中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则及其在《中国药典》(20重点

1、中药制剂分析课程论文中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则及 其在中国药典（2015年版中的应用药学（药物分析方向2012级指导教师:高晓霞2015年11月摘要:中药材存在多基原物种及同名异物、同物异名等问题 ，鉴于传统基原鉴 定、性 状鉴定、显微鉴定和理化鉴定方法存在局限性，为保证中药材临床应用安 全、准确、有效，有必要增加中药材DNA条形码分子鉴定法。 如今分子生物学技 术在中药材鉴定领域的应用已 逐步深入。中国药典2010年版收载了乌梢蛇饮 片、蕲蛇饮片、川贝母药材的 DNA分子鉴 定方法，而中国药典2015年版收载 了中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则”，DNA条形码分子鉴定法是利用公

2、认 的相对较短的DNA序列来进行物种假定的一种分子生物学技术，是传统形态鉴别 方法的有效补充。这标志着中药材的分子鉴定由实验室科研层面进入国家标准的应用层面。关键词：中药材；DNA ;鉴定;指导原则一、中药材DNA条形码分子鉴定指导原则11.1定义及原理该鉴定方法主要适用于中药材（包括药材、药材粉末及部分药材饮片 及基原 物种的鉴 定。DNA条形码分子鉴定法是利用基因组中一段公认的、相对较短的 DNA序列来进行物种鉴定的一种分子生物学技术，是传统形态鉴别方法的有效补 充。由于DNA序列是由腺嘌呤（A、鸟嘌呤（G、胞嘧啶（C、胸腺嘧啶（T 4种碱 基以不同顺序排列组成，因此一定长度DNA序列能够

3、区分不同物种。中药材DNA条形码分子鉴定指导原则通过对大样本量中药材进行 DNA条形 码分子鉴定研 究,建立以ITS2为核心,psbA-trnH为辅的植物类药材DNA条形码鉴 定体系和以COI为主、ITS2为辅的动物类药材DNA条形码鉴定体系。1.2方法与步骤中药材DNA条形码分子鉴定法主要包括供试品处理、DNA提取、PCR扩增、测序、序列 拼接及结果判定，以下内容详细说明各流程中的主要原理及注意事 项。1.2.1供试品处理 除特殊标明外,药材使用75%乙醇擦洗表面后晾干,称取 10100 Mg 2+备用。1.2.2 DNA提取DNA的提取包括破碎细胞壁、释放 DNA , DNA的分离和纯化,

4、 DNA的浓缩、沉淀与洗涤等基本步骤，目前常用试剂盒法，包括植物基因组DNA 提取试剂盒和动物组织/细胞基因组DNA提取试剂盒。由于植物类中药材种类繁多，可根据所研究中药材的具体情况对提取方法加以 改进。植物细胞内含有大量次生代谢产物，如多糖、多酚等，这些物质在提取DNA 的过程中与DNA共沉淀,形成黏稠的胶状物难以溶解或产生褐变，严重影响DNA 提取的产量与质量，以及后续的PCR扩增实验。EDTA （乙二胺四乙酸螯合 Mg 2+2+或Mn 2+,抑制DNase （DNA酶活性；CTAB （十六烷基三甲基溴化铵 是一种阳离子表面活性剂，可溶 解细胞膜,与DNA形成复合 物溶于高盐溶液，降低溶液

5、盐浓度至一定程度，则从溶 液中沉淀,经离心即可将CTAB与DNA复合物同蛋白质、多糖类物质分开。三羟 甲基氨基甲烷（Tris-HCI （pH 8.0提供一个缓冲环境，防止DNA被破坏。&巯基乙醇 是抗氧化剂，在提取DNA过程中加入&巯基乙醇,可以抑制氧化反应，避免褐化。 PVP （聚乙烯吡咯烷酮是酚的络合物,能与多酚形成一种不溶的络合物质,有效去除 多酚，减少DNA提取过程中多酚的污染；同时它也能和多糖 结合，有效去除多糖。 因此将PVP和3巯基乙醇配合使用，能够有效地防止DNA提取过程中多酚及多糖 的污染。在提取根、根茎、茎木类、皮类的 DNA时，一定要注意多糖、多酚的去除；提 取叶、花、全

