第六章凝胶过滤

1、第六章第六章 凝胶过滤凝胶过滤 凝胶过滤凝胶过滤又称凝胶扩散色谱、排阻色谱、限制扩散又称凝胶扩散色谱、排阻色谱、限制扩散 色谱、分子筛层析。色谱、分子筛层析。是以各种凝胶为固定相，利用流动是以各种凝胶为固定相，利用流动 相中所含各物质的相对分子质量不同而达到物质分离的相中所含各物质的相对分子质量不同而达到物质分离的 一种层析技术。一种层析技术。 凝胶是一种具有多孔、网状结构的分子筛。利用这凝胶是一种具有多孔、网状结构的分子筛。利用这 种凝胶分子筛对大小、形状不同的分子进行层析分离，种凝胶分子筛对大小、形状不同的分子进行层析分离， 称称凝胶层析凝胶层析 。 特点特点 操作简便、设备简单操作简便、

2、设备简单 分离效果好，重复性高分离效果好，重复性高 分离条件缓和分离条件缓和 应用广泛应用广泛 分辨率不高，分离操作慢分辨率不高，分离操作慢 第一节第一节 凝凝胶胶的分类及性质的分类及性质 凝胶：凝胶：是不溶于水但在水中有较大膨胀度和较是不溶于水但在水中有较大膨胀度和较 好分子筛功能的一类化合物。好分子筛功能的一类化合物。 主要有主要有葡聚糖凝胶、天然琼脂糖和交联琼脂糖。葡聚糖凝胶、天然琼脂糖和交联琼脂糖。 其次，还有聚丙烯酰胺凝胶其次，还有聚丙烯酰胺凝胶( (生物胶生物胶) )、交联葡聚糖、交联葡聚糖 与双丙烯酰胺共聚凝胶，以及交联琼脂糖与葡聚糖与双丙烯酰胺共聚凝胶，以及交联琼脂糖与葡聚糖

3、共价结合的凝胶等。共价结合的凝胶等。 一、葡聚糖凝胶一、葡聚糖凝胶 是应用最广的一类凝胶，葡聚糖凝胶的是应用最广的一类凝胶，葡聚糖凝胶的 商品名称为商品名称为sephadexsephadex，它是由葡聚糖和它是由葡聚糖和3 3 氯氯1 1，2 2环氧丙烷环氧丙烷( (交联剂交联剂) )在碱性条件下，以在碱性条件下，以 透平油作为分散介质，在透平油作为分散介质，在4040以醚键相互交联，以醚键相互交联， 然后进行酒精脱水，烘干、过筛而成的。然后进行酒精脱水，烘干、过筛而成的。 1 1理化性质理化性质 葡聚糖凝胶的外观为白色珠状颗粒，葡聚糖凝胶的外观为白色珠状颗粒， 在显微镜下放大在显微镜下放大7

4、00700倍以上，可见其表面倍以上，可见其表面 的网状皱纹，亲水性好，因此在水溶液或的网状皱纹，亲水性好，因此在水溶液或 电解质溶液中极易膨胀。电解质溶液中极易膨胀。 交联度：交联度：交联剂在葡聚糖凝胶中占的百分交联剂在葡聚糖凝胶中占的百分 数。数。 吸水量：吸水量：每克干凝胶在水中充分膨胀时每克干凝胶在水中充分膨胀时 所需的水量。但不包括颗粒间所带的水量所需的水量。但不包括颗粒间所带的水量 膨胀度：膨胀度：每每g g干胶在水或其他规定的溶剂干胶在水或其他规定的溶剂 中，在一定时间与温度条件下膨胀后所占有中，在一定时间与温度条件下膨胀后所占有 的体积毫升数。的体积毫升数。S=V/WS=V/W

5、交联度交联度 吸水量吸水量 膨胀度膨胀度 分离对象的大小分离对象的大小 编号编号交联度交联度吸液量吸液量 膨胀膨胀 速度速度 凝胶凝胶 网孔网孔 分离限分离限 凝胶凝胶 强度强度 大大 小小 小小 大大 大大 小小 慢慢 快快 大大 小小 大大 小小 小小 大大 型号、颗粒大小、分离范围、吸水量、膨胀型号、颗粒大小、分离范围、吸水量、膨胀 度、溶胀时间。度、溶胀时间。 G G后面的编号为膨胀度的后面的编号为膨胀度的1010倍。倍。 如：如： sephadexG-25sephadexG-25表示每克干胶吸水量为表示每克干胶吸水量为2.5ml2.5ml。 除了在水中溶涨外，葡聚糖凝胶还可在乙醇、除

6、了在水中溶涨外，葡聚糖凝胶还可在乙醇、 甲酰胺、二甲亚砜中溶涨。甲酰胺、二甲亚砜中溶涨。 sephadexG-25sephadexG-25在水中只需溶涨在水中只需溶涨3 3小时，小时， sephadexG-100sephadexG-100需要需要3 3天天才能饱和。才能饱和。 商品葡聚糖凝胶的规格商品葡聚糖凝胶的规格 2 2稳定性稳定性 葡聚糖凝胶在水溶液、盐溶液、碱溶液、弱葡聚糖凝胶在水溶液、盐溶液、碱溶液、弱 酸溶液和有机溶剂中是稳定的、不溶解的，而且酸溶液和有机溶剂中是稳定的、不溶解的，而且 很少产生化学降解。很少产生化学降解。 在中性条件下，葡聚糖凝胶悬浮液可置高温在中性条件下，葡聚糖

7、凝胶悬浮液可置高温 (120)(120)消毒消毒0.5h0.5h，其性质并不改变。在，其性质并不改变。在 0.1mol/LHCl0.1mol/LHCl溶液中浸泡溶液中浸泡1-2h1-2h，甚至在，甚至在0.02mol0.02mol L HClL HCl溶液中浸泡溶液中浸泡6 6个月以上，对分离效果无明显个月以上，对分离效果无明显 的影响。的影响。 但是，当暴露于但是，当暴露于强酸或氧化剂强酸或氧化剂溶液时，则容溶液时，则容 易使易使糖苷键水解断裂糖苷键水解断裂，因此，要避免与其接触。，因此，要避免与其接触。 3 3吸附性吸附性 葡聚糖凝胶系葡聚糖凝胶系弱酸性弱酸性物质、这是由于其每克干物质、这

