光照和漂白粉对白僵菌孢子萌发及致病力的影响

1、摘要：研究人工紫外光和自然光照射以及消毒剂漂白粉对白僵菌（beauveria bassiana）孢子萌发和致病力的影响。结果表明，人工紫外光照射对裸露的白僵菌孢子有明显的杀伤作用，使孢子萌发率和对家蚕（bombyx mori l.）的致病力明显下降，但对白僵菌原粉中的孢子杀伤力相对较弱，照射24 h后白僵菌原粉对家蚕的致死率仍达93.33%。在自然光下，喷洒到桑叶上的白僵菌孢子悬浮液随光照时间的增加对家蚕的致病力下降，自然光照射3、6、12、24、36 h后，对家蚕的致死率分别为100.00%、70.00%、79.66%、10.00%和25.00%；用白僵菌原粉喷桑树，经自然光照射036 h后

2、，对家蚕的致死率为88.33%96.67%，48 h后对家蚕的致死率大幅度下降，照射48、54、78 h对家蚕的致死率分别为53.33%、31.67%和23.33%；直接置于自然光下照射的白僵菌原粉，随光照时间增加，对家蚕的致病力下降，30 h后致病力明显下降，致死率只有38.33%。有效氯浓度为1.00%和2.00%的漂白粉溶液对白僵菌孢子萌发有很强的抑制作用，72 h孢子萌发率分别为1.000%和0；用有效氯浓度为2.00%的漂白粉液进行叶片和蚕体消毒处理对白僵菌孢子均有杀灭效果，使白僵菌孢子液和原粉对家蚕的致病力明显下降，但对叶片消毒比对蚕体消毒效果好。 中国论文网 关键词：白僵菌（be

3、auveria bassiana）；致病力；光照；漂白粉；家蚕（bombyx mori l.） 中图分类号：s432.4+4 文献标识码：a 文章编号：0439-8114（2013）03-0583-05 中国是世界上最大的蚕丝生产国，目前蚕丝产量占世界总产量的80%以上。全国共有蚕农2 000多万户，分布于20多个省区1。蚕业已成为中国农村经济中的重要组成部分，其年出口创汇额在农产品中位居前列，是农民增收的重要来源。家蚕白僵病是由白僵菌引起的一种真菌性病害，是家蚕主要病害之一，发生流行范围广，在世界各蚕区都有发生2。根据孢子形态可以将白僵菌分为球孢白僵菌beauveria bassiana （

4、bals.） vuillemin和布氏白僵菌b. brongniartii （sacc.） petch3。球孢白僵菌的寄生范围广，能够侵染鳞翅目、鞘翅目、同翅目、膜翅目、双翅目等15个目149科707种昆虫4，5。近几年广西蚕茧主产区局部暴发家蚕白僵病，使很多蚕农遭受重大损失，严重影响了广西养蚕业的健康发展。据调查，2008年广西来宾市象州县在56月家蚕白僵病发病率达30%；2009年广西蚕茧主产区宜州市从5月上旬开始暴发家蚕白僵病6-8。因此，有效控制该病的发生和危害已是当务之急。本研究探讨人工紫外光和自然光照射及消毒剂漂白粉对白僵菌孢子萌发和致病力的影响，以期为家蚕白僵病的防治提供科学依据

5、。 1 材料与方法 1.1 材料 白僵菌原粉：广西环江县白僵菌厂生产。 白僵菌菌株：由白僵菌原粉经室内用ppda培养基分离纯化获得。经形态和分子鉴定为球孢白僵菌（beauveria bassiana vuillemin）。 供试家蚕（bombyx mori l.）：两广二号家蚕品种，广西蚕业技术推广总站提供。 1.2 方法 1.2.1 白僵菌原粉对家蚕致病力测定 白僵菌原粉处理蚕体：用白僵菌原粉对蚕体喷粉，喷白僵菌原粉后的家蚕放到直径15 cm的培养皿中正常饲养，饲养温度（251），相对湿度90%。每处理设3个重复，每重复20头家蚕。每个重复喷1 g白僵菌原粉，设蚕体不喷白僵菌原粉为对照。饲养