6、 草的DNA时要适当增加水浴时间，并可将水浴温度降低；对于果实、 种子类以及动物药材类 的DNA提取可以参考中国药典。1.2.3 PCR扩增植物类中药材及其基原物种扩增ITS2或psbA-trnH序列，动物 类中药材及其基原物种扩增COI序列，通用引物及扩增条件如下，具体如有改变见各 药材项下。ITS2序列扩增正向引物ITS2F :5 -ATGCGATACTTGGTGTGAAT- 3反 向弓I物 ITS3R : 5 -GACGCTTCTCCAGACTACAAT- 3。psbA-trnH 序列扩增正向 引物psbAF :5-GTTATGCATGAACGTAATGCTC- 3反向引物 trnHR

7、:5 - CGCGCATGGTGGATTCACAATCC- 3 COI 序列扩增正向弓I物 HCO2198:5- TAAACTTTCAGGGTGACCAAAAAATCA- 3反向引物 LCO1490: 5。 GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG- 3。PCR反应体系以25卩为参照，包括1沪CR缓冲液（不含Mg 2+Cl 2,2.0 mmolL-1Mg 2+Cl 2, 0.2 mmol L-1 dNTPs,0.1 mmol L-彳引物对,模板 DNA , 1.0 U Taq DNA聚合酶，加灭菌双 蒸水至25卩L设置未加模板DNA的PCR反应为阴性 对照。ITS2 序列扩增程序：9

8、4 C 5 min ; 94 C 30 s , 56 C 30 s , 72 C 45 s , 40个循环； 72 C 10 min。 psbA-trnH 序列扩增程序:94 C 5 min ; 94 C 1 min , 55 C 1 min , 72 C 1.5 min , 30 个循环；72 C 7 min。COI 序列扩增程序:94 C 1 min ; 94 C 1 min , 45 C 1.5 min, 72 C 1.5 min, 5 个循环;94 C 1 min, 50 C 1.5 min, 72 C 1 min, 35个循环;72 C 5 min。1.2.4 PCR产物检测采取琼脂

9、糖凝胶电泳方法检测 PCR产物。电泳后，PCR产 物应在相 应的DNA条形码序列长度位置出现一条目的条带，阴性对照应无条带。1.2.5测序有PCR扩增条带的样品送测序公司进行 DNA序列测定。使用DNA 测序仪对目的条带进行双向测序，PCR扩增引物作为测序引物，测序原理同Sanger测序 法。1.2.6中药材DNA条形码序列获得 主要包括序列拼接和序列质量与方向2个方面的内容。对双向测序峰图应用专业软件进行序列拼接，去除引物区，获得相应的 DNA序列。为确保DNA条形码序列的可靠性，需对测序质量进行评估，去除测序 结果两端的低质量序列。序列方向应与PCR扩增正向引物方向一致。1.2.7结果判定

10、将获得的序列在中药材 DNA条形码鉴定系统（http :/ 或 GenBank 数据库中应用 BLAST （basic local alignment search tool方法进行结果判定，结果中相似性最高的序列对应物种为查询序列最接 近的物种。如果植物类药材ITS2序列比对后最接近的物种为真菌，则需采用 psbA-trnH序列重复上述方法流程。中药材DNA条形码鉴定数据库系统及GenBank数据库BLAST鉴定系统操作流程见下。登录中药材DNA条形码鉴定数据库系统网站，在主页点击物种鉴定”根据 需鉴定物种的种类，选择对应的鉴定数据库，如点击植物类药材鉴定（ITS/ITS2。将 需要鉴定的物

11、种序列复制后粘贴到 植物类药材鉴定（ITS/ITS2 的序列输入栏，点击提交”按钮，进行BLAST鉴定。在BLAST比对结果中,在序列比对信息”栏查看 相关比对信息，在物种鉴定结果”栏显示与所查询序列最接近的物种。登录 Ge nBa nk 数据库 BLAST 鉴定系统（http :/blast, ncbi. nlm. /Blast.cgi , 在 Basic BLAST 中选择 nucleotide blast在 Enter Query Sequence粘贴需要鉴定的 序列（Query （建议用 fasta 格式。在 Choose Search Se中选 others （nr e

12、tc.数据库，点 击左下角BLAST。在BLAST结果中查看序列相似性最高（max ide nt的物种，一般 为与查询序列最接近的物种。1.3方法学验证1.3.1方法适用性考察 采用DNA条形码分子鉴定法对20批次以上药材或基原 物种进行测定,积累数据，确定种内序列变异大小，保证该测定方法的适用性。1.3.2精密度考察 主要分为重复性考察、中间精密度考察及重现性考察。重复性,至少用3批供试品，每批3次或同批供试品进行6次测定试验后对结果 进行评价。实验结果判定应基本一致。中间精密度，考察实验室内部条件改变（如不同人员、不同仪器、不同工作日 和实验时间对测定结果的影响，至少应对同实验室不同操作人