8、是由于其每克干 胶含胶含101020ug20ug当量的羧基基团所致。该基团能与分当量的羧基基团所致。该基团能与分 离物中电荷基团离物中电荷基团( (尤其是碱性蛋白质尤其是碱性蛋白质) )发生发生吸附作用吸附作用。 当离子强度大于当离子强度大于0.050.05时，一般对弱碱性蛋白质就无时，一般对弱碱性蛋白质就无 吸附力了。因此进行葡聚糖凝胶层析时，常用含有吸附力了。因此进行葡聚糖凝胶层析时，常用含有 NaClNaCl的缓冲液作洗脱液。的缓冲液作洗脱液。 新购得葡聚糖凝胶对蛋白质往往有不可逆的新购得葡聚糖凝胶对蛋白质往往有不可逆的 吸附性能，虽然吸附的数量较少，但是在制作测吸附性能，虽然吸附的数量

9、较少，但是在制作测 定蛋白质分子质量的标准曲线时，或者分离纯化定蛋白质分子质量的标准曲线时，或者分离纯化 极难得到的物质时，需先用易得到的蛋白质进行极难得到的物质时，需先用易得到的蛋白质进行 预层析，以便消除其影响。预层析，以便消除其影响。 二、琼脂糖凝胶二、琼脂糖凝胶 琼脂糖是从琼脂中提纯的，主要由琼脂糖是从琼脂中提纯的，主要由D D半乳糖半乳糖 和和3,63,6脱水脱水L L半乳糖半乳糖连接而成的一种线性多糖。连接而成的一种线性多糖。 琼脂糖凝胶的琼脂糖凝胶的制作制作是将干的琼脂糖悬浮于是将干的琼脂糖悬浮于 缓冲液中，加热煮沸至溶液变为澄清，注入模缓冲液中，加热煮沸至溶液变为澄清，注入模

10、板后室温下冷却凝聚即成琼脂糖凝胶。板后室温下冷却凝聚即成琼脂糖凝胶。 琼脂糖凝胶的琼脂糖凝胶的孔径孔径由制胶时由制胶时琼脂糖的浓度琼脂糖的浓度 决定决定，低浓度琼脂糖形成的孔径较大，而高浓，低浓度琼脂糖形成的孔径较大，而高浓 度琼脂糖形成的孔径较小。度琼脂糖形成的孔径较小。 尽管琼脂糖本身没有电荷，但一些糖基可被尽管琼脂糖本身没有电荷，但一些糖基可被 羧基、甲氧基、硫酸根等取代，因而使琼脂糖凝羧基、甲氧基、硫酸根等取代，因而使琼脂糖凝 胶表面带有一定的电荷，样品与凝胶间的相互静胶表面带有一定的电荷，样品与凝胶间的相互静 电作用产生吸附，从而影响分离效果。但是明显电作用产生吸附，从而影响分离效果

11、。但是明显 低于葡聚糖。低于葡聚糖。 这种多糖链在这种多糖链在100100左右时呈液态，当温度左右时呈液态，当温度 到到4545以下时，它们之间以氢键方式相互连接以下时，它们之间以氢键方式相互连接 就成了线性的双链单环的琼脂糖，经凝聚即呈就成了线性的双链单环的琼脂糖，经凝聚即呈 束状的琼脂糖凝胶。该物质对尿素和盐酸等破束状的琼脂糖凝胶。该物质对尿素和盐酸等破 坏氢键的试剂有较强的抵抗力。在坏氢键的试剂有较强的抵抗力。在pH4.0pH4.09.09.0 的缓冲液中是稳定的、琼脂糖凝胶置室温保存，的缓冲液中是稳定的、琼脂糖凝胶置室温保存， 其其物理稳定性超过物理稳定性超过了聚丙烯酰胺和了聚丙烯酰胺

12、和葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶。 琼脂糖凝胶的琼脂糖凝胶的机械强度和筛孔的稳定性机械强度和筛孔的稳定性都比都比 葡聚糖凝胶好，分离范围大。用琼脂糖凝胶进行柱葡聚糖凝胶好，分离范围大。用琼脂糖凝胶进行柱 层析时，流速可以快些。层析时，流速可以快些。 最好使用条件控制在最好使用条件控制在pH 4pH 49 9之间，温度之间，温度0 0 4040，超出此范围，超出此范围, ,可能被破坏。可能被破坏。 琼脂糖凝胶规格琼脂糖凝胶规格 国产的产品有国产的产品有3 3种规格：种规格： Sepharose 2B、4B、6B分别表示琼脂糖浓度分别表示琼脂糖浓度 为为2%、4%、6%。 美国的为美国的为BioGA，有，有

13、6个型号个型号: 即即Bio-G 0.5M，1.5M，5M，15M，50M和和 150M。阿拉伯数字乘以阿拉伯数字乘以106表示排阻限度。表示排阻限度。 浓度大，分离范围小，颗粒强度大。浓度大，分离范围小，颗粒强度大。 CLCL交联琼脂糖：交联琼脂糖： SepharoseSepharose与与1 1，3-3-二溴异丙醇二溴异丙醇 在强碱条件下生成的。比琼脂糖的稳定性提高，在强碱条件下生成的。比琼脂糖的稳定性提高， PHPH范围范围3-143-14。 三、聚丙烯酰胺凝胶三、聚丙烯酰胺凝胶 是一种是一种全化学合成的人工凝胶全化学合成的人工凝胶。聚丙烯酰胺。聚丙烯酰胺 的商品名为的商品名为Bio-g

