科罗索酸对酒精性肝损伤的作用及机制研究

1、科罗索酸对酒精性肝损伤的作用及机制研究研究背景过度饮酒所引起的健康问题和社会问题在世界范围普遍存在 , 可引 起精神异常 , 胰腺损伤 ,心肌损伤等。肝脏作为乙醇的主要代谢器官 , 大量饮酒可 对肝脏造成损害 ,进而发展为酒精性肝病 (Alcoholic liver disease,ALD)ALD的发病进程包括酒精性脂肪肝，酒精性肝炎，肝纤维化,肝硬化及肝癌。酒精性肝病的致死率居高不下。直至目前为止,ALD的发病机制并不十分明朗，并且相关治疗方式和药物存 在一定的局限性。 酒精性脂肪肝是酒精性肝病发病的前期阶段 , 并且存在可逆性 ,其特点为肝细胞内脂质异常蓄积和脂质代谢异常 , 其中腺苷酸活

2、化蛋白激酶(AMP-activated protein kinesis,AMPK) 和其下游分子乙酰辅酶 A 羧化酶在酒精所致的肝细胞脂质(acetyl-CoAc arboxylase,ACC) 及固醇调节元件结合蛋白 -1c(sterol regulatory element-binding protein-1c,SERBR-1c)代谢异常中发挥重要调节作用。诸多研究发现AMP及其下游分子ACCR或)SERBR-1c异常表达可促进肝脏 中甘油三酯蓄积。酒精性脂肪肝进一步发展可导致酒精性肝炎 , 在这一过程中肝 细胞凋亡 (apoptosis) 作用关键。诸多学者发现有丝分裂原激活蛋白激酶家族

3、 (mitogen-activated proteinkin as,MA PK)信号通路和自噬参与调节乙醇所引起的肝细胞凋亡。MAP傢族包括 p38和JNK，是重要的信号传导分子,可通过改变p38和(或)JNK磷酸化将细胞外的信号传递至细胞内。许多研究发现自噬在维持肝细胞内稳态非常重要 , 其能消化降解细胞内病源 物质,损伤细胞器和失去正常功能的蛋白质 ,进而帮助肝细胞在各种应激状态下保持正常功能。同时肝细胞自噬可受 AMPKS路调节,AMPK通路的激活可上调自噬水平。科罗索酸是源自枇杷叶的提取物 ,属于三萜化合物类 ,具有调节脂质代谢 ,影响MAPKS路和AMPI信号的作用,已被用来研究治疗

4、糖尿病,高血脂,动脉粥样硬 化, 非酒精性脂肪肝等多种疾病。然而科罗索酸对于酒精性肝病发展的影响及机 制研究并不十分明确。故在本次实验中 , 我们旨在探究科罗索酸对于酒精性肝病发展进程中肝细胞 脂质代谢异常和肝细胞凋亡的影响 , 并研究其内在作用机制。 第一部分 :科罗索酸对乙醇刺激下BRL-3A和HepG2细胞脂质代谢的影响及机制研究研究目的通过乙 醇培养BRL-3A和 HepG2细胞体外模拟乙醇所致的肝细胞脂质代谢异常,研究科罗索酸干预对这一过程的影响及相应作用机制。研究方法 1.细胞培养根据实验需要 ,使用含有不同浓度乙醇 ,科罗索酸,compound C的培养基培养BRL-3A和 He

5、pG2细胞相应时间。2.甘油三酯含量测定收集空白对照组 , 不同浓度乙醇处理组和各个药物干预组的细胞 , 采用酶法( 甘油三酯检测试剂盒 ) 测定对照组和各个处理组中细胞内甘油三酯(Triglyceride,TG) 的表达情况 , 并进行记录分析。3. 实时荧光定量PCR(Real-time quantitativePCR检测提取正常对照组和不同实验组BRL-3A和HepG2细胞RNA使用PCF仪检测细胞中p -actin 和SREBP-1c基因表达情况。4.免疫蛋白印迹(Western blot)检测提取正常对照组,不同浓度乙醇处理组和各个药物干预组细胞蛋白 , 使用 Western blo

