 基因工程程序课时22 1616（20112011上海上海5757）回答下列有关基因工程的问题。）回答下列有关基因工程的问题。 （1 1）基因工程中使用的限制酶，其特点是）基因工程中使用的限制酶，其特点是 下图四种质粒含有下图四种质粒含有E1E1和和E2E2两种限制酶的识别，两种限制酶的识别，AprApr表示表示 抗青霉素

20、的抗性基因，抗青霉素的抗性基因，TcrTcr表示抗四环素的抗性基因。表示抗四环素的抗性基因。 （2 2）将两端用）将两端用E1E1切开的切开的TcrTcr基因与用基因与用E1E1切开的质粒切开的质粒X X 1 1混合连接，连接后获得的质粒类型有。（多选）混合连接，连接后获得的质粒类型有。（多选） A AX X1 B1 BX X2 C2 CX X3 D3 DX X4 4 特异性的识别和切割特异性的识别和切割DNADNA ABCABC “汉水丑生的生物同行”超级群大型公益 活动：历年高考题PPT版制作。本课 件为公益作品，版权所有，不得以任 何形式用于商业目的。2012年1月15日， 汉水丑生标记。 “汉水丑生的生物同行”超级群大型公益 活动：历年高考题PPT版制作。本课 件为公益作品，版权所有，不得以任 何形式用于商业目的。2012年1月15日， 汉水丑生标记。 基因工程程序课时23 （3 3）若将上图所示）若将上图所示X X1 1、X X2 2、X X3 3、X X4 4四种质粒四种质粒 导入大肠杆菌，然后分别涂布在含有青霉素或四环素导入大肠杆菌，然后分别涂布在含有青霉素或四环素 的两种培养基上。在这两种培养上均不能生长的大肠的两种培养基上。在这两种培养上均不能生长的大肠 杆菌细胞类型有、。杆菌细胞类型