医学免疫学实验：实验三 ELISA双抗体夹心法检测癌胚抗原

1、医学免疫学实验 实验三实验三 ELISAELISA双抗体夹心法检测双抗体夹心法检测癌胚抗癌胚抗原原 医学免疫学实验 1 实验目标 理解原理， 学会操作。 实验背景 理论要点， 技术方法 实验步骤 在操作中发现问题， 总结经验 结果分析 判断+/性 医学免疫学实验 01 实验目标 1、 学习并熟悉双夹心ELISA方法 能够了解双夹心ELISA方法的基本原理和操作步骤，重点是抗原抗体复合物的形成。 2、完成该方法的应用 能够按照实验步骤正确操作后得到最终结果，理解该方法的实验应用和意义。 3、掌握实验结果分析 能够依据实验结果正确分析样品，并总结实验过程中的注意事项。 医学免疫学实验 02 实验背

2、景 什么是癌胚抗原（CEA）？ 辅助诊断 CEA最初发现于结肠癌和胎儿肠组织中，故名癌胚抗原。正常人群CEA水平低于5ng/mL。在多种癌症当 中（如大肠癌、胰腺癌、胃癌、乳腺癌等）可见CEA升高。但CEA升高并不代表患癌，因为吸烟、妊娠 期或其他疾病也可以引起CEA升高。所以CEA不是恶性肿瘤的特异性标志，在临床诊断上只有参考价值。 区别良/恶性肿瘤 虽然CEA升高无早期诊断价值，但对鉴别良性与恶性肿瘤有重要提示。 医学免疫学实验 02 实验背景 直接法 间接法 竞争法 ELISPOT ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 酶联免疫吸附测定酶联免疫

3、吸附测定 抗原与抗体的特异性反应 酶对底物的高效催化作用 保持抗原抗体反应的特异性 酶催化底物显色的高效性； pg水平微量检测 反应液颜色深浅或光密度值 高度特异性 高灵敏度 定性定量检测 医学免疫学实验 1 2 3 4 02 实验背景 抗体（一抗）的包被 CEA抗体（一抗）溶于碳酸盐缓冲液中，被吸附在固相载 体（聚苯乙烯等）表面；之后用富含蛋白的封闭液将没有吸 附抗体的表面封闭。 抗原-抗体复合物的形成 在适当温度及充分反应时间的条件下，样品中游离的抗原会 被固相载体表面的抗体捕获。 酶标抗体（二抗）的结合 带有偶联酶的抗体一方面可以识别并结合CEA抗原的另外抗 原决定簇，另外也保持着酶的活

4、性。 4 3 2 1 酶催化底物反应 底物经过酶的催化发生肉眼可见颜色的变化，通过测定OD读 值从而定量CEA抗原。 医学免疫学实验 02 实验背景 双夹心法需要两种抗体，应用的原则是该两种抗体都可以与靶抗原发生特异性结合 且识别的抗原决定簇不一致。 ELISA中的酶以辣根过氧化物酶(HRP)常用，发生氧化还原反应（注意及时终止），四 甲基联苯胺（TMB）常用作为可视化显色反应的底物，在HRP催化下会产生可溶性蓝 色产物，颜色深浅与抗原浓度成正比。 稀硫酸是以上体系中常用的终止液，不仅可以使酶失活，终止酶促反应，另外也可以 降低PH，发生离子化合物的转变，呈现出黄色，在最大吸收波长450nm测

5、定OD读值。 医学免疫学实验 03 实验内容准备 1、待测样品 阴性对照，15号标准样品（ 5/10/20/40/80ng/ml ），2份待检样品 2、酶微孔反应板 包被有CEA抗体 3、洗涤液 用蒸馏水稀释成1 4、酶标抗体 含HRP标记的CEA抗体 5、底物显色液A(含过氧化氢)、底物显色液B(含TMB) 6、终止液 稀硫酸 7、移液器、吸水纸、废液缸、37孵箱、 酶标仪 医学免疫学实验 03 实验内容步骤 （1）加样 依次加入（从上至下）阴性对照，15号标准样品，2份待检样品，每孔100ul，轻轻混匀； （2）温育 于37湿盒内孵育30分钟； （3）洗板 甩去孔内液体，用洗涤液注满各孔（

6、200ul），轻拍10秒，甩干；重复4次后，将酶标板于吸水纸上拍干； （4）加酶 每孔100ul加入酶标抗体，轻轻混匀； （5）温育： 于37湿盒内孵育30分钟； （6）洗板 同步骤3 （7）显色 每孔各50ul加入显色剂A、B，轻轻混匀，于37湿盒内孵育15分钟； （8）终止 每孔50ul加入终止液； （9）测定 酶标仪单波长450nm测定各孔OD值(或使用双波长法，参考波长630nm)。 医学免疫学实验 04 结果分析 1.绘制剂量反应曲线： 以标准品抗原含量为横坐标，以对应的OD值为纵坐标绘制标准曲线。待测样品CEA含量可 根据标准曲线计算得到。 2.结果判定：测定标本CEA含量15ng/ml时为癌胚抗原阳性。 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 20 40 60 80 100 医学免疫学实验 05 讨论注意事项 1、平衡酶标板 正式前将酶标板于室温平衡30分钟 2、加样 不同样品要更换枪头，贴壁打入，切忌枪头触碰酶标板孔底 同一样品可重复使用枪头，但需要悬空加样；防止交叉污染 酶标板底尽量保持干净，完整 3、时间和温度 按操作步骤严格控制孵育时间及温度 4、洗涤 第一次洗板时，避免