丹参川芎嗪注射液对妊娠期高血压大鼠模型的疗效及胎盘细胞CyclinB1和p21蛋白的影响

1、丹参川芎嗪注射液对妊娠期高血压模型大鼠的疗效及胎盘细胞Cyclin B1和p21蛋白的影响摘要：目的 探讨丹参川芎嗪注射液对妊娠期高血压大鼠模型的效果以及对胎盘细胞中CyclinB1、p21蛋白表达量的影响。方法将孕鼠随机分为4组即：正常妊娠大鼠作空白对照、妊娠高血压大鼠作阴性对照、硫酸镁治疗组妊娠高血压大鼠作阳性对照、丹参川芎嗪注射液组为实验组，每组16只。妊娠14天时，尾静脉注射亚硝基左旋精氛酸甲酯建立妊娠期高血压模型。妊娠第14天开始给药，空白对照组及阴性对照组均给予与药物同剂量的生理盐水；阳性对照组及实验组给予硫酸镁及丹参川芎嗪注射液治疗，3天为一个给药疗程。通过大鼠套尾法测量血压，尾

2、静脉取血法测定24h尿蛋白，并观察各组妊娠大鼠所新生鼠的身长、体重、死胎率、后肢畸形率和胎盘重量，并通过免疫蛋白印迹法测定各组大鼠胎盘细胞中CyclinB1、p21蛋白表达量。结果 建立模型之后，孕鼠尿蛋白以及血压增加，新生鼠的身长、体重和胎盘重量均显著降低，死胎率以及畸形率显著增高；给药治疗后，阳性对照组以及实验组四组孕鼠胎盘组织细胞cyclinB1以及p21浓度，与空白对照组相比较，其他三组患者cyclinB1蛋白浓度均减小（P0.05），p21浓度显著增高 （P0.05）。尿蛋白以及血压减低，新生鼠的身长、体重和胎盘重量均显著升高，差异具有统计学差异（P0.05），阳性对照组与实验组相比

3、较死胎率以及畸形率具有统计学差异（P0.05）。结论 川芎嗪注射液能够显著降低妊娠高血压孕鼠的死胎率以及畸形率，并且新生鼠状况也有所好转，并且能够激活cyclinB1以及下调p21浓度，这可能是川芎嗪注射液治疗效果的原因之一。关键词：丹参川芎嗪注射液；妊娠期高血压；CyclinB1蛋白；p21蛋白中图分类号 TQ460. 7 文献标识码AEffect of Ligustrazine Injection on Hypertension in Pregnancy Salvia and the Efficacy of Placental Cells Cyclin B1 and p21 Protein

4、 in Rat ModelsAbstract : Objective To investigate the effects of Salvia Injection on the effect of TMP rat model of hypertension in pregnancy and placental cells CyclinB1, p21 protein expression.Methods Four groups of rats during pregnancy model method to establish that : normal pregnant rats as con

5、trol , pregnancy-induced hypertension in rats as a negative control , pregnancy-induced hypertension in rats treated magnesium sulfate as a positive control , salvia ligustrazine injection experimental groups n = 12.Blank control group and negative control groups were given the same dose of the drug

6、 saline ; positive control group and the experimental group were given magnesium sulfate and salvia ligustrazine injection therapy , three days a dosing regimen . Sets by measuring blood pressure in rats tail , determination 24h urine protein tail vein blood law , and observe the height of pregnant

7、rats in each group of newborn rats , weight, stillbirth rate, limb deformity rate and placental weight , and by Western blotting Determination of placental cells in rats CyclinB1, p21 protein expression.Results After the fruit modeling , pregnant rats proteinuria and increased blood pressure , Neona

8、tal height , weight and placental weight were significantly reduced , the stillbirth rate and malformation rate was significantly higher ; After drug treatment , the positive control group and the experimental group, four groups of pregnant rats placenta cyclinB1 tissue cells and p21 concentrations

9、compared with the control group , the other three groups of patients cyclinB1 protein concentrations were decreased (P 0.05), p21 was significantly increased (P 0.05).Reduce proteinuria and blood pressure , height of newborn rats , weight and placental weight were significantly increased , with stat