14、el PBio-gel P。它是以甲撑双丙烯酰胺。它是以甲撑双丙烯酰胺 ( (双体双体) )作交联剂、以过硫酸铵作催化剂，在四甲作交联剂、以过硫酸铵作催化剂，在四甲 基乙二胺基乙二胺(TEMED)(TEMED)加速剂的作用下，将丙烯胺加速剂的作用下，将丙烯胺( (单单 体体) )聚合而成的。当改变单体浓度时，就可得到聚合而成的。当改变单体浓度时，就可得到 吸水率不同的产物。商品聚丙烯酰胺凝胶型号有吸水率不同的产物。商品聚丙烯酰胺凝胶型号有 Bio-gel P-2Bio-gel P-2到到P-300P-300，其阿拉伯数字相当于排阻，其阿拉伯数字相当于排阻 限度的限度的1010-3 -3。 。

15、聚丙烯酰胺凝胶的结构聚丙烯酰胺凝胶的结构 单体丙烯酰胺单体丙烯酰胺 甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺 聚丙烯酰胺凝胶的孔径可以通过调整聚丙烯酰胺凝胶的孔径可以通过调整交联交联 度（一般度（一般1%-25%1%-25%）以及凝胶以及凝胶总浓度（总浓度（5%-25%5%-25%） 来控制。来控制。 以（以（T T）代表）代表100mL100mL凝胶溶液中含有的单体凝胶溶液中含有的单体 和交联剂总克数，称为凝胶浓度。和交联剂总克数，称为凝胶浓度。 交联剂占单体和交联剂总量的百分比称为交联剂占单体和交联剂总量的百分比称为 交联度，以（交联度，以（C C）表示。）表示。 总浓度或交联度增加，孔径减少。总浓度

16、或交联度增加，孔径减少。 一般聚丙烯酰胺凝胶均制成珠状颗粒，并一般聚丙烯酰胺凝胶均制成珠状颗粒，并 以干凝胶形式出售，使用的必须溶胀。以干凝胶形式出售，使用的必须溶胀。 稳定性：稳定性：该凝胶不溶于水和普通有机溶剂，该凝胶不溶于水和普通有机溶剂， 能忍受浓的盐、尿素和胍盐等溶液的浸泡；在能忍受浓的盐、尿素和胍盐等溶液的浸泡；在 PH1-10PH1-10或短时间超过此或短时间超过此pHpH范围的溶液中较稳定，范围的溶液中较稳定， 要避免长期与强酸和强碱接触，如果与其接触要避免长期与强酸和强碱接触，如果与其接触 并在高温条件下，酚胺基将迅速发生分解。并在高温条件下，酚胺基将迅速发生分解。 物理化学

17、性质物理化学性质 吸附性：吸附性：聚丙烯酰胺凝胶对芳香族的、酸性聚丙烯酰胺凝胶对芳香族的、酸性 和碱性的化合物稍有吸附现象，如使用离子强度和碱性的化合物稍有吸附现象，如使用离子强度 略高的洗脱液操作，此弊病可以克服。略高的洗脱液操作，此弊病可以克服。 不为微生物利用，易保存。不为微生物利用，易保存。 四、四、SephacrylSephacryl SephacrylSephacryl是由是由烯丙烷基葡聚糖烯丙烷基葡聚糖与与甲撑双甲撑双 丙烯酰胺丙烯酰胺共价交联制成的，此凝胶属硬性凝胶，共价交联制成的，此凝胶属硬性凝胶， 它具有一定大小的筛孔和少量的羧基基团。它具有一定大小的筛孔和少量的羧基基团。

18、 SephacrylSephacryl吸水时，其珠状颗粒直径为吸水时，其珠状颗粒直径为25-25- 75um75um，通常是用于水相系统中。若在有机相系，通常是用于水相系统中。若在有机相系 统使用时，其孔径大小略有变化。统使用时，其孔径大小略有变化。 化学性质稳定：化学性质稳定： 它在所有的溶剂中不它在所有的溶剂中不溶解溶解，化学降解也很，化学降解也很 少；它可在少；它可在pH2pH21111范围范围内使用，当内使用，当pHpH低时，葡低时，葡 聚糖链发生少许水解作用；在聚糖链发生少许水解作用；在0.2mol/LNaOH0.2mol/LNaOH溶液溶液 中中( (室温室温) )处理处理100h

19、100h，对其低流速和多孔性没有明，对其低流速和多孔性没有明 显影响显影响; ;用去污剂用去污剂( (如如SDS)SDS)、6mo16mo1L L盐酸胍和盐酸胍和 8mol/L8mol/L尿素溶液可作为洗脱剂，高温尿素溶液可作为洗脱剂，高温(120)(120)消消 毒毒(pH7.0(pH7.0时时) )处理后，层析性质没有明显变化。处理后，层析性质没有明显变化。 SephacrylSephacryl能用于分离蛋白质、核酸、多糖和蛋白能用于分离蛋白质、核酸、多糖和蛋白 聚糖，甚至大的病毒颗粒（直径聚糖，甚至大的病毒颗粒（直径300300400nm400nm）也）也 可用它分离。可用它分离。 五、

20、五、SuperdexSuperdex SuperdexSuperdex是由高交联度多孔琼脂糖与葡聚糖是由高交联度多孔琼脂糖与葡聚糖 共价结合而成的。共价结合而成的。 该凝胶具有良好的分子筛特性和物理、化学该凝胶具有良好的分子筛特性和物理、化学 稳定性。在用其分离样品过程中，溶液的酸碱度稳定性。在用其分离样品过程中，溶液的酸碱度 可在可在pH3-12pH3-12范围内变化，溶液中加入去污剂范围内变化，溶液中加入去污剂( (如如1 1 SDS)SDS)和和( (或或) )解离剂解离剂( (如如8mol/L8mol/L尿素、尿素、6mol6molL L盐盐 酸胍酸胍) )时，也不会影响分离效果。时，

21、也不会影响分离效果。 此凝胶共有此凝胶共有6 6种类型。种类型。( (见书见书) ) 缺点：对蛋白质有吸附能力。缺点：对蛋白质有吸附能力。 第二节第二节 基本原理基本原理 当含有各种组分的样品流经凝胶层析柱时，大当含有各种组分的样品流经凝胶层析柱时，大 分子物质由于分子直径大，不易进入凝胶颗粒的微分子物质由于分子直径大，不易进入凝胶颗粒的微 孔，沿凝胶颗粒的间隙以较快的速度流过凝胶柱。孔，沿凝胶颗粒的间隙以较快的速度流过凝胶柱。 而小分子物质能够进入凝胶颗粒的微孔中，向下移而小分子物质能够进入凝胶颗粒的微孔中，向下移 动的速度较慢，从而使样品中各组分按相对分子质动的速度较慢，从而使样品中各组分

