纯培养,实验,答辩

1、纯培养,实验,答辩 为什么要纯培养微生物？ 如何纯培养微生物？ 如何保藏纯培养微生物？有哪些保藏方法？ 纯培养,实验,答辩 前言 微生物无处不在，在我们的生活中起着 至关重要的作用。 我们无时无刻都在享受微生物给我们带 来的恩惠，也无时无刻都在受到微生物给 我们带来的威胁。 人类何以面对？了解它，利用它， 干掉它？ 纯培养,实验,答辩 微生物和我们微生物和我们人类有着密切和重要的关系。人类有着密切和重要的关系。 1 有益关系：有益关系： 绝大多数微生物对人类是有益的，而且是必需的。绝大多数微生物对人类是有益的，而且是必需的。 可以生产许多作用产品，如面包、奶酪、啤酒、抗可以生产许多作用产品，如

2、面包、奶酪、啤酒、抗 生素、疫苗、维生素、酶等。生素、疫苗、维生素、酶等。 是人类生存环境中必不可少的成员。是人类生存环境中必不可少的成员。 是地球物质循环的参与者。是地球物质循环的参与者。 四、微生物和我们四、微生物和我们 纯培养,实验,答辩 2 有害关系：有害关系： 少部分可以致病。少部分可以致病。 如瘟疫如瘟疫鼠疫由鼠疫耶尔森氏菌引起，鼠疫由鼠疫耶尔森氏菌引起，13471347 年的一场鼠疫几乎摧毁了整个欧洲，此后年的一场鼠疫几乎摧毁了整个欧洲，此后8080 年间消灭了约年间消灭了约75%75%的欧洲人；的欧洲人； 肺结核、霍乱分别由结核杆菌和霍乱杆菌引肺结核、霍乱分别由结核杆菌和霍乱杆

3、菌引 起；起； SARSSARS由由SARSSARS病毒引起；病毒引起； AIDS AIDS 人类正面临的一场新的瘟疫。人类正面临的一场新的瘟疫。 纯培养,实验,答辩 何以了解微生物，改造微生物? 研究微 生物首先必须把它们从众多的微生物群体中 分离出来，培养好微生物。 微生物培养技术是进行生物学研究的基 础。只有熟练掌握微生物的培养技术，生物 学研究才得以进行，才能减少微生物给人类 带来的伤害，才可能利用好微生物给我们人 类带来福音。 培养技术的重要性 纯培养,实验,答辩 培养物培养物(culture)：在人为规定的条件下培养、繁殖得：在人为规定的条件下培养、繁殖得 到的微生物群体称为培养物

4、。到的微生物群体称为培养物。 纯培养纯培养(pure culture)：只有一种微生物的培养物称：只有一种微生物的培养物称 为纯培养。为纯培养。 纯培养技术：把特定的微生物从自然界混杂存在的状纯培养技术：把特定的微生物从自然界混杂存在的状 态中分离、纯化出来的技术产物纯培养技术。态中分离、纯化出来的技术产物纯培养技术。 培养基培养基(culture medium)：适合微生物生长繁殖或产：适合微生物生长繁殖或产 生代谢产物的营养基质。生代谢产物的营养基质。 常见的专业名词 纯培养,实验,答辩 无菌技术无菌技术(aseptic technique)：在分离、：在分离、 接种及培养纯培养物时防止被

5、其它微生物接种及培养纯培养物时防止被其它微生物 污染的技术称为无菌技术污染的技术称为无菌技术。（培养基质无菌，操作过。（培养基质无菌，操作过 程防菌）程防菌） 菌落菌落(colony)：单个微生物在适宜的固体培：单个微生物在适宜的固体培 养基表面或内部生长繁殖到一定程度形成养基表面或内部生长繁殖到一定程度形成 肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群 体称为菌落。体称为菌落。 菌苔菌苔(lawn)：固体培养基表面众多菌落连成：固体培养基表面众多菌落连成 一片时即为菌苔。一片时即为菌苔。 纯培养,实验,答辩 第一节第一节 微生物的分离和纯培养微生物的分离和纯培养