10、istically significant differences (P 0.05), positive control group and the experimental group compared to the rate of stillbirths and deformities with significant difference (P 0.05 ).Conclusion TMP injection can significantly reduce pregnancy-induced hypertension in pregnant rats and deformity rate

11、 stillbirth rate and neonatal rats situation also improved , and the ability to activate p21 cyclinB1 and lower concentrations , which may be one of the therapeutic effect of TMP injection reasons.Keywords Salvia TMP injection ; gestational hypertension ; CyclinB1 protein ; p21 protein ; treatment 妊

12、娠期高血压疾病是临床上极为常见的妊娠期疾病，包括：妊娠期高血压、原发高血压并妊娠、继发高血压合并妊娠、先兆子痫等1。该疾病常常合并产科出血、感染、抽搐，是目前造成孕产妇死亡的主要原因之一。临床研究表明，妊娠期高血压疾病的发生发展与胎盘组织细胞凋亡及凋亡调控蛋白表达失衡有一定的相关性，临床治疗该疾病目前以硫酸镁为主2。但是，硫酸镁治疗该疾病面临着毒性大的危险。因而，需要寻找代替硫酸镁的新型治疗妊娠期高血压疾病药物成为研究热点3。丹参川芎嗪注射液具有解痉、降压作用，对心肌梗塞、高血压等疾病效果良好4。本研究以妊娠期高血压大鼠为疾病模型，用丹参川芎嗪注射液治疗获得良好的效果，结果报道如下。1 材料与

13、方法1.1 材料本研究清洁级雌性SD大鼠购自南京君科生物工程，合格证号：SCXK（鲁）2008-0020。大鼠体重在220g-260g之间，共80只，再购取雄性SD大鼠，重量在220g-260g之间，共80验期间大鼠饲养于动物房中，保持室温在18-28之间，环境清洁、光线适中、饮食正常。1.2 研究方法1.2.1 妊娠高血压疾病模型建立雌雄大鼠混养，第二天检查雌性大鼠阴道的精子，发现精子的大鼠计为妊娠大鼠，为妊娠第一天d1。将孕鼠按照随机数字表法均分为4组：空白对照组、阴性对照组、阳性对照组、实验组，每组含16只大鼠。将阴性对照组、阳性对照组、实验组孕鼠进行妊娠高血压模型建立：给予该三组大鼠于

14、d14静脉注射一氧化氮和酶抑制剂（美国Sigma），给药剂量为7mg/(kg.d），连续4天。空白对照组大鼠：从d14开始，每天定时给予静脉注射生理盐水800uL/d，连续4天。1.2.2 给药方法空白对照组：该组大鼠于d18开始，给予大鼠尾静脉注射生理盐水，0.8mL/d，连续3d。阴性对照组：该组大鼠于d18开始，给予大鼠尾静脉注射生理盐水，0.8mL/d，连续3d。阳性对照组：该组大鼠于d18开始，给予大鼠尾肌肉注射硫酸镁溶液，100mg/(kg.d），连续3d。实验组：该组大鼠于d18开始，给予大鼠尾静脉注射丹参川芎嗪注射液，10mg(kg.d），连续3d。1.3 指标测定1.3.1孕

15、鼠血压测量：应用HX-II小动物血压测量计（北京明心痛生物科技有限公司），然后通过Medlab生物信号采样分析系统（南京美易科技）通过套尾法测定大鼠尾部动脉收缩压。1.3.2 24h尿蛋白测定：从d14天开始收集各组孕鼠24h尿液，测定其体积，并且取其中1mL通过考马斯亮蓝测定尿蛋白浓度。1.3.3 胎盘组织处理：于d21,天，将孕鼠采用10%的水合氯醛3mL/kg，对大鼠进行麻醉。将大鼠进行剖宫，测定胎鼠的身长、重量、死胎率、畸形胎率。并取胎盘组织适量，用PBS洗两遍之后，用眼科剪剪碎，采用研磨器研成匀浆，通过200目尼龙网过滤后，即得单细胞悬液。1.3.4 CyclinB1以及p21蛋白的

