(完整word版)RIP实验技术

1、 【实验技巧】rip 实验技术近年来，长非编码 rna（lncrna）得到了研究界的广泛关注。如今，人们已经鉴定了大量lncrna，但大多数 lncrna 的功能还未明确。为了解决这一问题，研究者们开始对 lncrna 的互作蛋白进行研究，并为此开发出了越来越多的分析工具。 下面我们来介绍一下 rip 技术。rna 结合蛋白免疫沉淀技术又称为 rip（rna immunoprecipitation），可以说是 rna 版的 chip（染色质免疫沉淀），该技术能帮助人们分析与 rna 结合蛋白相关的核酸。在 rip 试剂盒（如 sigma 的 imprint rna immunoprecipit

2、ation kit）的帮助下，研究者们能够利用针对 rna 结合蛋白的抗体，从细胞提取物中捕获与蛋白相结合的 rna，再通过 qpcr、芯片或二代测序技术对这些 rna 进行鉴定。不论是细胞质还是细胞核，都会发生 rna 与蛋白的相互作用。据 active motif 公司产品经理 kylehondorp 介绍，该公司的 rna chip-it kit 专用于研究 rna 与细胞核染色质的相互作用。该试剂盒通过甲醛固定来锁定 rna-染色质的互作，随后对染色质进行超声，并用 dnase i 处理，最后利用磁珠进行沉淀。“如你研究的是总 mrna，那么常规 rip 试剂盒更合适一些，”hondo

3、rp 说，“常规 rip 试剂盒可以处理所有细胞裂解物的总 mrna。”生产 magna rip rna-binding protein immunoprecipitation kit 的 emd millipore 公司，也在开发专门针对染色质的 rip 试剂盒。预计这一新产品将于 2014 年第一季度发布，该产品有化学交联与 native 两种形式。据介绍，化学交联可以分析究间接的蛋白-rna 相互作用，研究更高分子量的蛋白复合物。而 native 方法展现的是，亲和力更高也更为直接的相互作用。除 rip 以外，clip（uv crosslinking and immunoprecipit

4、ation）也可以帮助人们捕捉与 rna结合蛋白互作的核酸。clip 方案整合了交联与核酸酶消化，不仅允许对 rna-蛋白复合物进行进一步的纯化（如凝胶电泳片段分离），还能够揭示 rna-蛋白互作所发生的位点。最近人们又开发出了新型 clip 技术iclip（individual-nucleotide resolution clip），该技术能够以单个碱基的分辨率，来展示 rna-蛋白互作的详细信息。据伦敦大学学院的 jernej ule 教授介绍，clip 与 rip 的关键性差异，在于沉淀复合物后的凝胶纯化步骤。clip 技术可以给 rna-蛋白复合物的 rna 末端带上放射性标记，并将这

5、些复合物进行 sds-page 分离，之后转移到一张膜上。这样的过程可以提高纯化的特异性，减少非特异性的 rna。蛋白酶消化可以将 rna 从膜上解离下来，用于制备 cdna 文库，以备测序分析。“clip 要比 rip 麻烦一些，不过我认为它很值得采用，”ule 说。“放射性信号的量及其特异性，能够帮助我们提高 cdna 文库的质量，最终得到准确实用的数据。” a. 单层细胞或者贴壁细胞处理b. 悬浮细胞处理：先收集细胞再计数，然后清洗裂解c. 组织样品处理1.冷 pbs 清洗新鲜切下的组织三次二. 磁珠的准备1、enpendoff 管2、磁力架3、冰盒， rip wash buffer 置

6、于冰上4、抗体，置于冰上5、涡旋震荡器 6、枪、枪头放于超净台照射 30min，枪喷 depc 水b. 磁珠准备过程2. 标记实验所需的 enpendoff 管，样品包括目的样品，阴性对照与阳性对照3. 吸取 50l 重悬后的磁珠悬液于每个 enpendoff 管4. 每管加入 500l rip wash buffer，涡旋震荡5. 将 enpendoff 管置于磁力架上，并左右转动 15使磁珠吸附成一条直线，去上清，重复一次6. 用 100l 的 rip wash buffer 重悬磁珠，加入约 5ug 相应抗体于每个样品中7. 室温孵育 30min9. 加入 500l rip wash b