6、纯培养,实验,答辩 1、微生物培养的常用器具及其灭菌、微生物培养的常用器具及其灭菌 常用的器具：试管、瓶子、培养皿等 1887年，R J Petri 发明 Petri dish 一、无菌技术一、无菌技术 纯培养,实验,答辩 微生物培养的常用器具及其灭菌微生物培养的常用器具及其灭菌 常用器具：常用器具： 试管：常用棉花塞塞口，也可用金属、塑料或硅试管：常用棉花塞塞口，也可用金属、塑料或硅 胶帽塞口。胶帽塞口。 三角瓶：常用棉花塞塞口，用来培养时则用三角瓶：常用棉花塞塞口，用来培养时则用8层纱层纱 布封口。布封口。 平皿：由正反两个盖互扣而成，专门用来培养微平皿：由正反两个盖互扣而成，专门用来培养

7、微 生物。生物。 纯培养,实验,答辩 灭菌：灭菌： 可以单独灭菌，也可与培养基或其它需要灭菌可以单独灭菌，也可与培养基或其它需要灭菌 的物质一起灭菌的物质一起灭菌 常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌法，玻璃器皿常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌法，玻璃器皿 单独灭菌时也可用高温干热灭菌法。单独灭菌时也可用高温干热灭菌法。 纯培养,实验,答辩 1.接种针接种针 2.接种环接种环 3.接种钩接种钩 4.5.玻璃涂棒玻璃涂棒 6.接种圈接种圈 7.接种锄接种锄 8.小解剖刀小解剖刀 接种环、接种针、接种铲等。接种环、接种针、接种铲等。 灭菌方法：用火焰灼烧灭菌。灭菌方法：用火焰灼烧灭菌。 2、微生物接种的常用器

8、具及其灭菌、微生物接种的常用器具及其灭菌 纯培养,实验,答辩 无无 菌菌 操操 作作 技技 术术 纯培养,实验,答辩 培养方法 1、用固体培养基分离纯培养；用固体培养基分离纯培养； 2、用液体培养基分离纯培养；、用液体培养基分离纯培养； 3 3、单细胞、单细胞( (单孢子单孢子) )分离；分离； 4、选择培养基分离培养；、选择培养基分离培养； 5、二元培养物法培养。、二元培养物法培养。 纯培养,实验,答辩 1、用固体培养基分离纯培养、用固体培养基分离纯培养 固体培养基经熔化后倒入无菌平皿中，冷却凝固体培养基经熔化后倒入无菌平皿中，冷却凝 固，所得的盛有固体培养基的平皿称为培养平固，所得的盛有固

9、体培养基的平皿称为培养平 板，简称平板。板，简称平板。 通过稀释，使微生物在固体培养基上形成单个通过稀释，使微生物在固体培养基上形成单个 菌落的方法。菌落的方法。 主要有稀释倒平板法；涂布平板法；平板划线主要有稀释倒平板法；涂布平板法；平板划线 法；稀释摇管法。法；稀释摇管法。 纯培养,实验,答辩 （1）、稀释倒平板法）、稀释倒平板法 将待分离的材料用无菌水进行一系列稀释将待分离的材料用无菌水进行一系列稀释(1:10、 1:100、1:1000、1:1000，又表示为，又表示为10-1、 10-2、10-3、10-4.)。 分别取不同稀释液少许分别取不同稀释液少许(通常取通常取0.1ml)，与

10、已熔，与已熔 化并冷却至化并冷却至50左右的固体培养基混合，倒入左右的固体培养基混合，倒入 已灭菌的培养皿中，冷却凝固后，保温一定时已灭菌的培养皿中，冷却凝固后，保温一定时 间即可出现菌落。挑取单个菌落即得到纯培养。间即可出现菌落。挑取单个菌落即得到纯培养。 纯培养,实验,答辩 纯培养,实验,答辩 （2）、涂布平板法）、涂布平板法 稀释方法同稀释方法同“稀释倒平板法稀释倒平板法”。 将有熔化的固体培养基倒入无菌平皿中，冷将有熔化的固体培养基倒入无菌平皿中，冷 却凝固后，分别取不同稀释液少许却凝固后，分别取不同稀释液少许(通常取通常取 0.1ml)滴加在平板表面，用无菌玻璃涂棒滴加在平板表面，用

