CCK8检测细胞增殖毒性的原理、方法及注意事项

1、CCK8检测细胞增殖/毒性的原理Cell Counting Kit-8 （简称CCK-8）试剂可用于简便而准确的细胞增殖 和毒性分析。其基本原理为：该 试剂中含有WST-8【化学名：2-（2-甲 氧基 4 硝基苯基）-3-（4- 硝基苯基）-5-（2,4-二磺酸苯）-2H-四唑单钠盐】，它在电子载体1-甲氧 基-5-甲基 吩嗪鎓硫 酸二甲酯（1-Methoxy PMS的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产 物（Formazan dye）。生 成的甲瓒物的数量与 活细 胞的数量成正比。因 此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。用途：药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿

2、瘤药敏试验CCK8的优点：?使用方便，省去了洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂；? CCK-8法能快速检测；? CCK-8法的检测灵敏度很高，甚至可以测定较低细胞密度；? CCK-8法的重复性优于MTT法；? CCK-8法对细胞毒性小；? CCK-8细胞活性检测试剂中为1瓶溶液，毋需预制，即开即用。CCK8的缺点：? 与MTT法相 比, CCK8和XTT的价格 比较贵。? CCK8试剂的颜色为淡红色，与含酚红的培养基颜色接近，不注意 的话容易产生漏加或多加。与以往的增殖/毒性测定试剂相比较:检测方法MTT法XTT法WST-1法CCK8法甲臢产物的水溶 性差（需加有 机溶剂溶解）好好产品性状

3、粉末2瓶溶液溶液1瓶溶液使用方法配成溶液后 使用现配现用即开即用即开即用检测灵敏度很高很高检测时间较长较短较短最短检测波长560-600nm420-480nm420-480nm430-490nm细胞毒性高，细胞形 很低，细胞 很低，细胞 很低，细胞 态完全消失形态不变形态不变便捷程度形态不变试剂稳定性批量样品检测非常适合便捷很好非常适合非常便捷二、CCK8检测细胞增殖/毒性的方法实验一：细胞增殖分析1、制备细胞悬液：细胞计数2、接种到96孔板中：根据合 适的铺板细胞数，每孔约100ul细胞悬液， 同样的样本可做3个重复。3、37C培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养2-4小时，如果 不需要

4、贴壁，这步可以省去。4、加入10ul CCK8 :由于每孔加入CCK8量比较少，有可能因试剂沾在 孔壁上而带来误差，建议 在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。或 者直接配置含10%CCK8的培养基，以换液的形式加入。5、培养1-4小时：细胞种类不 同，形成 的Formazan的量也 不一样。如 果显色不够的话，可以继续培养，以确 认最佳条件。特别是血液细胞形 成的Formazan很少，需要较长的显色时间（5-6小时）。6、测定450nm吸光度：建议采用双波长进行测定，检测波长450-490nm , 参比波长600-650nm。实验二：细胞毒性分析1、制备细胞悬液：细胞计数2、接种到96孔板中

5、：根据合 适的铺板细胞数，每孔约100ul细胞悬液， 同样的样本可做3个重复。3、37C培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养2-4小时，如果 不需要贴壁，这步可以省去。4、加入不同浓度的毒性物质5、37C培养箱中培养：加入毒性物质的培养时间，要看毒性物质的性 质和细胞的敏感性，一般 要根据细胞周期来决定，起码要一代以上的时 间。6、加入10ul CCK8 :由于每孔加入CCK8量比较少，有可能因试剂沾在 孔壁上而带来误差，建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。7、培养1-4小时：细胞种类不 同，形成 的Formazan的量也 不一样。如 果显色不够的 话，可以继续培养，以确 认最佳条件

6、。特别是血液细胞形 成的 Formazan 很少 ，需 要较 长的 显色 时 间（ 5-6 小 时） 。8、测定450nm吸光度：建议采用双波长进行测定，检测波长450-490nm ， 参比 波长 600-650nm 。注：? 若暂时不测定0D值，可以向每孔中加入10卩L 0.1M的HCL溶液 或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24 小时 内测定， 吸光度不会发生变化 。?如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK8之前更换新鲜 培养 基（ 除去 培养 基 ，并 用培 养基 洗涤 细 胞两 次， 然后 加入 新 的 培养 基） ，去 掉药 物影响 。当 然药

7、物影 响比较 小的 情况下， 可以 不更 换培 养基 ，直 接 扣除 培养 基中 加入 药 物后 的空 白吸 收即 可 。三、CCK8检测细胞增 殖/毒性的注意事项? 当使 用标 准 96 孔板 时，贴壁 细 胞的 最小 接种 量至 少为 1,000 个 / 孔（100卩l培养基）。检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推 荐接种量不低于2,500 个/孔（100卩l 培养基）。? 酚红和血清对CCK8法的检测不会造成干扰，可以通过扣除空白孔 中本 底的 吸光 度而 消 去。? CCK8可以检测大肠杆菌，但不能检测酵母细胞。在细 胞增殖实验 每次测定的过程中需要避免细菌污染， 以免影响结果。? CCK-8在0-5 C下能够保存至少6个月，在-20 C下避光可以保存 1 年。? 当在 培养 箱内 培养 时 ，培 养板 最外 一圈 的 孔最 容易 干燥 挥发 ， 由 于体积不准确而增加误差。 一般情况下， 最外一圈的孔只加培养 基， 不作 为测 定孔 用 。? 在培养基中加 入CCK8,培养一定的时间，测定450 nm的吸光度 即为空白对照。在做加药实验时， 还应考虑药物的 吸收，可在加 入药 物的 培养 基中 加入 CCK8， 培养 一定 的时 间， 测定 450 nm 的 吸光 度作为空白对照。? 金属对CCK-8显色有影响：当终浓度为1 mM的氯