自用精简版无菌微生物限度

1、2010中国药典附录无菌检查和 微生物限度 检查方法增修订内容 起草的指导思想 一、以科学发展观为统领，服务于资源节约型社一、以科学发展观为统领，服务于资源节约型社 会、环境友好型社会的要求；落实科学监管理念，会、环境友好型社会的要求；落实科学监管理念， 着力解决发展中的问题。着力解决发展中的问题。 二、与时俱进，广泛吸纳先进技术与成果；坚持二、与时俱进，广泛吸纳先进技术与成果；坚持 自主与创新；积极推进药品标准化战略，提高我自主与创新；积极推进药品标准化战略，提高我 国药品标准总体水平，着力提升国药品标准总体水平，着力提升中国药典中国药典在在 国际社会中的地位和作用，提高综合竞争力，促国际社

2、会中的地位和作用，提高综合竞争力，促 进医药产业的健康发展，为构建社会主义和谐社进医药产业的健康发展，为构建社会主义和谐社 会做出贡献。会做出贡献。 自用精简版无菌微生物限度 无菌检查法增修订内容无菌检查法增修订内容 自用精简版无菌微生物限度 无菌检查法增修订内容 一、进一步确定了无菌检查法的定义：一、进一步确定了无菌检查法的定义： 无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、医疗无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、医疗 器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法 。 二、进一步明确了无菌检查保障二、进一步明确了无菌检查保障 1、检查全过程必须严格

3、遵守无菌操作，防止再污染，、检查全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染， 但采用的措施不得影响微生物生长。但采用的措施不得影响微生物生长。 2、无菌检查要进行环境检测。增加了日常检验还需进、无菌检查要进行环境检测。增加了日常检验还需进 行环境检测的要求。行环境检测的要求。 3、无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无、无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无 菌技术的培训。菌技术的培训。 自用精简版无菌微生物限度 三、培养基增修订内容 1、删去硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培、删去硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培 养基的使用范围养基的使用范围 2、删去选择性培养基使用的表面活性剂种类、

4、删去选择性培养基使用的表面活性剂种类 对氨基苯甲酸、聚山梨酯对氨基苯甲酸、聚山梨酯-80等。等。 改成适宜的培养基，选择更灵活。改成适宜的培养基，选择更灵活。 自用精简版无菌微生物限度 培养基适用性检查增修订内容 3、培养基灵敏度试验、培养基灵敏度试验 （1）菌悬液制备中黑曲霉菌悬液制备修改为）菌悬液制备中黑曲霉菌悬液制备修改为 “用适宜的方法吸出孢子悬液用适宜的方法吸出孢子悬液”。 （2）增加在稀释液）增加在稀释液0.9%无菌氯化钠溶液中加无菌氯化钠溶液中加 入入0.05% (v/v)聚山梨酯聚山梨酯80（表面活性剂）（表面活性剂） 两个目的：一是使孢子能均与分散在稀释剂中；两个目的：一是使

5、孢子能均与分散在稀释剂中； 二是减少洗脱过程中对孢子的损伤程度二是减少洗脱过程中对孢子的损伤程度 自用精简版无菌微生物限度 四、试验稀释液、冲洗液增修订为 1、增加根据供试品的特性，可选用其他经验、增加根据供试品的特性，可选用其他经验 证过的适宜的溶液作为稀释液、冲洗液。证过的适宜的溶液作为稀释液、冲洗液。 2、试验中使用的中和剂、灭菌剂和表面活性、试验中使用的中和剂、灭菌剂和表面活性 剂除证明其有效性外还应证明对污染的微生剂除证明其有效性外还应证明对污染的微生 物无影响改为无毒性。物无影响改为无毒性。 自用精简版无菌微生物限度 五、方法验证试验增修订内容 1、实验菌株、实验菌株 删除铜绿假单