11、无菌玻璃涂棒 (推棒推棒)将菌液均匀涂布在整个平板表面，培将菌液均匀涂布在整个平板表面，培 养后挑取单个菌落。养后挑取单个菌落。 纯培养,实验,答辩 纯培养,实验,答辩 纯培养,实验,答辩 （3）、平板划线法）、平板划线法 用接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料。用接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料。 在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或 其它形式的连续划线，微生物随着划线次数其它形式的连续划线，微生物随着划线次数 的增加而被逐步稀释。的增加而被逐步稀释。 培养后形成单个菌落。挑取单个菌落即得纯培养后形成单个菌落。挑取单个菌落即得纯 培养。培养。 纯培

12、养,实验,答辩 （4）、稀释摇管法）、稀释摇管法 主要用来对氧敏感的厌氧微生物。主要用来对氧敏感的厌氧微生物。 将一系列盛有固体培养基的试管加热使培养基将一系列盛有固体培养基的试管加热使培养基 熔化，冷却并保持在熔化，冷却并保持在50左右，将待分离的材左右，将待分离的材 料用这些试管进行一系列稀释，试管迅速摇动料用这些试管进行一系列稀释，试管迅速摇动 均匀，冷却凝固后，在培养基柱表面倒入一层均匀，冷却凝固后，在培养基柱表面倒入一层 无菌液体石蜡和固体石蜡的混合物，使培养基无菌液体石蜡和固体石蜡的混合物，使培养基 与空气隔开。培养后在培养基柱中间形成单个与空气隔开。培养后在培养基柱中间形成单个

13、菌落。菌落。 纯培养,实验,答辩 2、用液体培养基分离纯培养、用液体培养基分离纯培养 主要用来分离培养细胞大的细菌、原生动物和藻类。主要用来分离培养细胞大的细菌、原生动物和藻类。 常用稀释法。常用稀释法。 将待分离的材料接种于液体培养基中，用液体培养将待分离的材料接种于液体培养基中，用液体培养 基进行一系列稀释，使得一支试管中分配不到一个基进行一系列稀释，使得一支试管中分配不到一个 微生物微生物。（。（95%试管中分离不到细菌才有效）试管中分离不到细菌才有效） 经培养后大多数试管没有微生物生长，有微生物生经培养后大多数试管没有微生物生长，有微生物生 长的试管得到的培养物即可能是纯培养。长的试管

14、得到的培养物即可能是纯培养。 纯培养,实验,答辩 3 3、单细胞、单细胞( (单孢子单孢子) )分离分离 用显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞用显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞 和单个个体进行培养以获得纯培养的方法称为和单个个体进行培养以获得纯培养的方法称为 单细胞单细胞( (单孢子单孢子) )分离。分离。 对于那些在自然界混杂群体中数量只有少数的对于那些在自然界混杂群体中数量只有少数的 微生物可以用这种方法。微生物可以用这种方法。 对于较大的微生物，可用毛细管在解剖显微镜对于较大的微生物，可用毛细管在解剖显微镜 下提取单个个体；对于较小的微生物，则用显下提取单个个体；对于较小的微生

15、物，则用显 微操作仪在显微镜下提取单个个体。微操作仪在显微镜下提取单个个体。 纯培养,实验,答辩 4、选择培养分离、选择培养分离 设计一套特定环境使之特别适合于某种微设计一套特定环境使之特别适合于某种微 生物生长，而其它微生物不能生长，从而生物生长，而其它微生物不能生长，从而 从自然界混杂的微生物群体中把这种微生从自然界混杂的微生物群体中把这种微生 物选择培养出来，这种方法称为选择培养物选择培养出来，这种方法称为选择培养 分离。分离。 主要包括利用选择培养基直接分离和富集主要包括利用选择培养基直接分离和富集 培养两种。培养两种。 纯培养,实验,答辩 （1）、利用选择培养基直接分离）、利用选择培

16、养基直接分离 根据待分离微生物的特点选择不同的培养条件。根据待分离微生物的特点选择不同的培养条件。 筛选蛋白酶产生菌：加牛奶和酪素。筛选蛋白酶产生菌：加牛奶和酪素。 分离高温菌：在高温下培养。分离高温菌：在高温下培养。 分离硝基苯分解菌：加硝基苯作为唯一的碳源分离硝基苯分解菌：加硝基苯作为唯一的碳源 和氮源。和氮源。 分离螺旋藻：利用其滑行特点，让其滑行生长，分离螺旋藻：利用其滑行特点，让其滑行生长， 挑取滑行前沿即得纯培养物。挑取滑行前沿即得纯培养物。 纯培养,实验,答辩 （2）、富集培养）、富集培养 利用不同微生物间生命活动特点的不同，利用不同微生物间生命活动特点的不同， 制定特定的环境条

