土壤中分解尿素的细菌的分离与记数课件

1、专题2 :微生物的培养与应用 微生物包括哪五类： 真菌 原生动物 原核生 物界 原生生物 界 真菌界 病毒界 一、基础知识： (一)微生物 不管哪种培养基，一般都含有 水、碳源、和氮源、 无机盐等营养 物质， 另外还需要满足微生物生长对pH、 特殊营养物质,例如:生长因子(即细 菌生长必需，而自身不能合成的化 合物,如维生素、某些氨基酸、嘌呤、 嘧啶)以及氧气等的要求。 1.无菌技术的概念 无菌操作泛指在培养微生 物的操作中，所有防止杂菌污染 的方法。 （）消毒定义： 指使用较为温和的物理或化 学方法仅杀死物体表面或内部一 部分对人体有害的微生物。（不 包括芽孢和孢子） 2.消毒与灭菌的概念及

2、两者的区别 （2）灭菌的定义： 使用强烈的理化因素杀死物体 内外所有的微生物，包括芽孢和孢 子，而达到完全无菌之过程。 1计算 2 称量 3溶化 4灭菌 5倒平板 操作步骤 2、纯化大肠杆菌 接种方法有： 平板划线法和稀释涂布平板法 平板划线法:通过接种环在琼脂 固体培养基表面连续划线的操作,将聚集 的菌种逐步稀释分散到培养基的表面. 在数次划线后,可以分离到由一个细 胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体,这 就是菌落. 稀释涂布平板 法 土壤中分解尿素的细菌的分离与记数 两个主要目的： (1)从土壤中分离出能够分解尿 素的细菌； (2)统计每克土壤样品中究竟含 有多少这样的细菌。 水生耐热细菌T

3、aq ( Thermus aquaticus ) 耐高温的Taq DNA聚合酶 美国微生物学科布鲁克（T.Brock) 1966年发现耐热细菌 研究思路 （一）筛选菌株 尿素分子的 立体结构 CO(NH2)2+H2O CO2+2NH3 脲 酶 分解尿素的细菌: 培养基配方 KH2PO41.4g Na2HPO42.1g MgSO47H2O0.2g 葡萄糖10.0g 尿素1.0g 琼脂15.0g 将上述物质溶解后，用蒸馏水定容至 1000mL 在微生物学中，将允许特定种 类的微生物生长，同时抑制或阻止 其他种类微生物生长的培养基。 选择培养基 选择培养基:从微生物群中选择具有特 定表型的细胞.使之

4、进行繁殖所用的培 养基,称为选择培养基. 加入青霉素的培养基: 分离酵母菌、霉菌等 真菌 加入高浓度食盐的培养基: 分离金黄色葡萄球菌 不加氮源的无氮培养基: 分离固氮菌 不加含碳有机物的无碳培养基: 分离自养型微生物 背景知识 测定微生物数量的方法： 1直接计数法： 最常用显微镜直接计数法。 测定微生物数量的方法： 背景知识 1直接计数法： 最常用显微镜直接计数法。 先将待测样品制成悬液，然后取一 定量的悬液放在显微镜下进行计数。根 据在显微镜下观察到的微生物数目来计 算出单位体积内的微生物总数。 测定微生物数量的方法： 背景知识 优点： 设备简单、能观察微生物的形 态特征。 优点： 设备简

5、单、能观察微生物的形 态特征。 缺点： 难以计数微小量多的细菌。 一般用于纯培养悬浮液中各 种单细胞菌体的计数。 2间接计数法： 最常用稀释平板计数法。 （二）统计菌落数目 （二）统计菌落数目 统计菌落数目的理论依据： 当样品的稀释度足够高 时，培养基表面生长的一个菌落，来源于 样品稀释液中的一个活菌。因此，恰当的 稀释度是成功地统计菌落数目的关键。为 了保证结果准确，通常将几个稀释度下的 菌液都涂布在平板上，培养后再选择菌落 数在30300的平板进行计数。 每克样品中的菌株数 = (CV)M C：某一稀释度下平板上生长的平均 菌落数 V：涂布平板时所用的稀释液的体积 (ml) M：稀释倍数

6、统计的菌落往往 比活菌的实际数目低。 这是因为当两个或多 个细胞连在一起时，平板上观察到的 只是一个菌落。因此结果一般用菌落 数而不是活菌数来表示。 注意： 两位同学用稀释涂布平板法测定 同一土壤样品中的细菌数。在对应稀释倍 数为106的培养基中，得到以下两种统计 结果。 1.第一位同学在该浓度下涂布了一个 平板，统计的菌落数为230。 2.第二位同学在该深度下涂布了三个 平板，统计的菌落数分别为21、212和256， 该同学以这三个平板菌落数的平均值163 作为统计结果。 实例1 你认为哪位同学的结果更接近真 实值？这两位同学的实验需要改进吗？ 如果需要，如何改进？ ? 你认为哪位同学的结果

7、更接近真 实值？这两位同学的实验需要改进吗？ 如果需要，如何改进？ 第一位同学只涂布了一个平板，没 有设置重复组，因此结果不具有说服力。 第二位同学考虑到设置重复组的问题， 涂布了3个平板，但是，其中1个平板的计 数结果与另2个相差太远，说明在操作过 程中可能出现了错误，因此，不能简单地 将3个平板的计数值用来求平均值。 ? 因此，这两位同学的实验需要改 进，在设计实验时，一定要涂布至少3 个平板，作为重复组，才能增强实验 的说服力与准确性。在分析实验结果 时，一定要考虑所设置的重复组的结 果是否一致，结果不一致，意味着操 作有误，需要重新实验。 说明设置重复组的重要性。 在做本课题的实验时，

8、A同学从对应 106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌 落。但是，其它同学在同样的稀释度下只 选择出大约50个菌落。 其他同学认为A同学的结果有问题。 他们分析可能是A同学的培养基被杂菌污 染了，或者培养基中混入了其他含氮物质， 因而导致不能分解尿素的细菌也能在该培 养基上生长。 实例2 但是，A同学确信自己的实验操 作准确无误，与其他同学的结果之所 以不相同，是因为自己所选用的土壤 样品不同。但是，A同学在设计实验 的时候并没有设置对照，因而此时也 拿不出令同学们信服的证据。 你能通过设置对照，帮助A同学 排除上述两个可能影响实验结果的因 素吗？ 一是由于土样不同，二是由于培养 基污染或操

9、作失误。究竟是哪个原因， 可以通过实验来证明。 一种方案：可以由其他同学用与A 同学一样的土样进行实验，如果结果与 A同学一致，则证明A无误；如果结果 不同，则证明A同学存在操作失误或培 养基的配制有问题。 另一种方案： 将A同学配制的培养基在不加土 样的情况下进行培养，作为空白对照， 以证明培养基是否受到污染。 通过这个事例可以看出，实验结 果要有说服力，对照的设置是必不可 少的。 1要将从土壤中提取的自生固氮菌与其他的 细菌分离出来，应将它们接种在（） A加入氮源和杀菌剂的培养基上 B不加入氮源和加杀菌剂的培养基上 C加入氮源，不加杀菌剂的培养基上 D不含氮源和杀菌剂的培养基上 D 做一做 2将圆褐固氮菌接种到彻底灭菌的固体培养 基上，经过一段时间培养，就能够得