13、员的结果进行考察。重现性，实验结果在3家以上实验室能够重现，相同样品在不同实验室获得DNA 条形码序列应相同。1.3.3影响因素考察 考察DNA条形码分子鉴定法的影响因素,包括DNA提取 （样品量、水浴温度和水浴时间、PCR条件（变性时间、退火温度与时间及延伸 时间及产物纯化（考察不同纯化试剂盒，保证实验方法的准确性。1.3.4基原物种对比验证 以分类学家确认的基原物种叶片为对象，采用该方法获 得DNA条形码数据，与相应药材产生的DNA条形码数据进行对比，避免内生真菌等 污染，保证结果准确性。1.4中药材DNA条形码分子鉴定核心序列选择依据1.4.1植物类中药材ITS2和psbA-trnH条形

14、码的选择依据DNA条形码研究的首要任务是确定通用DNA条形码序列。在植物界，研究者主要从叶绿体基因组和 核基因组中寻找理想 的DNA条形码，曾提出诸多候选条形码序列或组合。2009年,国际条形码协会植物工作组 对来自550个物种907个样品的7个序列（rbcL , matK , rpoCI, ropB , psbA-trnH , psbK-psbI , atpF-atpH 进行了分析比较，建议将 rbcL+matK 组合作为植物通用条形码10。然而,植物工作组认为该组合还远不够完美，寻找植 物DNA条形码的工作还没有结束2。同年,在墨西哥召开的第三届国际条形码大 会上与会代表一致认为应对ITS

15、/ITS2和psbA-trnH序列进行进一步评估。2010年,陈士林等3分析比较了 7个候选DNA条形码（psbA-trnH , matK, rbcL, rpoC1, ycf5, ITS2, ITS。研究对象为药用植物及其密切相关物种。研究结果表明ITS2表现突出,在物种水平的鉴定效率高达 92.7%。因此，陈士林等建议将ITS2作 为药用植物标准DNA条形码。鉴于研究中psbA-trnH仅次于ITS2序列，也具有较 好鉴定能力，因而推荐其作为ITS2的辅助条形码。Yao等4基于大样本量分析证 实ITS2序列可以作为植物物种鉴别的通 用条形码，并以ITS2序列为基础初步建立 了药用植物 DNA

16、条形码数据库网络查询系统 （http : /。2011年,中国植物条形码工作组（Chinese Plant BOL Group对来自42目75科141属 1 757物种的6 286样本的rbcL , matK , psbA-trnH , ITS序列进行研究,其结果进一 步验证了 ITS2的鉴定能力,建议ITS/ITS2应成为种子植物的核 心条形码,当ITS难 以扩增和测序时，ITS2可以有效地弥补该缺陷。陈士林等提出建立以ITS2 为核心、psbA-trnH为补充序列的植物类药材 DNA条形码鉴定体系。1.4.2动物类中药材COI和ITS2

17、条形码的选择依据 在动物界,Herbert等于 2003年首次提出将一段长度约为650 bp的COI基因序列作为动物条形码鉴定的基 础片段7。同年,Herbert等8对11门13 320个物种的线粒体细胞色素c氧化酶 亚基I （cytochrome c oxidase sub unit I , COI基因序列进行比较分析，结果表明所研究 物种的种间遗传距离在0.0%53.7%，物种种间遗传距离平均可达到 11.3%, 79%的物种种间遗传距离均大 于8%。以上研究结果进一步支撑了前期的结论。随后，COI基因特定片段的鉴定能力在鸟类、鱼类、节肢动 物、哺乳动物等具体动物类群的鉴定研究中均获得了

18、印证，因此研究者一致建议将COI序列作为动物的通用条形码。基于大量前期研究结果，中药材DNA条形码分子鉴定法选用ITS2和psbA-trnH作为植物类药材 的核心条形码，COI和ITS2作为动物类中药材的核心条形码。1.5中药材DNA提取方法的确定1.5.1植物基因组DNA提取方法的确定依据 植物基因组DNA提取 方法较多，常用基于CTAB原理的试剂盒法和改良的 CTAB法。应用不同公司植 物基因组DNA提取试剂盒等提取 中药材基因组DNA，结果表明试剂盒法适用于 中药材基因组DNA的提取。由于中药材所含成 分复杂，可针对不同入药部位改进 DNA提取试剂盒方法10 9。针对根及根茎、花、果实、