6、胞菌增加大肠埃删除铜绿假单胞菌增加大肠埃 希菌及大肠埃希菌菌液的制备（同金黄色葡希菌及大肠埃希菌菌液的制备（同金黄色葡 萄球菌）（铜绿只对个别制剂敏感，大肠大萄球菌）（铜绿只对个别制剂敏感，大肠大 部分敏感）部分敏感） 2、薄膜过滤法、薄膜过滤法 供试品用量供试品用量 将规定量供试品将规定量供试品 按薄膜过滤法过滤按薄膜过滤法过滤 修改为取每种培养基规定修改为取每种培养基规定 接种的供试品总量。接种的供试品总量。 自用精简版无菌微生物限度 六、供试品的无菌检查增修订内容 1、检验量、检验量 直接接种法除另有规定外，每份培养基接直接接种法除另有规定外，每份培养基接 种的供试品量按表种的供试品量按

7、表2、表、表3规定删除采用直接规定删除采用直接 接种法时的规定。（避免重复）接种法时的规定。（避免重复） 2、阴性对照、阴性对照 无菌试验中若使用表面活性剂等应证明其无菌试验中若使用表面活性剂等应证明其 有效性且对微生物生长无影响修改为无毒性。有效性且对微生物生长无影响修改为无毒性。 自用精简版无菌微生物限度 3.薄膜过滤法 增加了抗生素供试品薄膜选择的指导增加了抗生素供试品薄膜选择的指导 应选择低吸附的滤器及滤膜。应选择低吸附的滤器及滤膜。 若需要冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量若需要冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量 一般为一般为100ml，且冲洗量不宜过大修改为总，且冲洗量不宜过大修改为总 冲洗量

8、不得超过冲洗量不得超过1000ml。（指。（指1张滤膜的张滤膜的 冲洗量，不包括供试液的量）冲洗量，不包括供试液的量） （1）水溶液供试品）水溶液供试品 含抑菌成分需用适量的冲洗液冲洗膜修改含抑菌成分需用适量的冲洗液冲洗膜修改 为所用的冲洗量、冲洗同方法验证试验。为所用的冲洗量、冲洗同方法验证试验。 自用精简版无菌微生物限度 （2）装有药物的注射器供试品）装有药物的注射器供试品 取规定量，删去装上无菌针头取规定量，删去装上无菌针头修改为排修改为排 出注射器中的内容物至无菌容器中，若需要出注射器中的内容物至无菌容器中，若需要 可吸入稀释液或标签所示的溶剂溶解，或非可吸入稀释液或标签所示的溶剂溶解

9、，或非 水溶性制剂供试品项下方法操作。水溶性制剂供试品项下方法操作。 （3）无菌气雾剂）无菌气雾剂 供试液的制备将供试品置冰室修改为至少供试液的制备将供试品置冰室修改为至少 的的-20冷冻室约一个小时。（一般的冰箱可冷冻室约一个小时。（一般的冰箱可 能达不到要求。）能达不到要求。） 自用精简版无菌微生物限度 4.直接接种法删除直接接种法删除-内酰胺类或磺胺类供试内酰胺类或磺胺类供试 品。品。 自用精简版无菌微生物限度 表1、表2、表3增修订 表表1（第（第3列）接种每种培养基改为所需的最少检验数量列）接种每种培养基改为所需的最少检验数量 表表2 （表题）上市抽检样品（液体制剂）的最少检验数（表

10、题）上市抽检样品（液体制剂）的最少检验数 量修改为液体制剂最少检验量及上市抽检样品的最少检量修改为液体制剂最少检验量及上市抽检样品的最少检 验数量验数量 第二列每支样品接入每管培养基的最少样品量修改为每第二列每支样品接入每管培养基的最少样品量修改为每 支供试品接入每管培养基的最少样品量支供试品接入每管培养基的最少样品量 第三列最少检验数量（瓶或支）第三列最少检验数量（瓶或支）1全量全量20 修改为供试 修改为供试 品最少检验数量（瓶或支）品最少检验数量（瓶或支）10 注每种培养基各接种注每种培养基各接种10支供试品修改为若供试品每个支供试品修改为若供试品每个 容器内的装量不够接种两种培养基，那