17、件，使仅适应于该条件制定特定的环境条件，使仅适应于该条件 的微生物生长，从而使其在混杂群体在的的微生物生长，从而使其在混杂群体在的 数量大大增加，因而更容易将它分离出来。数量大大增加，因而更容易将它分离出来。 纯培养,实验,答辩 5、二元培养物、二元培养物 含有一种微生物的培养物称为一元培养 物，含有两种以上为生物的培养物称为混 合培养物，而如果微生物只含有二种微生 物，而且是有意识的保持二者特定关系的 培养物称为二元培养物。 适用于病毒和一些严格的细胞内寄生物。 纯培养,实验,答辩 三、微生物的保藏技术三、微生物的保藏技术 目的：使微生物纯培养物在一定时间内不死目的：使微生物纯培养物在一定时

18、间内不死 亡，不被其它微生物污染，不会因发生变异亡，不被其它微生物污染，不会因发生变异 而丢失重要的生物学性状。而丢失重要的生物学性状。 几种常用的保藏方法：传代培养法；冷冻保几种常用的保藏方法：传代培养法；冷冻保 藏法；干燥保藏法；藏法；干燥保藏法； 纯培养,实验,答辩 1 1、传代培养保藏法、传代培养保藏法 操作方法：操作方法： 将菌种接种在斜面、液体或穿刺培养基上，待生将菌种接种在斜面、液体或穿刺培养基上，待生 长完全后，置普通冰箱长完全后，置普通冰箱4保藏，湿度保藏，湿度5070 以下，棉塞换成不通气橡皮塞更好。以下，棉塞换成不通气橡皮塞更好。 一般一般46个月必须传代一次。个月必须传

19、代一次。 优点：方便，不受条件限制，各类微生物均可。优点：方便，不受条件限制，各类微生物均可。 缺点：时间短、传代多、易退化。缺点：时间短、传代多、易退化。 纯培养,实验,答辩 2、冷冻保藏法、冷冻保藏法 使菌种始终存放在低温环境下的保藏方法。使菌种始终存放在低温环境下的保藏方法。 包括低温法和液氮法。包括低温法和液氮法。 此法关键是要克服细胞的冷冻损伤。一般应加此法关键是要克服细胞的冷冻损伤。一般应加 入各种保护剂如甘油来提高培养物的存活率。入各种保护剂如甘油来提高培养物的存活率。 进行冷冻时应采取速冻方法，取出时应快速升进行冷冻时应采取速冻方法，取出时应快速升 温。温。 低温法：一般常用低

20、温法：一般常用-70的低温冰箱，也可用的低温冰箱，也可用- 20-30的普通冰箱。的普通冰箱。 液氮法：置液氮罐中，温度可达液氮法：置液氮罐中，温度可达-196。 纯培养,实验,答辩 液氮保藏法液氮保藏法 操作方法：操作方法： 液氮温度可达液氮温度可达196。把菌悬液密封于安瓶中，。把菌悬液密封于安瓶中， 置液氮罐内保藏。置液氮罐内保藏。 优点：保藏效果好。优点：保藏效果好。 缺点：价格昂贵。缺点：价格昂贵。 纯培养,实验,答辩 3、干燥保藏法、干燥保藏法 包括冷冻真空干燥法和沙土管保藏法。包括冷冻真空干燥法和沙土管保藏法。 (1)、冷冻真空干燥法：是将要保藏的微生物样品、冷冻真空干燥法：是将要保藏的微生物样品 先经低温预冻，使其冰结，然后在低温状态下先经低温预冻，使其冰结，然后在低温状态下 进行真空减压干燥。进行真空减压干燥。 (2)、沙土管保藏法：将微生物接种于斜面，培养、沙土管保藏法：将微生物接种于斜面，培养 至长出大量孢子，洗下孢子制成悬液，加入到至长出大量孢子，洗下孢子制成悬液，加入到 无菌的沙土试管中，减压干燥，用胶塞塞口，无菌的沙土试管中，减压干燥，用胶塞塞口， 置冰箱保存。置冰