6、t 检测细胞 中磷酸化AMPK(p-AMPK),AMP磷酸化ACC(p-ACC)和ACC表达情况,使用ImageJ 软件分析实验结果。研究结果1.乙醇刺激对BRL-3A和HepG2细胞的脂质合成的影响采用酶法检 测各组细胞内甘油三酯含量。实验结果显示 : 与正常对照组相比 , 乙醇刺激组BRL-3A和 HepG2细胞内甘油三酯（TG）含量明显增加，呈浓度依赖性。2. 科罗索酸对乙醇刺激下BRL-3A和 HepG2细胞中脂质堆积的影响采用酶法检测各组细胞内甘油三酯含量。实验结果显示：与100mM乙醇刺激组相比，科罗索 酸组BRL-3A和HepG2细胞内甘油三脂（TG）含量明显降低,呈浓度依赖性。

7、3. 科罗索酸对乙醇刺激下 BRL-3A和HepG2细胞中AMPKAC通路的影响采用Wester n blot 技术检测各组细胞中 p-A MP K,A MPK,p-A MP K,AMPS白表达。实验结果显示：与正常对照组相比,乙醇刺激组BRL-3A和HepG2细胞p-AMPKAMP比 值和P-ACC/ACC比值均下降；与乙醇刺激组相比,科罗索酸组细胞中P-AMPKAMPK 比值和P-ACC/ACQ：匕值均上调；说明科罗索酸上调乙醇所抑制的 AMPK1路,并抑制乙醇所激活的ACCS路；而科罗索酸这些效能可被compound C（AMPKI路抑制剂）所削弱。4. 科罗索酸对乙醇刺激下BRL-3A

8、和HepG2细胞中SREBP-1（表达的影响采用RT-PCF检测各组细胞中SREBP-1cmRNA表达。实验结果显示,与正常对照组相比,乙醇刺激组BRL-3A和 HepG2细胞中SREBP-1c mRN的表达量上调,呈浓度依赖性；与乙醇刺激组相比,科罗索酸组BRL-3A和HepG2细胞中SREBP-1c mRN的表达下降 , 呈浓度依赖性。5. compound C影响科罗索酸对乙醇刺激下BRL-3A和 HepG2细胞中脂质代谢的调节作用采用酶法和RT- PCF检测各组细胞内甘油三酯含量和 SREB P-1c mRfe达。实验结果显示 , 在同样存在乙醇刺激的情况下 , 与科罗索酸组相比 ,c

9、ompoundC干预可增加细胞中甘油三酯含量，上调SREBP-1c mRN的表达。研究结论1.乙醇刺激可引起BRL-3A和HepG2细胞内甘油三酯蓄积。2.在BRL-3A和HepG2细胞中,科罗索酸通过激活 AMP通路,抑制ACC1路活性和SREB P-1C的表达来减轻乙醇刺激所引起的甘油三酯蓄积。第二部分：科罗索酸对乙醇刺激下BRL-3A和HepGZ田胞凋亡的影响及相关机制研究目的观察科罗索酸干预对乙醇刺激下BRL-3A和 HepG2细胞损伤凋亡的影响,并探究其相关作用机制。研究方法 1.细胞分组按照实验需要分为 ：正常对照组，乙醇处理组,乙醇+科罗索酸处理组,乙醇+科罗索酸+巴佛洛霉素A1

10、处理组, 乙醇+科罗索酸+3-MA处理组,乙醇+科罗索酸+compound(处理组,乙醇+ 科罗索酸+BAPTA-AMh理组,乙醇+ 科罗索酸+毒胡萝卜素(thapsigargin) 处理组。2. MTT检测将细胞种于96孔板中,根据实验要求加入乙醇或是药物干预 24小时后,使用MTT检测各组细胞的存活情况。3.细胞蛋白免疫印迹检测(western-blot)提取各处理组细胞蛋白,使用western-blot检测各组细胞中B-actin,bax,bcl-2,p38, 磷酸化 p38(p-p38),JNK, 磷酸化JNK(P-JNK),beclin-1,LC3 n /LC3 I ,p-AMPK和