11、么表中的最少检容器内的装量不够接种两种培养基，那么表中的最少检 验数量加倍。验数量加倍。 自用精简版无菌微生物限度 表表3（表题）将上市抽检样品（固体制剂）的最少检验量修（表题）将上市抽检样品（固体制剂）的最少检验量修 改为固体制剂最少检验量及上市抽检样品的最少检验数量改为固体制剂最少检验量及上市抽检样品的最少检验数量” 第三列最少检验数量、第三列最少检验数量、1全量全量20 修改为供试品最少检验数 修改为供试品最少检验数 量（瓶或支）量（瓶或支）10 注每种培养基各接种注每种培养基各接种10支供试品修改为若供试品每个容器支供试品修改为若供试品每个容器 内的装量不够接种两种培养基，那么表中的最

12、少检验数量加内的装量不够接种两种培养基，那么表中的最少检验数量加 倍。倍。 自用精简版无菌微生物限度 微生物限度增修订内容微生物限度增修订内容 自用精简版无菌微生物限度 修改内容 1、培养条件、培养条件 控制菌培养温度控制菌培养温度3537修改修改 为为3035。 自用精简版无菌微生物限度 增修订内容 2、结果报告、结果报告 特殊品种可以最小包装单位报特殊品种可以最小包装单位报 告告 特殊品种包括：特殊品种包括： 药典规定微量包装样品的检验量可以酌减。药典规定微量包装样品的检验量可以酌减。 还有一些贵重药品也可以考虑检验量。还有一些贵重药品也可以考虑检验量。 自用精简版无菌微生物限度 3、检验

13、量增修订内容 （1）中药膜剂检验量）中药膜剂检验量50cm2修改为修改为100cm2。 （2）沙门菌检验量修改为检验量为）沙门菌检验量修改为检验量为20g或或 20ml并注明（其中并注明（其中10g用于阳性对照）。用于阳性对照）。 自用精简版无菌微生物限度 4、供试液的制备增修订内容 （1）供试品检查时使用表面活性剂应证明其）供试品检查时使用表面活性剂应证明其 对微生物生长和存活无影响修改为无毒性。对微生物生长和存活无影响修改为无毒性。 （2）供试液的制备若需要加温时，可采用其）供试液的制备若需要加温时，可采用其 它经验证的方法，但应均匀加热，且温度不它经验证的方法，但应均匀加热，且温度不 应

14、超过应超过45。 自用精简版无菌微生物限度 （3）新增贴剂供试液制备 供试液的制备供试液的制备 经验证方法制备成供试液在无菌环境进行经验证方法制备成供试液在无菌环境进行 避免粘贴面粘合在一起（可用无菌纱布粘避免粘贴面粘合在一起（可用无菌纱布粘 在粘贴面上）在粘贴面上） 置于含有表面活性剂（如聚山梨酯置于含有表面活性剂（如聚山梨酯80或卵或卵 磷脂）的稀释液剂中，制成供试品。磷脂）的稀释液剂中，制成供试品。 充分振摇。充分振摇。 也可采用其它适宜的方法制备成供试液。也可采用其它适宜的方法制备成供试液。 自用精简版无菌微生物限度 具抑菌活性的供试品正修订内容 删除应消除供试液的抑菌活性修改为当供试

15、 品具有抑菌活性时，应尽量选择操作简便、 快速的方法，应避免损伤供试品中污染的微 生物。在供试品溶液性状允许的情况下，应 尽量选择薄膜过滤法。 自用精简版无菌微生物限度 离心沉淀集菌法 两次离心修改为一次离心；500转/分离心， 不超过3分钟，取全部上清液用于检查。(去 掉了3000转/分离心，20分钟的操作，回收率 低。方法改后需重新验证) 供试品 污染菌特性 适用范围 仅使用于微生物限度检查供试液的制备 尽量避免使用，不可使用快速离心。 自用精简版无菌微生物限度 5.细菌、霉菌及酵母菌计数增修订内 容 新增 计数培养基的适用性检查 菌种 大肠埃希菌44102 G+ 金黄色葡萄球菌26003