22、按相对分子质 量从大到小的顺序先后流出层析柱，而达到分离的量从大到小的顺序先后流出层析柱，而达到分离的 目的。目的。 1 1、分子大小不同混合物上柱；、分子大小不同混合物上柱； 2 2、 洗脱开始，小分子扩散进入凝胶颗粒洗脱开始，小分子扩散进入凝胶颗粒 内，大分子被排阻于颗粒之外；内，大分子被排阻于颗粒之外；3 3、 大小分子分开；大小分子分开； 4 4、大分子行程较短，、大分子行程较短， 已洗脱出层析柱，小分子尚在进行中。已洗脱出层析柱，小分子尚在进行中。 凝胶过滤层析所用的基质是具有立体网状结凝胶过滤层析所用的基质是具有立体网状结 构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。这种构、筛孔直径一致

23、，且呈珠状颗粒的物质。这种 物质可以完全或者部分排阻某些大分子化合物于物质可以完全或者部分排阻某些大分子化合物于 筛孔之外，而不能排阻某些小分子化合物。筛孔之外，而不能排阻某些小分子化合物。 任何一种被分离的化合物在凝胶层析柱被排任何一种被分离的化合物在凝胶层析柱被排 阻的范围均在阻的范围均在0 0100100之间，其之间，其被排阻的程度被排阻的程度可可 以用以用分配系数分配系数Kav(Kav(分离化合物在内水和外水体积分离化合物在内水和外水体积 中的比例关系中的比例关系) )表示。表示。 Kav Kav 的大小依赖于凝胶床的总体积的大小依赖于凝胶床的总体积(Vt)(Vt)、外水、外水 体积体

24、积(V0) (V0) (outer volume)以及分离物本身的洗脱体以及分离物本身的洗脱体 积积(Ve) (Ve) (elution volume) ： Kav Kav 0 0 VV VV t e = 在限定的层析条件下，在限定的层析条件下，VtVt、和、和V0V0都为恒定值，而都为恒定值，而VeVe值值 却是随着分离物分子质量的变化而变化的。分离物分子质却是随着分离物分子质量的变化而变化的。分离物分子质 量大，量大，KavKav值小；反之，则值小；反之，则KavKav值增大。值增大。 因此，在同一凝胶过滤柱上分离分子质量不同的物因此，在同一凝胶过滤柱上分离分子质量不同的物 质时，由于流动

25、相的作用，这些分离物质将发生质时，由于流动相的作用，这些分离物质将发生排阻和扩排阻和扩 散效应散效应。若缓冲液连续注入柱中，柱中物质的排阻和扩散。若缓冲液连续注入柱中，柱中物质的排阻和扩散 效应也将连续发生，其最终结果是分子质量大的物质先从效应也将连续发生，其最终结果是分子质量大的物质先从 柱中流出，分子质量小的物质则后从柱中流出。柱出物用柱中流出，分子质量小的物质则后从柱中流出。柱出物用 部分收集器分管等量或等时地收集起来，检测后分段合并部分收集器分管等量或等时地收集起来，检测后分段合并 相同组分的各管流出物，即等于把分子质量不同的物质相相同组分的各管流出物，即等于把分子质量不同的物质相 互

26、筛分开了。互筛分开了。 其筛分效果受操作条件其筛分效果受操作条件( (如基质的颗粒大小、均如基质的颗粒大小、均 匀度、筛孔直径和床体积的大小、洗脱液的流速以及匀度、筛孔直径和床体积的大小、洗脱液的流速以及 样品的种类等样品的种类等) )的影响是显而易见的，但更为直接的的影响是显而易见的，但更为直接的 影响是影响是KavKav值的差异性。值的差异性。KavKav值差异性大，分离效果好；值差异性大，分离效果好； KavKav值差异性小、乃至等于值差异性小、乃至等于1 1或等于零或等于零( (即使样品中各即使样品中各 组分的分子质量相差很大组分的分子质量相差很大) )，则分离效果很差，或根，则分离效

27、果很差，或根 在不能分开。在不能分开。 KavKav值既是判断分离效果的参数，又是测定蛋白值既是判断分离效果的参数，又是测定蛋白 质分子质量的重要依据。从公式可以看出，只要测出质分子质量的重要依据。从公式可以看出，只要测出 床体积床体积VtVt，和外水体积，和外水体积VoVo以及洗脱体积以及洗脱体积VeVe即可计算出即可计算出 KavKav值。值。 凝胶床总体积凝胶床总体积VtVt可用两种方法：可用两种方法： 计算法：计算法： 即根据层析柱体积计算总体积，可用下列公式：即根据层析柱体积计算总体积，可用下列公式： Vt=R2h 在用此公式计算凝胶床总体积时，须精确地分段测量，在用此公式计算凝胶床

28、总体积时，须精确地分段测量， 以防内径不匀造成误差。另外还须注意到，在层析过程中，以防内径不匀造成误差。另外还须注意到，在层析过程中， 尤其是软胶操作压力要小，以防凝胶床的高度降低。尤其是软胶操作压力要小，以防凝胶床的高度降低。 测量法：测量法： 由凝胶床的组成可知，床体积由凝胶床的组成可知，床体积VtVt等于外水体积等于外水体积 V0V0、内水体积、内水体积ViVi与凝胶颗粒实际占有体积与凝胶颗粒实际占有体积VgVg之和。之和。 即：即： Vt=Vo+Vi+VgVt=Vo+Vi+Vg 因因VgVg和和VtVt相比很小，可忽略不计，故：相比很小，可忽略不计，故： Vt=V0+ViVt=V0+V