6、14 d，观察家蚕生长状况，统计累计死亡率。死亡蚕体保湿培养，检查是否有菌丝和分生孢子长出，统计白僵蚕数。白僵菌原粉处理桑叶：用白僵菌原粉喷桑叶，使桑叶两面附着一层薄菌粉，再用这些桑叶饲喂健康家蚕，家蚕取食24 h后换干净新鲜桑叶正常饲喂。饲养温度（251），相对湿度90%。每处理设3个重复，每重复20头蚕。设桑叶不喷白僵菌原粉为对照，饲养14 d，观察家蚕生长状况，统计累计死亡率，死亡蚕体保湿培养，检查是否有菌丝和分生孢子长出，统计白僵蚕数。 1.2.2 白僵菌分离菌株对家蚕的致病力测定 1）孢子悬浮液制备。取已培养好的白僵菌平板（各菌株均采用第二代培养孢子），加入约10 ml 0.1%吐温

7、-80无菌水，用涂布器在平板上轻轻涂布以便将菌体表面的孢子刮下，然后用移液器将孢子悬浮液吸至已灭菌的50 ml三角瓶内，瓶中预先放置数粒灭菌玻璃球，充分振摇后用5层灭菌的纱布过滤。用血球计数板计数滤液孢子数，并计算出孢子浓度。然后将原液按试验要求配制成相应浓度的孢子悬浮液备用。 2）孢子悬浮液对家蚕的致病力测定。浸虫法：取20 ml已配好的白僵菌孢子悬浮液，挑选大小相近的健康家蚕，将其浸入孢子悬浮液中约5 s，取出后用滤纸吸干蚕体上多余的液体，放到直径15 cm的培养皿中用新鲜桑叶喂养。饲养温度为（251），相对湿度为90%。每处理设3个重复，每重复20头蚕。对照用0.1%吐温-80无菌水代替

8、孢子悬浮液。 浸叶片法：取孢子悬浮液40 ml，选取新鲜、大小相近的桑叶，浸入孢子悬浮液中，使整个叶片都充分润湿后取出，置于白磁盘中自然晾干后用于喂养健康家蚕，让蚕取食24 h后换未经处理的新鲜桑叶饲养。饲养温度为（251），相对湿度为90%。每处理设3个重复，每重复20头蚕。对照用0.1%吐温-80无菌水代替孢子悬浮液。 1.2.3 白僵菌孢子萌发率的测定 采用凹玻片法测定白僵菌孢子的萌发率9。将白僵菌孢子悬浮液滴加在洁净凹玻片的凹槽处，置于温度（251）、相对湿度 90%的条件下培养，分别于不同时间用显微镜观察孢子萌发情况，以可见芽管长度大于孢子长度1/2作为萌发标准。每处理重复3次，每重

9、复随机检查5个视野，镜检孢子总数不少于200个，计算孢子萌发率。 孢子萌发率=孢子萌发数/检查孢子总数100% 2 结果与分析 2.1 人工紫外光照射对白僵菌孢子萌发及致病力的影响 2.1.1 人工紫外光照射对白僵菌孢子萌发的影响 用紫外灯（功率20 w，照射距离20 cm）分别照射白僵菌孢子悬浮液1、3和6 h，然后采用凹玻片法测定孢子萌发率，结果见表1。由表1可见，人工紫外光对孢子萌发有明显的抑制作用，经人工紫外光照射后孢子的萌发率明显降低，人工紫外光照射1、3和6 h后白僵菌孢子72 h的萌发率分别为10.250%、2.730%和0.490%，而对照萌发率均为100.000%。 2.1.