11、 AMPK勺表达情况，并使用 Image J分析实验结果。4. ELISA检测收集各组细胞培养上清液,按照试剂盒说明书,检测TNF-a浓度并进行计算。 5. 细胞内活性氧 (reactive oxygen species,ROS) 和钙离子浓度 检测收集各组细胞后，分别使用ROS荧光探针,钙离子荧光探针和流式细胞检测 仪检测细胞中ROS Ca2+浓度,并使用Flow Jo分析实验数据。研究结果1.乙醇培养对BRL-3A和 HepG2细胞存活的影响采用MTT方法检测乙醇刺激对BRL-3A和HepG胞存活的影响。实验结果显示：与正常对照组相比, 乙醇刺激组BRL-3A和 HepG2细胞存活率明显降

12、低,呈浓度依赖性。2. 科罗索酸对乙醇培养下BRL-3A和HepG2细胞存活的影响采用MT法检测不同浓度科罗索酸对乙醇培养下 BRL-3A和HepG2细胞存活的影响。实验结果显示：与乙醇刺激组相比,科罗索酸组BRL-3A和 HepG2细胞的存活率明显升高,呈浓度依赖性。3. 科罗索酸对乙醇培养下BRL-3A和 HepG2细胞凋亡的影响采用 western-blot 检测各处理组细胞中凋亡相关蛋白 bax 和 bcl-2 的表达。实验结 果显示：与正常对照组相比,乙醇刺激组BRL-3A和 HepG2细胞中bax/bcl-2比值明显上调；与乙醇刺激组相比,科罗索酸组BRL-3A和HepG2细胞中b

13、ax/bcl-2的 比值明显下调 ,呈浓度依赖性 ;说明科罗索酸抑制了乙醇所引起的肝细胞凋亡。4. 科罗索酸对乙醇培养下BRL-3A细胞炎症的影响采用ELISA检测各处理组BRL-3A细胞上清液中TNF-a的表达情况。实验结果显示：与正常对照组相比，乙醇刺激组细胞上清液中TNF-a的含量明显增高；与乙醇刺激组相比，科罗索酸组 细胞上清液中TNF-a表达明显降低；说明科罗索酸抑制了乙醇所致的肝细胞炎 症。5. 科罗索酸对乙醇培养下BRL-3A和HepG胞中活性氧(ROS生成的影响采用流式细胞术检测各处理组BRL-3A和HepG2细胞中活性氧生成情况。实验结果 显示：与正常对照组相比,乙醇刺激组B

14、RL-3A和 HepG2细胞中活性氧含量明显增高；与乙醇刺激组相比 ,科罗索酸组细胞中活性氧含量明显降低 ,呈浓度依赖性。6. 科罗索酸对乙醇培养下 BRL-3A和 HepG2细胞中MAPKl路的影响采用 western blot 检测各处理组 BRL-3A和 HepG2细胞中磷酸化 p-38(p-p38),p-38.磷酸化JNK(p-JNK)和JNK的表达情况。实验结果显示：与正常对照组相比，乙醇 刺激组细胞中P-P38/p38比值和p-JNK/JNK比值均上调；与乙醇刺激组相比，科罗 索酸组细胞P-P38/p38比值和P-JNK/JNK比值明显下调,呈浓度依赖性；说明科罗 索酸抑制了乙醇所

15、激活的p38 MAPK和JNK MAPK通路。7. 科罗索酸对乙醇培养下BRL-3A和 HepG2细胞中自噬状态的影响采用 western-blot 技术检测各处理组BRL-3A和HepG2田胞中自噬相关分子beciin-1 和LC3n /LC3 I的蛋白表达情况。实验结果显示：与正常对照组相比,乙醇刺激组细胞中beclin-1表达和LC3U /LC3 I比值均明显降低；与乙醇刺激组相比，科罗索酸组细胞beclin-1表达和LC3n /LC3 I比值均明显上调,呈浓度依赖性；说明科罗索酸上调了乙醇所抑制的自噬水平。8.3-MA,科罗索酸对乙醇培养下BRL-3A和 HepG2细胞存活情况的影响采