16、 G- 枯草芽孢杆菌63501 芽孢杆菌 白色念珠菌98001 酵母菌 黑曲霉98003 霉菌 自用精简版无菌微生物限度 增加了菌悬液的制备及保存条件 菌悬液制备后在室温下放置应在2小时内 使用，若保存在2-8可以在24内使用。黑曲 霉孢子菌悬液可保存在2-8，在验证过的存 贮期内使用，每株试验菌平行制备2个平皿， 混匀，凝固，按规定条件培养计数，同时用 相应的对照培养基替代被检培养基进行上述 试验。 增加了对照培养基。 新增常见干扰物的中和剂和灭活方法 自用精简版无菌微生物限度 平皿法 删去采用平皿法进行菌数测定时， 连续2-3个稀释级的供试液。 修改为按计数方法的验证试验确认的程序 进行供

17、试液制备。 6、供试品检查增修订内容、供试品检查增修订内容 自用精简版无菌微生物限度 培养时间修改内容 除另有规定外，细菌培养48小时改为3天，霉 菌、酵母菌培养72小时改为5天，必要时，可 适当延长培养时间至7天进行菌落计数并报告。 自用精简版无菌微生物限度 菌数报告规则增修订内容 若同稀释级两个平板的菌落平均数不小于 15，则两个平板的菌落数不能相差1倍或以上。 细菌、酵母菌和霉菌平均菌落数在30-300、 30-100之间的稀释级修改为选取菌落数小于 300cfu和100cfu的稀释级作为菌数报告的依 据。 自用精简版无菌微生物限度 薄膜过滤法增修订内容 新增内容 采用其他直径的滤膜，冲

18、洗量应相 应的进行调整（如使用滤膜直径增大冲洗液 量也应相应增加，可保证冲洗液覆盖整个滤 膜）。 删去每片滤膜的总过滤量不宜过大，修改为 总冲洗量不得超过1000ml。 自用精简版无菌微生物限度 7、控制菌检查增修订内容 增加控制菌检查用培养基的适用性检查； 检查项目包括促生长、抑制及指示能力检查 参照表2 自用精简版无菌微生物限度 新增培养基适用性检查方法 液体培养基促生长能力检查 最短时间 固体培养基促生长能力检查 培养基抑制能力检查 最长时间 液体培养基指示能力检查 固体培养基指示能力检查 试验结果与对照培养基比较 自用精简版无菌微生物限度 控制菌检查用培养基的适用性检查 控制菌检查用培

19、养基的促生长，抑制及指示能力检查 控制菌检查 培养基 特性 实验菌株 大肠埃希菌 胆盐乳糖 促生长能力 大肠埃希菌 抑制能力 金黄色葡萄球菌 MUG 促生长能力指示能力 大肠埃希菌 曙红亚甲蓝 或麦康凯 促生长能力指示能力 大肠埃希菌 大肠菌群 乳糖胆盐 促生长能力 大肠埃希菌 抑制能力 金黄色葡萄球菌 乳糖发酵 促生长能力指示能力 大肠埃希菌 曙红亚甲蓝 或麦康凯 促生长能力指示能力 大肠埃希菌 自用精简版无菌微生物限度 沙门菌 营养肉汤 促生长能力 乙型付伤寒沙门菌 四六磺酸钠亮绿 促生长能力 乙型付伤寒沙门菌 抑制能力 金黄色葡萄球菌 胆酸硫乳琼脂或沙门、志贺氏属琼脂培养基 促生长能力指

20、示能力 乙型付伤寒沙门菌 三糖铁琼脂 培养基 指示能力 乙型付伤寒沙门菌 铜绿假单 胆盐乳糖 促生长能力 铜绿假单胞菌 胞菌 抑制能力 金黄色葡萄球菌 溴化十六烷基三 促生长能力 铜绿假单胞菌 甲胺琼脂 抑制能力 大肠埃希菌 绿脓菌素测定 用培养基 促生长能力指示能力 铜绿假单胞菌 金黄色葡 亚碲酸盐肉汤 促生长能力 金黄色葡萄球菌 卵黄氯化钠琼脂 促生长能力指示能力 金黄色葡萄球菌 或甘露醇盐琼脂 抑制能力 大肠埃希菌 梭菌 梭菌增菌培养基 促生长能力 生孢梭菌 白色念 沙氏葡萄糖肉汤 促生长能力 白色念珠菌 珠菌 沙氏葡萄糖琼脂 促生长能力指示能力 白色念珠菌 念珠菌显色培养基 促生长能力