16、测定5：采用免疫蛋白印迹法（Western blot）检测所获得胎盘细胞中CyclinB1以及p21蛋白的表达量，具体操作步骤根据免疫蛋白印迹法（Western blot）操作法，即收集取胎盘组织中的细胞，加入细胞裂解液冰上裂解提取蛋白。取30ug定量样品，用SDS-PAGE电泳分离后将蛋白转移至PVDF膜上，然后用5%脱脂牛奶-TBST，室温摇床封闭2h，一抗在37孵育3h，二抗于37孵育1h，ECL发光剂刺激荧光，压片显影定影。用灰度扫描仪处理分析结果。1.4 统计学方法采用SPSS18.0数据统计分析软件，对计数资料采用2分析，正态计量资料采用t检验，并且采用平均值标准差（s）表示，P0

17、.05），差异无统计学意义，并且与未妊娠的大鼠差异无统计学意义（P0.05），表明在建立模型前各雌鼠未孕。在建立模型之后，阳性对照组、阴性对照组、实验组收缩压以及尿蛋白浓度均显著高于空白对照组，差异具有显著性差异（P0.05）。在给药治疗后阳性对照组、实验组患者收缩压及尿蛋白浓度显著高于阴性对照组，差异具有统计学意义（P0.05），具体结果见表1：表1：各组孕鼠血压以及尿蛋白浓度测定Tab.1 Groups of pregnant rats blood pressure and urine protein concentration determination分组例数血压(mmHg)尿蛋白浓度

18、（mg/mL)建模前建模后-给药前给药后建模前建模后-给药前给药后空白对照组16104.32.9102.54.2103.84.1165.313168.115182.417阴性对照组16103.63.1148.34.1*150.25.3*167.31764123*63826*阳性对照组16105.12.9147.23.9*#126.34.8*#166.92061224*#42616*#实验组16102.62.8148.53.6*#125.324.1*#168.21961822*#42317*#“*”与空白对照组具有显著性差异，P0.05；“#”与阴性对照组具有显著性差异，P0.05。2.2 四组

19、孕鼠胎盘重量、死胎率、新生鼠情况比较研究结果显示，在建立模型之后，阴性对照组的新生鼠的体重、身长、以及胎盘重量均显著低于空白对照组，差异具有统计学意义（P0.05），实验组以及阳性对照组 体重、身长、以及胎盘重量均显著高于阴性对照组（P0.05）；阴性对照组新生鼠死胎率、畸形率均显著高于空白对照组，差异具有统计学意义（P0.05），实验组以及阳性对照组 体重、身长、以及胎盘重量均显著高于阴性对照组（P0.05），实验组与阳性对照组无差异，具体结果见图表1： Fig.1 Each new animal placenta weight, body weight, body length, defo

20、rmity rate and mortality注:与正常组相比，模型组P0.05；与模型组相比，*阳性组及给药组P0.05，图二同。2.3 Western blot检测cyclinB1、p21蛋白浓度结果研究结果显示，四组孕鼠胎盘组织细胞cyclinB1以及p21浓度，与空白对照组相比较，其他三组患者cyclinB1蛋白浓度均减小（P0.05），p21浓度显著增高 （P0.05），具体结果见图表2： Fig.2 Western blot Microsoft1 detection cyclinB1, p21 protein concentration3 讨论 妊娠期高血压疾病是妊娠期特有的疾病

21、6，也被称为“胎盘病”。它是一组妊娠与高血压并存的疾病，主要包括子痫前期、子痫、以慢性高血压并发子痫前期以及妊娠期高血压等7。多犯病于妊娠晚期，其典型症状主要由于高血压、蛋白尿以及水肿。当出现抽搐昏迷，血压明显增高，蛋白尿增多时，则会危机母婴的生命8。该疾病的发病率在我国目前达到9.4%-10.4%9。是目前孕产妇以及围生儿发病率、死亡率的主要原因之一10。因而，诊断及治疗该疾病是妇产科研究的重点。目前，硫酸镁是治疗该疾病的主要药物之一，但是，临床研究表明，该药物副作用大。因而，寻找更为有效且安全的药物极为重要11。丹参川芎嗪注射液包括丹参、盐酸川芎嗪，并以甘油为辅料。丹参素能够改善血管微循环