10、2 人工紫外光照射对白僵菌孢子悬浮液致病力的影响 用紫外灯（20 w，照射距离20 cm）分别照射白僵菌孢子悬浮液和白僵菌原粉不同时间，然后测定它们对2龄家蚕的致病能力，结果见表2和表3。由表2可知，用人工紫外光照射1、3和6 h后，白僵菌孢子悬浮液对家蚕的致死率分别为6.67%、10.00%和6.67%，与未经人工紫外光照射的孢子相比致病能力明显下降。由表3可知，人工紫外光照射对白僵菌原粉的致病力影响小，照射24 h后其对家蚕的致死率仍达93.33%，与对照相比致死率稍有下降。 2.2 自然光照射对白僵菌致病力的影响 2.2.1 白僵菌孢子悬浮液喷桑叶经自然光照射后的致病力 在室外用白僵菌孢

11、子悬浮液（浓度为1108个/ml）喷洒桑叶，分别于0、3、6、12、24、36 h采集处理过的桑叶饲喂2龄家蚕，测定白僵菌孢子的致病力，结果见表4。由表4可知，将白僵菌孢子悬浮液喷至桑叶后，随光照时间的增加，白僵菌孢子的致病力降低，自然光照射3、6、12、24、36 h后，对家蚕的致死率分别为100.00%、70.00%、79.66%、10.00%和25.00%。 2.2.2 白僵菌原粉喷桑叶经自然光照射后的致病力 用白僵菌原粉喷洒桑叶，分别于0、6、12、24、30、36、48、54、78 h采集处理过的桑叶饲喂2龄家蚕，测定白僵菌原粉对家蚕的致病力，结果见表5。由表5可知，采用白僵菌杀虫剂

12、原粉喷桑叶，经自然光照射036 h后，对家蚕的致死率为88.33%96.67%；48 h后对家蚕的致死率大幅度下降，照射48、54、78 h后对家蚕的致死率分别为53.33%、31.67%和23.33%。可见随着自然光照射时间的增加，桑叶上白僵菌原粉对家蚕的致死率呈下降趋势。 2.2.3 白僵菌原粉喷蚕体经自然光照射后的致病力 直接将白僵菌原粉置于自然光下照射，分别于0、6、12、24、30、36、48、54 h取白僵菌原粉采用喷蚕体法处理2龄家蚕，测定白僵菌原粉经不同时间自然光照射后的致病力，结果见表6。由表6可知，直接置于自然光下照射的白僵菌原粉随光照时间增加对家蚕的致病力下降，30 h后

13、致病力下降明显。 2.3 漂白粉对白僵菌孢子萌发及致病力的影响 2.3.1 漂白粉对白僵菌孢子萌发的影响 采用硫代硫酸钠滴定法测定漂白粉溶液中的有效氯浓度，并配制有效氯为0.30%、1.00%和2.00% 3个不同浓度的漂白粉溶液，采用凹玻片法测定不同浓度漂白粉溶液对白僵菌孢子萌发的影响，结果见表7。由表7可知，有效氯浓度为1.00%和2.00%的漂白粉溶液对白僵菌孢子萌发有很强的抑制作用，72 h孢子萌发率分别为1.000%和0；而有效氯浓度为0.30%的漂白粉溶液对白僵菌孢子萌发无影响，48 h萌发率即可达到100.000%。 2.3.2 漂白粉对白僵菌致病力的影响 先用白僵菌孢子悬浮液浸

14、蚕体或喷桑叶，干后再用不同浓度的漂白粉溶液喷蚕体或桑叶进行消毒处理，测定漂白粉对白僵菌孢子致病力的影响，结果见表8。由表8可见，用有效氯浓度为2.00%的漂白粉溶液消毒叶片比消毒蚕体的效果好，喷桑叶和喷蚕体消毒处理后，2龄家蚕的死亡率分别为5.00%和60.00%。 2.4 漂白粉对白僵菌原粉致病力的影响 先用白僵菌原粉喷粉处理蚕体和桑叶，再分别用有效氯浓度为2.00%、0.40%和0.08%的漂白粉溶液对蚕体或桑叶进行消毒处理，测定漂白粉对白僵菌原粉致病力的影响，结果见表9。由表9可知，用2.00%漂白粉溶液消毒桑叶的效果最好，2龄家蚕死亡率为0，用0.40%和0.08%漂白粉溶液消毒桑叶效