7、uffer，涡旋震荡后弃上清，重复一次10. 加入 500l rip wash buffer，涡旋震荡后置于冰上三. rna 结合蛋白免疫沉淀1、冰盒3、rip wash buffer 、0.5m edta 、rnase inhibitor 置于冰上 1. 准备 rip immunoprecipitation buffer2. 将前上步的 enpendoff 管放磁力架上，去上清，每管加入 900ul rip immunoprecipitation3. 迅速解冻第一步制备的细胞裂解液，14,000rpm，4离心 10min。吸取 100l 上清液于上一5. 短暂离心，将 enpendoff 管

8、放在磁力架上，弃上清6. 加入 500l rip wash buffer，涡旋震荡后将 enpendoff 管放在磁力架上，弃上清，重复清洗6 次1. 枪、枪头、enpendoff 管紫外照射 30min，喷 depc 水以除 rna 酶2. salt solution、salt solution、rip wash buffer、proteinase k、10%sds、 precipitateenhancer 置于冰上3.rnase-free 的乙醇、氯仿、异戊醇4.depc 水置于冰上5. 离心机预冷4. 孵育完之后，将 enpendoff 管置于磁力架上，将上清液吸入一新的 enpendo

9、ff 管中5. 于每管上清液中加入 250lrip wash buffer6. 于每管加入 400l 苯酚：氯仿：异戊醇，涡旋震荡 15s，室温下 14,000rpm 离心 10min7. 小心的吸取 350l 上层水相，吸入另一新的 enpendoff 管8. 于每管加入 400l 氯仿，涡旋震荡 15s，室温下 14,000rpm 离心 10min9. 小心的吸取 300l 上层水相，吸入另一新的 enpendoff 管10. 每管加入 50l salt solution，15l salt solution,5l precipitate enhancer ，850l 无水乙醇（无 rnas

10、e），混合，-80保持 1h 至过夜12. 用 80%乙醇冲洗一次，14,000rpm，4离心 15min，小心去上清，空气中晾干.13. 10-20l depc 水溶解，-80保存，送测序1：rip 试验需要注意什么? (4)抑制内源 rnase 的活性。(5)选择适合做 rip 的抗体。(6)避免 rna 结合蛋白的降解。(1)先进行 ip 或者 wb，测试抗体可以与目标 rbp 结合。(2)另选一个能与抗原其他表位结合的抗体。(3)尽可能选用密理博 ripab+抗体。(6)确定抗体类型与 protein a/protein g 匹配。3：提取 rna 时，蛋白酶 k 消化不完全是什么原因

11、?当进行蛋白酶 k 消化时，确保水浴温度应设置在 55左右，长期在 65以上孵育会导致蛋白酶k 失活。4：提取 rna 后，a260/a280 比值偏离 1.82.2 区域是什么原因?(1)需要缩短酚氯仿提取 rna 的时间间隔。(2)测试提纯后 rna 中是否存在 rna 酶，可能 rna 发生了降解。5：做 rip 的时候和 beads 孵育的 lysate 的浓度如何确定?有些动物的文献提到用细胞板数细胞个数，想知道如果用蛋白浓度的话，大概在什么数量范围的蛋白总量对应 50 ul beads?50 ul beads 对应的是一个 reaction，而我们推荐一个 reaction 是 1

12、00ul 裂解上清(2107 cells 加入 100ul rip lysis buffer 得到)，所以只需要在裂解前计数一下，并按括号中的比例加入裂解buffer，后续 100 ul 裂解上清就是一个 reaction 的蛋白用量。不建议通过裂解后测蛋白浓度的方法进行配比。6：rip 可以分提核浆的 rna-蛋白质复合物吗?理论上，可以采用能分别抽提核浆蛋白的蛋白抽提 kit 先分离样本，再进行 rip 实验。但需要特别注意的是所用 kit 中的 reagent 不能有 rnase 和 dnase，以及要能与下游的抗体 beads 孵育兼容。7：因为 rip 做完得到的是 rna 序列，要做后续检测，比如测序、判断目标序列位置等，是不是都必须要做 rt-pcr，得到逆转录的 dna 后，后面就跟 chip 相同了? 常见的用 real time qrt-pcr。如果对照的目的是保证两个样品间加入的细胞量一致或者进行定量，理论上说，使用 input 作为判别，计算不同样品上样量的差异。如果对照的目的是为了看 igg以及目的抗体富集的非特异性 mrna 的量的话，那么可以找一个确定不会与