22、，能够促进纤维蛋白的溶解，使血液血流状况得到改善，微循环障碍得到减轻，并且能够延长戊巴比妥对大脑皮层的作用，使大脑皮层自发活动减少12。川芎嗪能够增加血流量、改善微循环，增加胎盘血流量，抑制血栓烷A的分泌。董喜英等人13研究发现丹参注射液联合小剂量阿司匹林治疗妊娠期高血压疾病，结果发现疗效良好，值得临床推广。cyclinB1蛋白是周期蛋白中的一种，能够与细胞核内的Cdk1结合成复合物，该复合物倍cdc25c活化之后才能导致细胞有丝分裂14。p21蛋白是一种广泛应用的细胞周期复兴调控因子，能够抑制CDK1，与其特异性结合使其失活，使细胞周期被阻滞，从而促进细胞的凋亡15。本研究建立妊娠期高血压大

23、鼠模型，并用丹参川芎嗪注射液以及硫酸镁治疗该大鼠模型。结果显示，丹参川芎嗪注射液与硫酸镁在改善大鼠血压以及尿蛋白浓度方面均无显著性差异（P0.05），对新生鼠的身长、胎盘重量方面也无显著性差异（P0.05）。但是，丹参川芎嗪注射液组大鼠及新生鼠的致死率以及畸形率都显著低于硫酸镁组（P0.05），表明丹参川芎嗪能够起到很好的降血压，治疗妊娠高血压的作用，并且副作用小。根据测定胎盘细胞cyclinB1蛋白以及p21蛋白浓度发现，丹参川芎嗪注射液能够激活cyclinB1蛋白以及下调p21蛋白，其可能是该注射液能够治疗大鼠妊娠期高血压的机制之一。但是，该药物还仅限于动物实验模型阶段，其应用于临床还有待

24、进一步研究。参考文献1 De Vera M A, Brard A. Antidepressant use during pregnancy and the risk of pregnancyinduced hypertensionJ. British journal of clinical pharmacology, 2012, 74(2): 362-369.2 Katon W J, Russo J E, Melville J L, et al. Depression in pregnancy is associated with preexisting but not pregnancy-i

25、nduced hypertensionJ. General hospital psychiatry, 2012, 34(1): 9-16.3 张 波，温 权，甘元华.丹参川芎嗪注射液治疗高血压脑出血对外周血C反应蛋白的影响研究J.中国药物与临床.2013，13(12):1599-1600.4 Honetschlagerova Z，Kitada K，Huskova Z，et al Antihypertensive and renoprotective actions of soluble epoxidehydrolaseinhibitionin ANGII-dependent malignant

26、 hypertension are abolished by pretreatment with L-NAMJ JHypertens，2013，31( 2) :321-332.5 席 伟,王建生,张明洁.丹参川芎嗪注射液治疗妊娠期高血压疾病对患者Hcy和VWF水平的影响J.微循环学杂志.2013，43(3):35-36.6乐杰，谢幸，丰有吉.妇产科学M.第6版.北京：人民卫生出版社，2005,97-104。7郭玲，左慧君，刘丝荪.妊娠期高血压疾病病因学的研究进展J.实验与检验医学.2014,32(4):414-418.8 Shiozaki A, Matsuda Y, Satoh S, et al. Impact of fetal sex in pregnancy-induced hypertension and preeclampsia in JapanJ. Journal of reproductive immunology, 2011, 89(2): 133-139.9 范静，李会琴，郭樱.丹参川芎嗪对妊娠期高血压疾病大鼠的疗效分析J.现代妇产科进展.2013,22(9):73-75.10 梁跃雄.丹参川芎嗪对高血压性脑出血血肿吸收及神经功能的影响J.临床与实践.2012,9(11):32-33.11 Felipe Fl