29、i。 当把分子质量不同的混合溶液铺在凝胶床上时，当把分子质量不同的混合溶液铺在凝胶床上时， 其在内水体积和外水体积中的分布是不一样的。溶液中其在内水体积和外水体积中的分布是不一样的。溶液中 的分子大于凝胶孔径上限者，不能进入凝胶网孔内，而的分子大于凝胶孔径上限者，不能进入凝胶网孔内，而 被排阻在外水体积的溶液中，凝胶床的洗脱体积被排阻在外水体积的溶液中，凝胶床的洗脱体积VeVe认刚认刚 好等于外水体积好等于外水体积V0V0。即。即VeVeV0V0（KavKav0 0）然而，溶液中）然而，溶液中 的分子小于凝胶孔径下限者，能自由进入凝胶网孔内，的分子小于凝胶孔径下限者，能自由进入凝胶网孔内， 凝

30、胶床的洗脱体积应等于凝胶床总体积，即凝胶床的洗脱体积应等于凝胶床总体积，即 Ve=Vt=V0+ViVe=Vt=V0+Vi（KavKav1 1）。而溶液中的分子大小介于凝）。而溶液中的分子大小介于凝 胶孔径上限和下限者，则有一部分能进入凝胶网孔，故胶孔径上限和下限者，则有一部分能进入凝胶网孔，故 其洗脱体积其洗脱体积VeVe是在是在V0V0和和VtVt之间。之间。 不同型号葡聚糖凝胶柱床参数不同型号葡聚糖凝胶柱床参数 型号VtV0Vi G-1020.81 G-1531.11.5 G-25522.5 G-501045 G-751357 G-10017610 G-20030920 第三节第三节 操作

31、操作 一、凝胶的选择和处理一、凝胶的选择和处理 1 1凝胶的选择凝胶的选择 选择适宜的凝胶是取得良好分离效果的最根本的保证。选择适宜的凝胶是取得良好分离效果的最根本的保证。 选取何种凝胶及其型号、粒度，选取何种凝胶及其型号、粒度，一方面要考虑凝胶的性质，一方面要考虑凝胶的性质， 包括凝胶的分离范围（渗入限与排阻限）还有它的理化稳包括凝胶的分离范围（渗入限与排阻限）还有它的理化稳 定性、强度、非特异吸附性质等；定性、强度、非特异吸附性质等；另一方面还要注意到分另一方面还要注意到分 离目的和样品的性质。离目的和样品的性质。 （1 1）型号：）型号： 不同凝胶筛分范围各不相相同不同凝胶筛分范围各不相

32、相同 SephadexSephadex的分离范围，常用于测定高聚糖或球蛋白。的分离范围，常用于测定高聚糖或球蛋白。 Sephadex GSephadex G型一般适宜于分离蛋白质。型一般适宜于分离蛋白质。 如果用于分离核酸时，则限于其空间结构和所带基团如果用于分离核酸时，则限于其空间结构和所带基团 的影响。选用高于它们分子质量范围的型号，或者选用的影响。选用高于它们分子质量范围的型号，或者选用 适当型号的适当型号的生物胶和生物胶和sephacy1sephacy1。各种型号凝胶的规格和。各种型号凝胶的规格和 性质不同。性质不同。 在除去蛋白质溶液中的盐类时，可选用凝胶在除去蛋白质溶液中的盐类时，

33、可选用凝胶Sephadex Sephadex G-25G-25。当溶液通过当溶液通过G-25G-25柱时蛋白质被排阻住凝胶外面柱时蛋白质被排阻住凝胶外面 先流出来，而盐类则扩散到凝胶网孔里后流出来，这样先流出来，而盐类则扩散到凝胶网孔里后流出来，这样 就便蛋白质得到纯化，一般来说，在规定的筛分范围内，就便蛋白质得到纯化，一般来说，在规定的筛分范围内， 混合物之间分子质量差别越大，分离的效果越好。混合物之间分子质量差别越大，分离的效果越好。 （2 2）粒度：）粒度： 凝胶粒度的大小对分离效果有直接的影响。凝胶粒度的大小对分离效果有直接的影响。 一般来说，一般来说，细粒细粒凝胶柱之间空间小，装柱易

34、均一，流速凝胶柱之间空间小，装柱易均一，流速 低，但洗脱峰窄，分辨率高，多低，但洗脱峰窄，分辨率高，多用于精制分离或分析用于精制分离或分析等。等。粗粗 粒粒凝胶柱流速高，但洗脱峰平坦，分辨率低，多凝胶柱流速高，但洗脱峰平坦，分辨率低，多用于粗制分用于粗制分 离离，脱盐等。，脱盐等。 由于细颗粒凝胶流速慢，故宜用大直径的层析柱，这类由于细颗粒凝胶流速慢，故宜用大直径的层析柱，这类 凝胶用于小型试验，可得到满意结果。而粗颗粒凝胶流速凝胶用于小型试验，可得到满意结果。而粗颗粒凝胶流速 快宜用于小直径的层析柱，如操作得当也可得到较满意的快宜用于小直径的层析柱，如操作得当也可得到较满意的 结果。结果。

35、凝胶粒度与洗脱效果的关系图凝胶粒度与洗脱效果的关系图 在一般柱层析中，使用干颗粒直径在在一般柱层析中，使用干颗粒直径在70m70m 左右较合适。对于在水中保存的凝胶如琼脂粉凝左右较合适。对于在水中保存的凝胶如琼脂粉凝 胶颗粒直径应在胶颗粒直径应在150m150m左右。凝胶颗粒大小要均左右。凝胶颗粒大小要均 匀，这样流速稳定，效果较好。匀，这样流速稳定，效果较好。 对生物样品来说，经常遇到的是两种分离对生物样品来说，经常遇到的是两种分离 形式。一种是只将分子量极为悬殊的两类物质形式。一种是只将分子量极为悬殊的两类物质 分开，如蛋白质与盐类，称作分开，如蛋白质与盐类，称作类分离或组分离类分离或组分

