黑曲霉基因组与柠檬酸生产菌种改造

1、黑曲霉基因组简介 和 柠檬酸菌种改造初步方案 (筹) 实例：基因组重测指导赖氨酸高 产菌株构建 Ohnishi et al. 2002 比较基因组学 3个点突变野生 型菌株： 080g/l 50h27h 1.解密黑曲霉基 因组 Nick Read 1991 黑曲霉测序大事记 2000.07. 荷兰帝斯曼DSM公司启动了对其拥有的黑曲霉菌株CBS 513.88的测序计划，采用BAC加shortgun法 2001.12. 测序完成，8倍覆盖率，500 contigs，34.5Mb，1.3万基因 大约同时，Integrated Genomics 完成对黑曲霉菌株ATCC 9029测序， 4X，1万c

2、ongtigs 2006.美国能源部JGI完成对柠檬酸生产菌黑曲霉ATCC 1015测序，8X 2007.02. DSM及合作伙伴在Nature Biotechnology上发表论文，对黑曲 霉基因组进行系统阐述，并公布序列 同期，JGI也公布其序列 2007.09. 德国HZI孙际宾等在Genome Biology杂志上发表论文，对其代 谢网络进行比较分析，初步阐明黑曲霉累积柠檬酸的机理 SFB578从基因到产品 德国研究基金会DFG 特别研究领域项目 2001启动，现在刚开始第三期 德国HZI/TU Braunschweig 主要研究对象: 黑曲霉Aspergillus niger和巨大芽

3、孢杆菌Bacillus megaterium 16-20个动态子项目 子项目：代谢和调控网络的生物信 息学 黑曲霉CBS 513.88 基因组 比较组学：揭示高产性状的分子 基础假设 比较野生型与高产 菌株发现差异 高产菌株之所以高 产的分子机理是什 么 生产效率高 转化率高 副产物少 生长性能好 形态学优 耐受性高 Time P Hyperproduction mutant Wild type strain 转录组 蛋白组 代谢组 代谢流组 Interactome ?组 基因组 用于比较分析的基因组（2007年） StrainAbbrev. size of proteomeBiologica

4、l or biotechnological relevance A. niger CBS 513.88ands14165柠檬酸和工业酶生产 A. niger ATCC 9029anig13937工业酶生产 A. niger ATCC 1015anjg11200柠檬酸生产 A. oryzaeaor12059food and beverage A. fumigatusafm9923pathogenic and allergenic A. nidulansani9541model for genetics and cell biology F. graminearumfgra11640plant p

5、athogen M. griseadmgr11109plant pathogen N. crassadncr10620model for genetics S. cerevisiaesce5863food, beverage, and model organism And other 12 eukaryotes 曲霉属基因组2009 Aspergillus (Emericella) nidulans Aspergillus aculeatus Aspergillus awamoriNBRC 4314 Aspergillus carbonariusITEM 5010 Aspergillus ca

6、rbonariusITEM 5010 Aspergillus clavatusNRRL1 Aspergillus flavus Aspergillus flavusNRRL3357 Aspergillus flavusNRRL3357 Aspergillus fumigatusA1163 (CEA10) Aspergillus nidulansFGSC A26(biA1) Aspergillus nigerCBS 513.88 Aspergillus nigerATCC 1015 Aspergillus nigerATCC 9029 Aspergillus parasiticus Asperg

7、illus terreusATCC 20542 Aspergillus terreusNIH 2624 Aspergillus terreus 18个菌株已经 被测序或正在 进行测序 Gene and pathways of protein secrection N ER VE P G Entry into ER Processes in ER Protein misfolding Protein complexes involved in protein transport Vesicle formation and docking ER to Golgi and intra-Golgi t

8、ransport Golgi and post-Golgi protein sorting Glycosylation In cooperation with B4 and the A.niger annotation team 黑曲霉基因组测序和注释 帝斯曼公司等26个研究机构 合作 全面的基因组注释 33M 碱基对 14165基因 初步代谢分析 详尽的蛋白质分泌途径 Pel et al. (2007) Genome sequencing and analysis of the versatile cell factory Aspergillus niger CBS 513.88. Natu

9、re Biotechnology, 25:221-231. 重构黑曲霉基因组规模代谢网络 重建黑曲霉代谢网络 999 EC numbers 2443生化反应 2349代谢物 8倍于文献报道数据 柠檬酸产生相关代谢途径 提出基因冗余作为有机酸过量 生产的自然机制 提出了多个代谢工程靶位点 AOX和CS No Image Sun et al. Genome Biology, 2007, 8:R182 为什么黑曲霉生产柠檬酸供氧至 关重要？ 葡萄糖 + 2ADP + 2NAD 2丙酮酸 + 2ATP + 2NADH 丙酮酸 + CoA + NAD 乙酰CoA + NADH + CO2 丙酮酸 + A