19、种子和皮类等药材质 地，确定各自合适的样品量。通过对 2 373份药材样品的DNA提取实验，叶类、 花类药材取样量约1020 Mg，根类、果实类、种子类、皮类药材约2040 Mg。某些药材需要增加样品量，如沉香药材DNA提取时取样量为80 Mg。因此，通过对大量样品DNA提取的研究，确定中药材 DNA条形码鉴定法取样量 为 10100 Mg。通过对不同入药部位实验不同水浴时间梯度（20，30，40，50，60 min，3 h及水浴过夜），发现叶类药材水浴时间一般在 2040 min，根类药材在 60 min3 h, 些质地坚硬 的药材可56 C水浴过夜。1.5.2动物类药材DNA提取 方法的确

20、定依据 动物基因组DNA的提取采用血液/细胞、组 织基因组DNA提取 试剂盒。采用天根生化科技（北京）有限公司的血液 /细胞、组织基因组DNA提取 试剂盒（基于SDS法原理）提取动物药材的 DNA，结果表明试剂盒法适用于动物 基因组DNA的提取，根据动物药材药用部位的不同（肌肉、角甲、壳类），选用不用的DNA提取试剂盒。动物类药材DNA提取前，应针对不同取样部位对 样品进行不同的前期处理。 肌肉类动物 药材需进行紫外杀菌处理并充分捣碎；骨 甲类药材由于DNA含量稍少，应适量增加取样量，并充分研磨粉碎； 含有脂类较多的动物内脏器官可先用不含蛋白酶 K和SDS的缓冲液浸泡药 材，并试剂盒消 化缓冲

21、液中适量增加SDS，以利于脱去脂类；分泌物类动物药材（如胆汁），在消化前同样需进行必要的处理。如干蛇胆用双蒸水浸泡6 h,其间更换水数次，使其软化 并洗去表面污染物；乙醇浸泡蛇胆，用流水浸泡1 d,以除去乙醇及表面污染物11 2+ 2+ 2+ 2+。目前多选用试剂盒法提取DNA，方法相对简洁、易控，而且在大多数动物药材中都 获得了较为理想 的结果。1.6确定可靠的DNA条形码鉴定数据库DNA条形码数 据库的可靠性是中药材DNA条形码鉴定的关键。目前已有的公共数据库，如Gen Ba nk, EMBL等，由世界各地的研究者进行独立提交，缺乏相互之间的验证， 数据质量参差不齐，中药材DNA序列数据的

22、系统性和代表性尚显不足。为保证 中药材DNA条形码数据库的可靠性，首先需要在基原上保证物种鉴定的可靠性， 然后采用严格的序列校对机制确保获得序列和基原样品的一致性，最后规范管理数据库，确保数据库的安全维护和有序增减。二中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则在中国药典 （2015年版）中的应用2.1蕲蛇饮片的鉴别（聚合酶 链式反应法）2.1.1模板DNA提取取本品0.5g,置乳钵中，加液氮适量，充分 研磨使成粉末，取O. lg，置1.5ml离心管中，加人消化液275m1细胞核裂解液 200卩l,0.5mol/L乙二胺四醋酸二钠 溶液50ml，蛋白酶K（20mg/ml20卩，1 RNA酶溶 液5卩l

23、在55水浴保温1小时，加人裂解缓冲液250卩1混匀，加到D N A 纯化柱中，离心（转速为每分钟 10000转）3分钟；弃去过滤液，加入洗脱液 8OO l5mol/l 醋酸钾溶液 26 卩 I, 1mol/LTris-盐酸溶液（pH7.518ml,0.5mol/L 乙二 胺四醋酸二钠溶液（pH8.030,无水乙醇480卩1灭菌双蒸水273卩I,离心（转速 为每分钟10000转）1分钟；弃去过滤液，用上述洗脱液反复洗脱3次，每次离 心（转速为每分钟10000转）1分钟;弃去过滤液，再离心2分钟，将DN A纯化柱 转移人另一离心管中，加入无菌双蒸水 100卩l室温放置2分钟后，离心（转速 为每分钟

24、10 000转）2分钟，取上清液，作为供试品溶液，置零下 20保存备 用。另取蕲蛇对照药材0.5g,同法制成对照药材模板 DNA溶液.2.1.2 PCR反应鉴 别弓I物：5 GGCAATTCACTACACAGCCAA- CACAACT,和 5 CCATA GTCAGGTGGTTAGTGATAC 3 。PCR反应体系：在200卩离心管中进行，反应 总体积为25m1,反应体系包括10*PCR缓冲液2.5卩，1 dNTP（2. 5mmol/L2卩1鉴 别引物（10卩mol/L各 0. 5卩，1高保真TaqDNA聚合酶（5U/卩10.2卩模板0.5 士 无菌双蒸水18.8卩。将离心管 置PCR仪，PC