16、用MTT检测各处理组细胞存活情况。实验结果显示：在同样的100m乙醇刺激下,3-MA干预明显降低了科罗索酸所升高的细胞存活率,说明科罗索酸在BRL-3A 和HepG2细胞中是通过激活自噬减轻乙醇刺激下的细胞凋亡。9.科罗索酸影响乙醇培养下 BRL-3A和 HepG2细胞中自噬状态的相关机制采用western-bolt 技术检测各处理组 BRL-3A和 HepG2细胞中p-AMPK AMP!和 beclin-1 表达情况 , 实验结果显示 ： 与正常对照组相比 , 乙醇刺激组细胞内p-AMPK/AMP比值下调,beclin-1 表达降低；与乙醇刺激组相比，科罗索酸组细胞P-AMPK/AMP比值增

17、高,beclin-1 表达增高；而科罗索酸这一调节作用可被compound C（AMP通路抑制剂）所逆转。10.钙离子在科罗索酸影响乙醇培养下BRL-3A和 HepG2细胞中自噬状态中的作用采用细胞流式术检测各处理组BRL-3A和HepG2细胞中胞浆钙离子浓度情况，实验结果显示：与正常对照组相比，乙醇刺 激组胞浆钙离子浓度明显增高 ；与乙醇刺激组相比 ,科罗索酸组胞浆钙离子浓度明显降低。采用western-bolt 技术检测各处理组BRL-3A和HepG2细胞中beciin-1 表 达情况,实验结果显示：与科罗索酸组相比，BAPTA-AM&和thapsigargin 组细胞 内beclin-1

18、表达无明显改变。Thapsigargin组的胞浆内钙离子浓度和 ROS含量均高于科罗索酸组。研究结论1.科罗索酸可抑制乙醇刺激所引起的 BRL-3A和 HepG2细胞凋亡,并且是通过下调乙醇所激活的 ROS/MAP通路和上调乙醇抑制的自噬水平而实现。2.在BRL-3A和HepG2细胞中,科罗索酸通过激活乙醇所抑制的 AMPI通路而上调自噬水平。第三部分 ： 科罗索酸对酒精灌胃大鼠肝脏损伤的影响及作用机制研究目的观 察科罗索酸干预对乙醇灌胃处理 Sprague Dawley（SD）大鼠肝脏损伤的影响,并探究其相关作用机制。研究方法1.SD大鼠分组情况将健康30只雄性SD大鼠随机 均分为分为正常对

19、照组 , 乙醇处理组和科罗索酸治疗组。正常对照组每日 2 次生理盐水灌胃 , 使用量与乙醇处理组的酒精量相同。乙 醇处理组大鼠使用 60%红星二锅头灌胃 , 在实验第 1,4,8,12 周称重, 按照 1-4 周4.5 克（乙醇）/ 千克（体重）/ 天,5-8 周 6.5 克（乙醇）/ 千克（体重）/ 天,9-12 周 9 克（乙醇）/ 千克（体重）/ 天, 每天两次进行灌胃 , 间隔 12 小时。科罗索酸干预组 , 在进行相同酒精灌胃处理同时 , 在实验 5-12 周加入科罗索 酸每天4ml 20%灌胃。2.SD大鼠肝脏组织病理染色采用伊红苏木素（HE）染色检测各组SD大鼠肝脏病理损伤情况；

20、采用油红染色检测各组大鼠肝脏脂质堆积情况。3. western blot检测SD大鼠肝脏中各目的蛋白的表达提取各组大鼠肝脏组n /LC I ,p-AMPK 和织蛋白,采用western blot 检测B-actin,bax,bcl-2,p38,p-p38,JNK,p-JNK,beclin-1,LC3AMPK的表达情况,并借助Image J软件分析实验结果。研究结果1.科罗索酸干预对乙醇刺激下SD大鼠肝脏病理情况的影响使用HE染色和油红染色显示各组大 鼠肝脏病理损伤。实验结果显示：与正常对照组SD大鼠相比，乙醇处理组大鼠肝脏呈现明显的 炎症反应,肝细胞肿胀和脂质堆积；与乙醇处理组相比，科罗索酸组SD大鼠肝脏 中炎症反应，肝细胞肿胀和脂质堆积明显减轻。2.科罗索酸对乙醇刺激下SD大鼠 肝脏细胞凋亡情况的影响使用 western-blot技术检测各组SD大鼠肝脏中bax和 bcl-2 蛋白表达情况。实验结果显示 ： 与正常对照组相比 , 乙醇处理组大鼠肝脏中 bax/b