10、TP + CO2 草酰乙酸 + ADP 乙酰CoA+草酰乙酸 柠檬酸 + CoA 葡萄糖 + ADP + 3NAD 柠檬酸 + ATP + 3NADH ATP ADP: 生长，维持，穿膜运输，产热 3H2O1.5O2 9ADP 9ATP 呼吸链 AOX-alternative mitochondrial oxidoreductase 其他线粒体氧化还 原酶 Citrate production: ATP and NADH excessive AOX Cytochrome / electron transfer chain independent critical role in the cit

11、ric acid production Knockout/overexpression of the know AOX have no effect on citrate production additional and unique AOX now found in A.niger strains 小结 过量表达黑曲霉特异性的柠檬酸合成酶， 可能会加快柠檬酸合成速度 过量表达可能加强NADH的循环，从而消除 瓶颈，加快柠檬酸产生速度 但是，并不能降低O2的消耗和热量的 产生 问题： 如何将NADH循环而不消耗氧气和产生热量？ 2.柠檬酸生产菌株改造方案 q基因组测序作为分子改造基础 q阻断

12、草酸合成 q加快柠檬酸合成速度 q高温柠檬酸发酵菌种 超高速基因组排序技术 illumina/Solexa -每个机器排序周期（5天）产生 20GB 数据 -相当于将黑曲霉测70次 Roche 454 technology/FLX -7.5小时将大肠杆菌排序20次 -材料费 1万欧元 ABI/SOLiD 未来数年内： 人类基因组1000$ 细菌基因组100$ 超高速、廉价 Roche 454 technology 比较野生型与生产菌株基因组， 将 鉴定更多的靶点 拷贝数、新酶 酶的表达调控 酶的构象与活性调控 大大加快分子生物学改造工作 大大其他系统生物学手段的应用，阐明高 产机理，大幅度改造

13、菌种 长期目标 转录组、蛋白质组、代谢组 2.柠檬酸生产菌株改造方案 q基因组测序作为分子改造基础 q阻断草酸合成 q加快柠檬酸合成速度 q高温柠檬酸发酵菌种 草酸合成途径 草酰乙酸水解酶：草酰乙酸 + 水 草酸 + 乙酸 exclusively produced via oxaloacetate (Kubicek et al. 1988; Pedersen et al. 2000a; Ruijter et al. 1999) catalyzed by oxaloacetate hydrolase (EC 3.7.1.1). Pedersen et al. 2000b：克隆了该酶基因oah，

14、并随后证明将该酶缺失，则完全阻断草酸 合成(Pedersen et al. 2000a). 生物信息学分析表明黑曲霉有至少8个基因 与oah有同源性，不排除发生微量副反应的 可能性 实验方案：敲除oah基因 难点：考虑柠檬酸的食品应用，基因敲除 菌株不能包含有外源DNA片段 策略：两次敲除 野生型； 第一次依靠同源重组将oah大部分以抗 性标记+GFP蛋白替换，抗性为选择标 记； 第二次同源重组将抗性基因和GFP以不 完整的oah基因替换，选择标记为菌落 颜色 oah 抗性GFP LR RL oah 2.柠檬酸生产菌株改造方案 q基因组测序作为分子改造基础 q阻断草酸合成 q加快柠檬酸合成速度

15、，缩短 发酵周期 q高温柠檬酸发酵菌种 Black box gray box white box Medium pH, pO2, rpm products X-OMICS + Dynamics + Regulation 方案：加快柠檬酸合成速度，缩 短发酵周期 过量表达柠檬酸合成酶和第二个AOX 将NADH导向有益的物质合成途径 比较组学阐明机理，在野生型菌株基础上 鉴定和整合更多突变 计算生物学数据集成与分析; 全细胞网络模型化; 理性代谢工程设计 系统生物技术菌种改造流程 系统代谢工程操作 转录组 蛋白组 代谢组 代谢流组 Interactome ?组 基因组 实验室小试及工艺优化 中试放大、项目转让 高通量组学，定量描述细胞生理 野生型 工业生产菌 高通量筛选突变株 不同来源菌株 高通量筛选突变株 发酵过程组学测定 过程数据整合 新型构建策略 2.柠檬酸生产菌株改造方案 q基因组测序作为分子改造基础 q阻断草酸合成