36、离。 另一类则是要将分子量相差不很大的大分子物另一类则是要将分子量相差不很大的大分子物 质加以分离，如分离血清球蛋白与白蛋白，这质加以分离，如分离血清球蛋白与白蛋白，这 叫做叫做分级分离分级分离。后者对实验条件和操作要求都。后者对实验条件和操作要求都 比较高。下面以最常用的葡聚糖凝胶类为例，比较高。下面以最常用的葡聚糖凝胶类为例， 分别加以讨论分别加以讨论 。 1 1类分离类分离 目的是分开样品中分子量悬殊的目的是分开样品中分子量悬殊的“较大分子组较大分子组”和和 “较小分子组较小分子组”两类物质，并不要求分离分子量相近的组两类物质，并不要求分离分子量相近的组 分。分。 选择凝胶时，应使样品中

37、大分子组的分子量大于其排选择凝胶时，应使样品中大分子组的分子量大于其排 阻限，而小分子组的分子量小于渗入限。也就是说大分子阻限，而小分子组的分子量小于渗入限。也就是说大分子 的分配系数的分配系数Kd= 0Kd= 0，小分子的，小分子的KdKd1 1。这样能取得最好的分。这样能取得最好的分 离效果。离效果。 例如从蛋白质溶液中除去无机盐。我们知道，蛋例如从蛋白质溶液中除去无机盐。我们知道，蛋 白质的分子量都大于白质的分子量都大于5000D5000D，而无机盐的分子量一般在，而无机盐的分子量一般在 几十到几百之间。所以常选用几十到几百之间。所以常选用Sephadex G-25Sephadex G-

38、25凝胶作为凝胶作为 分离固定相，因为它的分离范围是分离固定相，因为它的分离范围是100010005000D5000D。被分。被分 离的两组物质的分子量正好落在分离范围的两侧。大离的两组物质的分子量正好落在分离范围的两侧。大 分子组为全排阻，而小分子组为全渗入，其分子组为全排阻，而小分子组为全渗入，其KdKd值的差值的差 可达最大值可达最大值1 1。对于分子量小于。对于分子量小于5000D5000D的肽类进行脱盐的肽类进行脱盐 操作则常选用操作则常选用Sephadex G-15Sephadex G-15凝胶。凝胶。 2 2分级分离分级分离 目的是分开分子量不很悬殊的大分子物质。选择凝胶目的是分

39、开分子量不很悬殊的大分子物质。选择凝胶 型号时必须使各种物质的型号时必须使各种物质的KdKd值尽可能相差大一些。为此，值尽可能相差大一些。为此， 首先决不能使它们的分子量都分布在凝胶分离范围的一首先决不能使它们的分子量都分布在凝胶分离范围的一 侧，也就是侧，也就是KdKd不要都接近于不要都接近于0 0或或1 1，而要使组分的分子量，而要使组分的分子量 尽可能分布在凝胶分离范围的两侧，或接近两侧的位置。尽可能分布在凝胶分离范围的两侧，或接近两侧的位置。 如果样品中含有如果样品中含有3 3个组分的话，最好一个接近全排阻，另个组分的话，最好一个接近全排阻，另 一个接近全渗入，第三个为部分渗入，且分子

40、量大于渗一个接近全渗入，第三个为部分渗入，且分子量大于渗 入限的入限的3 3倍，并小于排阻限的倍，并小于排阻限的1 13 3。 因为分子量如与渗入限比较靠近，该组分分因为分子量如与渗入限比较靠近，该组分分 子在凝胶颗粒中运动所受的约束很小，不易与低子在凝胶颗粒中运动所受的约束很小，不易与低 分子组分分开。如分子量与排阻限比较靠近则不分子组分分开。如分子量与排阻限比较靠近则不 易与高分子组分分开。如用易与高分子组分分开。如用Sephadex G-200Sephadex G-200分离分离 血清蛋白质的效果要比血清蛋白质的效果要比Sephadex G-150Sephadex G-150为好。但为好

41、。但 也有人选用也有人选用G-150G-150，那是因为，那是因为G-200G-200强度太低不便强度太低不便 操作的缘故（见下图）。操作的缘故（见下图）。 不同分离范围的葡聚糖凝胶上，血清蛋白的层析图不同分离范围的葡聚糖凝胶上，血清蛋白的层析图 2 2凝胶用量的计算凝胶用量的计算 根据层析柱的体积和干凝胶的膨胀度，按下根据层析柱的体积和干凝胶的膨胀度，按下 面的公式可计算出所需干凝胶的用量：面的公式可计算出所需干凝胶的用量： 干凝胶用量干凝胶用量(g) (g) rr2 2h/h/（床体积（床体积/g/g） 用此法计算出的干凝胶用量还需增加用此法计算出的干凝胶用量还需增加1010 2020，因

42、为凝胶在处理过程中会有一部分损失掉。，因为凝胶在处理过程中会有一部分损失掉。 3 3凝胶的处理凝胶的处理 干凝胶加入干凝胶加入5 5、1010倍的蒸馏水倍的蒸馏水 充分浸泡充分浸泡 去去 小颗粒小颗粒 用用0.5mol/LNaoH0.5mol/LNaoH0.5mol/L NaCl0.5mol/L NaCl溶液浸泡溶液浸泡 0.5h0.5h 去碱液去碱液 蒸馏水洗至中性。蒸馏水洗至中性。 抽气抽气 除去凝胶中的气泡的方法除去凝胶中的气泡的方法 加热煮沸加热煮沸 注意点注意点: :避免置于酸或碱溶液中加热。避免置于酸或碱溶液中加热。 二、凝胶柱的制备二、凝胶柱的制备 1 1柱的选择柱的选择 同样直

43、径的层析柱同样直径的层析柱 长层析柱比短的分辨率高；长层析柱比短的分辨率高； 同样长度的层析柱同样长度的层析柱 直径大的比小的分辨率高；直径大的比小的分辨率高； 同样体积的层析柱同样体积的层析柱 层析柱长的比短的分辨率高。层析柱长的比短的分辨率高。 理想的层析柱理想的层析柱 直径与长度之比是直径与长度之比是1 1：25-125-1：100100。 层析柱最好有夹央套，这样温度可以控制，得到的结果层析柱最好有夹央套，这样温度可以控制，得到的结果 容易重复。容易重复。 一般选用细长的柱作凝胶过滤。进行脱盐时，一般选用细长的柱作凝胶过滤。进行脱盐时， 柱高柱高50cm50cm比较合适；分级分离时，比