21、指示能力 白色念珠菌 吐温80玉米琼脂 促生长能力指示能力 白色念珠菌 自用精简版无菌微生物限度 控制菌检查法增修订内容 疑似致病菌的确证 微生物控制菌检查中没有规定进一步确证疑 似致病菌的方法。选择已被认可的菌种鉴定 方法。如伯杰氏细菌鉴定手册 控制菌检查方法验证 删去阴性菌对照组。 自用精简版无菌微生物限度 大肠菌群检查用胆盐乳糖培养基改为乳糖 胆盐。（食、保、化均用。灵敏度比胆盐乳 糖稍高，加了指示剂，结果好判断） 改梭菌检查用庖肉培养基为梭菌增菌培养 基。（庖肉培养基只对破伤风杆菌灵敏度好， 且结果不易观察。照顾大多数梭菌） 改梭菌培养时间72-96小时为48小时。 自用精简版无菌微生

22、物限度 增加了白色念珠菌检查方法 增菌培养 沙氏葡萄糖肉汤培养基 分离培养 划线接种于沙氏葡萄糖琼脂培养 基平板上。 阴道、尿道用药不得检出。 自用精简版无菌微生物限度 鉴定试验 典型菌落 沙氏葡萄糖琼脂培养基 菌落呈乳白色偶见淡黄色，表面光滑有酵母 气味，时间稍久则菌落增大，颜色变深、质 地变硬或有褶皱。 念珠菌显色培养基 菌落呈绿色或翠绿色菌落生长。 自用精简版无菌微生物限度 确认试验 取1%吐温80-玉米琼脂培养基 培养物进行染色，镜检及芽管试验。 结果判定 非革兰阳性菌，显微镜下未见厚膜孢子、假 菌丝、芽管判未检出白色念珠菌。 自用精简版无菌微生物限度 新增微生物限度检查法指导原则 一

23、、抑菌剂效力检查法指导原则 二、药品微生物检验替代方法验证指导原则 三、微生物限度检查法应用指导原则 四、药品微生物实验室规范指导原则 自用精简版无菌微生物限度 三、药品微生物限度检验法应用指导原则 目的 为更好的应用微生物限度检查法及限度 标准的合理执行提供指导。 用途 用于判断非规定灭菌制剂及原料、辅料 是否符合药典的规定，也可用于指导制剂、 原料、辅料的微生物质量标准的制定，及指 导生产过程中间产品微生物质量的监控。 本指导原则将对标准和方法中的特定内容及 标准的应用做进一步的说明。 自用精简版无菌微生物限度 1.微生物限度检查过程中，如需要使用表面 活性剂、灭活剂及中和剂，应对其用量、

24、有 效性、无毒性进行确认，无毒性确认，试验 的菌株应包括产品中可能污染的微生物。 自用精简版无菌微生物限度 2.检验方法的选择 供试品制备应尽量选择微生物限度检查法中 操作简单、快速的方法，且应避免损伤供试 品中污染的微生物。 对于抑菌作用较强的供试品，在供试品溶液 性状允许的情况下，应尽量选用薄膜过滤法 进行试验。 自用精简版无菌微生物限度 3.供试品制备 本指导原则对离心沉淀法使用范围、方法及对检 验结果影响的因素进行了分析和指导。 4.验证试验存在的问题及处理方法 自药典收载方法验证以来实施过程中存在一 些具体问题，对这些存在问题进行了指导； 进行验证试验时，因没有适宜的方法消除供试品