25、R反应参数：95预变性5分钟， 循环反应3 0次（95 30秒，6345秒）,延伸（72C5分钟。2.1.3电泳检测 照琼脂糖凝胶电泳法方法2（通则0541，胶浓度为1 %，胶中加入核酸凝胶染色剂 GelRed;供试品与对照药材PCR反应溶液的上样量分别为8卩1 DNA分子量标记上样量为2卩l（0. 5卩g/电泳结束后，取凝胶片在凝胶成像仪上或紫外透 射仪上检 视。供试品凝胶电泳图谱中，在与对照药材凝胶电泳图谱相应的位置 上，在300? 400bp应有单一 D N A条带。2.2川贝母药材的鉴别（聚合酶链式反 应-限制性内切酶长度多态性方法）2.2.1模板D N A提取取本品0.lg,依次用7

26、5 %乙醉1ml、灭菌超纯水1ml淸洗，吸干表 面水分，置乳钵中研磨成极细粉。取 20mg,置1.5ml离心管中，用新型广谱植物基因组 D N A快速提取试剂盒提取 DNA 加人缓冲液API 400卩和RNA酶溶液（10mg/ml4卩涡漩振荡，65 C水浴加热 10分钟，加入缓冲液AP2 130卩，充分混匀，冰浴冷却5分钟，离心（转 速为每 分钟14000转）1 0分钟；吸取上淸液转移入另一离心管中，加人1.5倍体积的缓冲液A P 3 / E,混匀，加到吸附柱上，离心（转速为每分钟13000转）1分钟，弃去过滤液，加入漂洗液700卩1离心（转速为每分钟12000转）30秒，弃去过滤 液;再加入

27、溧洗液500卩，1离心（转速为每分钟12000转30秒，弃去过滤液；再离 心（转速为每分钟13000转）2分钟，取出吸附柱，放入另一离心管中，加入 50卩 1洗脱缓冲液，室温放置3? 5分钟，离心（转速为每分钟12000转）1分钟，将洗 脱液再加入吸附柱中，室温放置 2分钟，离心（转速为每分钟12000转）1分钟, 取洗脱液，作为供试品溶液，置 4C冰箱中备用。另 取川贝母对照药材O.lg，同 法制成对照药材模板 DNA溶液。2.2.2 PCR-RFLP反应鉴别引物：5CGTAACAAGGTTT- CCGTAGGTGAA 和 5 GCTA CGTTCTTCATCGAT 3PCR反应体系：在20

28、0卩离心管中进行，反应总体积为 30卩1反应体系包括10* P C R缓冲液3卩1二氧化镁（25mmol/L2.4卩l, dNTP（10mmol/L0.6鉴别引物（30卩mol/L各 0.5卩,I髙保真Taq DAN聚合酶（5U/y l0.2 模板1卩J无菌超纯 水21.8m1。将离心管置PCR仪，P C R反应参数：95C预变性4分钟，循环反 应 3 0 次（95C 3 0 秒, 5 5? 58C3 0 秒, 72C 3 0 秒） ，72C延伸 5 分钟。取 PCR 反应液，置500卩离心管中，进行酶切反应，反应总体积为20卩J反应体系包括10*酶切缓 冲液2卩1,PC阪应液6卩J Smal

29、（10U/卩10.5,卩无菌超纯水11.5卩I,酶切反应在30 C水浴反应2小时。另取无菌超纯水，同法上述P C R - R F L P反应操作，作为空白对照。223电泳检测 照琼脂糖凝胶电泳法(通则0541，胶浓度 为1.5 %，胶中加入核酸凝胶染色剂GelRed;供试品与对照药材酶切反应溶液的上 样量分别为8卩1 ,DNA分子量标记上样量为l卩1(0.5卩g/电泳结束后，取凝胶 片在凝胶成像仪上或紫外透射仪上检视。供试品凝胶电泳图谱中，在与对照药材凝胶电泳图谱相应的位置上，在100? 250bp应有两 条DNA条带，空白对照无条带。参考文献1中国中药杂志2013年第02期.2 Thomas C. Plant bar code soon to become realityJ. Scienee 2009, 325: 526. 3 Chen S L， Yao H， Han J P， et al. Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medici nal pla nt speciesJ. PLoS ONE 2010, 5: e8613. 4 Yao H， So ng