44、较合适；分级分离时，100cm100cm就足够就足够 了。了。 2 2装柱装柱 1 1）除去气泡的溶胀凝胶应与层析柱操作温度一致，）除去气泡的溶胀凝胶应与层析柱操作温度一致， 装柱过程中装柱过程中温度温度也要也要恒定恒定。 2 2）应调节有利于装柱的凝胶浆稀稠度，）应调节有利于装柱的凝胶浆稀稠度，适当稀释适当稀释 有利于装柱过程中气泡的排除。有利于装柱过程中气泡的排除。 3 3）将柱子固定在稳定的支架上，并保证其）将柱子固定在稳定的支架上，并保证其垂直垂直。 4 4）先向柱内加满洗脱剂，检查是否漏水；再打开）先向柱内加满洗脱剂，检查是否漏水；再打开 出液口，排出里面的气泡，特别是要出液口，排出

45、里面的气泡，特别是要排除床底排除床底 支持物上的气泡支持物上的气泡。关闭出液口，使柱中洗脱剂。关闭出液口，使柱中洗脱剂 的体积约占总柱体积的的体积约占总柱体积的1515。 5 5）柱顶接上胶浆贮存器，将胶浆徐徐注入柱内。注）柱顶接上胶浆贮存器，将胶浆徐徐注入柱内。注 意避免产生气泡。意避免产生气泡。 6 6）柱装好后，停）柱装好后，停10min10min，然后打开出液口，排出过，然后打开出液口，排出过 量洗脱剂。量洗脱剂。 7 7）柱内胶面上部保留）柱内胶面上部保留2 23cm3cm洗脱剂。再将恒压洗脱洗脱剂。再将恒压洗脱 剂瓶与柱上端相连。流过至少剂瓶与柱上端相连。流过至少2 2倍住体积的洗

46、脱剂之倍住体积的洗脱剂之 后，流速开始稳定下来。后，流速开始稳定下来。 8 8）调节恒压洗脱剂瓶的高低位置，得到理想流速。）调节恒压洗脱剂瓶的高低位置，得到理想流速。 检查流体静压力，不要超过规定数值。如果使用蠕动检查流体静压力，不要超过规定数值。如果使用蠕动 泵，注意使流速不超过稳定后利用重力调节所达到的泵，注意使流速不超过稳定后利用重力调节所达到的 流速，一般要低于后者流速，一般要低于后者1010。 三、加样与洗脱三、加样与洗脱 1 1加样加样 加样量与测定方法和层析柱大小有关。如测定样品加样量与测定方法和层析柱大小有关。如测定样品 含量的方法灵敏或床体积小时，加样量可少，否则反之。含量的

47、方法灵敏或床体积小时，加样量可少，否则反之。 一般来说，加样量越少，或加样体积越小一般来说，加样量越少，或加样体积越小( (样品浓度高样品浓度高 时时) )，分辨率越高。，分辨率越高。但是，当用于样品的制备和脱盐时、但是，当用于样品的制备和脱盐时、 加样量应在不影响分辨率的前提下增大。究竟加样体积加样量应在不影响分辨率的前提下增大。究竟加样体积 多少为宜多少为宜? ?这要视被分离物在层析柱的分配系数这要视被分离物在层析柱的分配系数(Kav)(Kav)或或 洗脱体积洗脱体积(Ve)(Ve)来决定。假设，来决定。假设，A A、B B两个被分离物在层析两个被分离物在层析 柱中的洗脱体积分别为柱中的洗

48、脱体积分别为Vea Vea 、VebVeb，A A、B B洗脱体积之差洗脱体积之差 称为分离体积，以称为分离体积，以VsVs表示。则表示。则 Vs=VeaVs=VeaVebVeb 3 3凝胶柱的鉴定凝胶柱的鉴定 新装的吸附柱用适当的缓冲液平衡后，将带新装的吸附柱用适当的缓冲液平衡后，将带 色的蓝色葡聚糖色的蓝色葡聚糖-2000-2000、或者红色葡聚糖、细胞色、或者红色葡聚糖、细胞色 素素C C、血红蛋白等物质配成、血红蛋白等物质配成2mg/ml2mg/ml的溶液过柱，观的溶液过柱，观 察察色带是否均匀下降色带是否均匀下降，如均匀下降，则表明柱中，如均匀下降，则表明柱中 凝胶是均匀的，或者说柱

49、中凝胶是均匀的，或者说柱中没裂缝和气泡没裂缝和气泡，是可，是可 以使用的，否则就须重新装柱。以使用的，否则就须重新装柱。 由于凝胶层析的稀释作用，似乎样品浓度应由于凝胶层析的稀释作用，似乎样品浓度应 尽可能大才好，但样品浓度过大往往导致粘度增尽可能大才好，但样品浓度过大往往导致粘度增 大，而使层析分辨率下降（下图）。一般要求样大，而使层析分辨率下降（下图）。一般要求样 品粘度品粘度小于小于0.01Pa0.01Pas s（帕斯卡秒），（帕斯卡秒），这样才不致这样才不致 于对分离造成明显影响。对蛋白质类样品浓度以于对分离造成明显影响。对蛋白质类样品浓度以 不大于不大于4 4为宜。如果样品浑浊，应先

50、过滤或离心为宜。如果样品浑浊，应先过滤或离心 除去颗粒后上柱。除去颗粒后上柱。 样样 品品 黏黏 度度 对对 洗洗 脱脱 曲曲 线线 的的 影影 响响 （1 1）加葡萄糖）加葡萄糖20002000，使终浓度为，使终浓度为5%5%，相对粘度，相对粘度11.8;11.8;（2 2）加葡萄糖）加葡萄糖2 0002 000， 使终浓度为使终浓度为2.5%2.5%，相对粘度，相对粘度4.2; 4.2; （3 3）加葡萄糖）加葡萄糖2 0002 000，使终浓度为，使终浓度为1%. 1%. 2 2洗脱洗脱 所有的洗脱液均以能溶解被洗脱物质和不使其变性或所有的洗脱液均以能溶解被洗脱物质和不使其变性或 失活为