15、果较差，2龄家蚕死亡率分别为71.67%和98.33%；用2.00%漂白粉溶液消毒蚕体有一定的效果，家蚕死亡率为31.67%，而用0.40%和0.08%的漂白粉溶液消毒蚕体没有效果，家蚕死亡率均为100.00%。总体来看，桑叶消毒效果较蚕体消毒效果好。 3 小结与讨论 白僵菌虽然对家蚕造成危害，但它又是一种优良的微生物杀虫剂，在农林害虫防治上发挥了重要作用，特别是在林业松毛虫防治方面有优良效果，因而被大量推广应用10，11。白僵菌孢子与昆虫体壁接触或被食入虫体内，会使昆虫感染发生白僵病而死亡。病死后的虫体会长出白色菌丝和大量的分生孢子，分生孢子随风飘散，又会使其他昆虫感染发病12。因此，白僵菌

16、可在林区较长时间内控制防治对象的虫口密度，但同时也会对其他有益昆虫造成长期危害。广西是松毛虫多发地区，全区平均年发生面积超过2万hm2，严重威胁着森林资源的安全。广西推广使用白僵菌微生物杀虫剂防治松毛虫，能有效控制松毛虫的成灾及危害13。然而，这些白僵菌释放到环境中，随着白僵菌分生孢子的增加和扩散以及在施药过程中造成的直接污染，是否会在释放区域对家蚕等经济类昆虫造成严重威胁，这也是一个被普遍关注的问题。通过此次试验研究发现，白僵菌原粉和从原粉中分离培养的孢子不论以何种方式与家蚕接触，均能使家蚕感染白僵病而死亡。人工紫外光和自然光照射以及漂白粉溶液对白僵菌有杀伤作用。根据这些研究结果，对家蚕白僵

17、病的防治可采取以下措施： 1）在种桑养蚕区喷施白僵菌原粉时，不能将原粉喷洒到桑叶上或蚕室内或蚕体上，桑叶被白僵菌原粉污染后喂蚕或蚕体上污染白僵菌原粉均容易引发家蚕白僵病。如果桑叶不慎被白僵菌原粉污染了，在短期内不能采摘被污染的桑叶喂蚕，必须等到白僵菌原粉在连续几天的自然光照射下失去致病力后或被大雨冲掉后才能采桑叶喂蚕。 2）从田间采回喂蚕的桑叶可用含有效氯2.00%的漂白粉溶液消毒，杀死桑叶上附着的白僵菌孢子，待桑叶晾干后再喂蚕。 3）平时注意蚕具的清洁和消毒，蚕具可用含有效氯2.00%的漂白粉溶液消毒，也可用紫外灯照射6 h以上来杀死蚕具上的白僵菌孢子。蚕室不定期地用紫外灯照射或喷洒漂白粉溶

18、液消毒，但蚕室有蚕时不能用紫外灯照射。 参考文献： 1 沈兴家.广西蚕丝业现状分析和可持续发展对策建议j.中国蚕业，2010，31（3）：1-6. 2 金 伟.家蚕病理学m.北京：中国农业出版社，2001.122-130. 3 高 红，张 冉，万永继.白僵菌的分类研究进展j.蚕业科学，2011，37（4）：730-736. 4 赫英伟.白僵菌的研究概况j.黑龙江农业科学，2010（4）：145-147. 5 meyling n v，eilenber j. ecology of the entomopathogenic fungi beauveria bassiana and metarhizium anisopliae in temperate agroecosystems：potential for conservation biological controlj. biological control，2007，43（2）：145-155. 6 石美宁，朱方容.广西林用白僵菌生物农药对家蚕的致病性试验j.广西农业科学，2010，41（10）：1131-1133. 7 朱方容.广西部分地区桑蚕僵病流行的原因及防控对策j.广西蚕业，2008，45（3）：29-32. 8 廖华珍，商本庆，管相全.广西局部蚕区家蚕僵病暴发和流行的原因及防控措施j.中国蚕业，20