25、中的抑菌作用而导致微生物回收的失败。 自用精简版无菌微生物限度 （1）处理方法 应采用能使微生物生长的更高稀释级供试 液进行方法验证试验。 若采用允许的最高稀释级供试液进行验证 试验还存在一株或多株试验菌的回收率达不 到要求。 处理方法 应选择回收情况最接近要求的 方法进行供试品的检测。 自用精简版无菌微生物限度 在以上情况下，生产单位或研制单位应进 行全面的风险评估以保证检验方法的可靠性， 从而保证产品质量。 自用精简版无菌微生物限度 5.控制菌的确认 没有规定进一步确证疑似致病菌的方法。仅 规定若供试品检出疑似致病菌，确证的方法 应选择已被认可的菌种鉴定方法。 自用精简版无菌微生物限度 6

26、.微生物限度标准 该指导原则对标准执行中存在的问题进行了 分析和指导； （1）明确了微生物限度标准使用范围 （2）标准执行 必检项目 原则性要求 （二部：丸剂、 口服片剂、 胶囊剂、 颗粒剂），应对其被微 生物污染的风险进行评估。 自用精简版无菌微生物限度 （3）用于手术、烧伤及严重创伤的局部给药 制剂应符合无菌检查法要求。 （4）用于创伤程度难以判断的局部给药制剂， 若没有证据证明药品的不存在安全性风险则 应符合无菌检查法要求。 （5）眼用制剂应符合无菌检查法要求。 自用精简版无菌微生物限度 （6）含动物组织（包括提取物）的口服给药 制剂要求不得检出沙门菌。其中的动物类原 药材粉是指除蜂蜜、

27、王浆、动物角、阿胶外 的所有动物类原药材粉，如牡蛎、珍珠等贝 类，海蜇、冬虫夏草、人工牛黄等。 （7）制定合理、安全和严格的微生物限度标 准。 自用精简版无菌微生物限度 四、药品微生物实验室规范指 导原则 自用精简版无菌微生物限度 1.目的 该指导原则用于指导药品微生物实验室的质 量控制。 2.药品微生物的检验的对象具特殊性； 活的生物、分布不均匀、重现性差 必须使用经验证的检测方法并严格按照药品 微生物实验室规范要求进行试验。 自用精简版无菌微生物限度 3.药品微生物实验室规范包括以下几个方面： 人员、培养基、菌种、实验室的布局和运行、 设备、文件、实验记录、结果的判断等。 （1）人员 从事

28、药品微生物试验工作的人员应具备微生物学 或相近专业知识的教育背景 自用精简版无菌微生物限度 检验人员和管理人员培训 进行岗前培训 检验人员 技能培训 熟悉相关检测 方法、程序、检测目的和结 果评价。 自用精简版无菌微生物限度 管理人员 其专业技能和经验水平应与他们的职责范 围相符。不断接受系统的教育与职责范围相 关的培训。 客观评估检验人员的能力，必要时对其进 行再培训并重新评估。 自用精简版无菌微生物限度 2.培养基 培养基是微生物试验的基础，直接影响微生 物试验结果。适宜的培养基制备方法、储存 条件和质量控制试验是提供优质培养基的保 证。 该指导原则对培养基的制备、储存、灭菌剂 质量控制进

29、行了指导。 自用精简版无菌微生物限度 3. 菌种 实验室菌种的出来和保藏的程序应标准化， （1）使尽可能减少菌种污染和生长特性的改 变。 （2）按统一操作程序制备的菌株是微生物试 验结果一致性的重要保证。 自用精简版无菌微生物限度 该指导原则对菌种的来源、菌种保藏、菌种 的传代和使用、菌种的管理进行了详细的说 明和指导。 自用精简版无菌微生物限度 2、菌种保藏的原则 （1）标准储备菌株可用于制备每月或每周一 次转种的工作菌株。冷冻菌株一旦解冻转种 制备工作菌株后，不得重新冷冻或再次使用。 （2）工作菌株不可代替标准菌株，标准菌株 的商业衍生物仅可用作工作菌株。 自用精简版无菌微生物限度 3.菌种的传代和使用 （1）工作菌种的传代次数应严格控制，不得 超过5代防止过度的传代造成菌种变异，工作 菌株不可代替标准菌株。 （2）任何亚培养的形式均被认为是转种或传 代一次。实验室应对工作菌株的特性和纯度 进行确认。 自用精简版无菌微生物限度 4.菌种的管理 严格