51、原则。除个别特殊情况外，一般都以失活为原则。除个别特殊情况外，一般都以单一缓冲液单一缓冲液( (如如 磷酸缓冲液、磷酸缓冲液、Tis-HClTis-HCl缓冲液等缓冲液等) )或者盐溶液作为洗脱液，或者盐溶液作为洗脱液， 有时甚至也可以用蒸馏水作洗脱液。有时甚至也可以用蒸馏水作洗脱液。 洗脱时的洗脱时的流速要严格控制流速要严格控制，否则收集的每一部分洗脱，否则收集的每一部分洗脱 体积就不会恒定，理想的分配系数就难以测出。控制流速体积就不会恒定，理想的分配系数就难以测出。控制流速 的最好装置是的最好装置是恒流泵恒流泵( (微量泵微量泵) )，它不仅可以使流速恒定，它不仅可以使流速恒定， 而且还可

52、以使其在较大范围内选择。另一种是恒压重力洗而且还可以使其在较大范围内选择。另一种是恒压重力洗 脱。脱。 凝胶过滤层析的洗脱流速与操作压、层析柱体积以及凝胶过滤层析的洗脱流速与操作压、层析柱体积以及 基质的性质是有密切关系的。基质的性质是有密切关系的。 流速对洗脱曲线的影响流速对洗脱曲线的影响 对强度较大的凝胶，如对强度较大的凝胶，如Sephadex G-10Sephadex G-105050， 在相当大的柱压范围内流速（在相当大的柱压范围内流速（）与操作压（）与操作压（F F） 成正比，与柱长（成正比，与柱长（L L）成反比：）成反比： = K PL 而对于强度差的凝胶，符合以上公式压力而对于

53、强度差的凝胶，符合以上公式压力 范围很小。进一步加大压力时，由于凝胶颗粒范围很小。进一步加大压力时，由于凝胶颗粒 变形流速反而降低。变形流速反而降低。 各种层析柱装置的操作压（或静水压）各种层析柱装置的操作压（或静水压） （a a），（），（b b）操作压等于柱或贮液器内液面和出水接管末端）操作压等于柱或贮液器内液面和出水接管末端 的高度差；（的高度差；（c c），（），（d d）压力的大小是由恒压瓶内空气入口）压力的大小是由恒压瓶内空气入口 管的底部至出口接管末端的高度计算。向下（管的底部至出口接管末端的高度计算。向下（c c）或向上（）或向上（d d） 移动出水管无关紧要移动出水管无关紧要

54、 四、凝胶柱的再生及保存四、凝胶柱的再生及保存 1 1、 再生再生 仅使用过一次的凝胶柱，通常进行更新平衡后即可仅使用过一次的凝胶柱，通常进行更新平衡后即可 再次使用；但使用过多次后，由于凝胶床体积变小、流再次使用；但使用过多次后，由于凝胶床体积变小、流 动速度降低或污染杂质过多等原因，致使其正常性能受动速度降低或污染杂质过多等原因，致使其正常性能受 到影响。在此情况下，如欲重复使用，就须进行再生处到影响。在此情况下，如欲重复使用，就须进行再生处 理。理。 方法是：先用水反复进行逆向冲洗，再用缓冲液进方法是：先用水反复进行逆向冲洗，再用缓冲液进 行平衡，平衡毕，即可重复使用；另一种方法是，把凝

55、行平衡，平衡毕，即可重复使用；另一种方法是，把凝 胶倒出，用低浓度的酸或碱按其预处理方法进行，处理胶倒出，用低浓度的酸或碱按其预处理方法进行，处理 后重新装柱即可再行使用。后重新装柱即可再行使用。 保存方法：保存方法： 湿法：湿法：洗净的凝胶悬浮于蒸馏水和缓冲液中，应加入适洗净的凝胶悬浮于蒸馏水和缓冲液中，应加入适 量的防腐剂如氯仿、量的防腐剂如氯仿、0.050.05NaN3NaN3或或2020乙醇等，不然微生物乙醇等，不然微生物 将生长。将生长。 干法：干法：用浓度逐步升高的乙醇洗净凝胶，使其脱水收缩，用浓度逐步升高的乙醇洗净凝胶，使其脱水收缩， 再抽干乙醇，用再抽干乙醇，用60-8060-

56、80的暖风吹干，在室温下保存。的暖风吹干，在室温下保存。 半缩法：半缩法：是过度法，用是过度法，用60%-70%60%-70%的乙醇使凝胶部分脱水，的乙醇使凝胶部分脱水， 然后封口，然后封口，4 4 保存。保存。 第四节第四节 应应 用用 一、脱盐和浓缩一、脱盐和浓缩 二、分离生命物质二、分离生命物质 三、去热源物质三、去热源物质 四、测定分子质量四、测定分子质量 五、其他五、其他 1、脱盐、脱盐 v高分子溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层析法除去，这高分子溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层析法除去，这 一操作称为脱盐。一操作称为脱盐。 v优点：优点： v 操作简便、快速、蛋白质和酶类等不易变

57、性操作简便、快速、蛋白质和酶类等不易变性 v适用的凝胶：适用的凝胶： v SephadexG-10、15、25或或Bio-Gel-p-2、4、6 用用醋酸铵等挥发性盐类醋酸铵等挥发性盐类缓冲液使层析缓冲液使层析 柱平衡柱平衡 上样上样 用同样缓冲液洗用同样缓冲液洗 脱脱 收集的洗脱液用冷冻干燥法除去挥发收集的洗脱液用冷冻干燥法除去挥发 性盐类性盐类 蛋白质不会因蛋白质不会因 为脱盐后溶解为脱盐后溶解 度降低会形成度降低会形成 沉淀吸附于柱沉淀吸附于柱 上上 2、分离提纯、分离提纯 v凝胶过滤的载体可以根据它们的孔径分为很多种不同的规凝胶过滤的载体可以根据它们的孔径分为很多种不同的规 格。每种规格都有其特定的分级的范围，格。每种规格都有其特定的分级的范围，一旦超出分组一旦超出分组 范围范围，不论是其上限还是下限，即使分子量有大有小，不论是其上限还