第八章产物的分离和纯化

1、6/9/20211 6/9/20212 产物的分离和纯化是发酵工业的最产物的分离和纯化是发酵工业的最 后一道工序，相对于菌种选育和发后一道工序，相对于菌种选育和发 酵生产这些上游技术，把分离纯化酵生产这些上游技术，把分离纯化 技术称为技术称为下游加工工程下游加工工程 由于发酵代谢产物的多样性，因而由于发酵代谢产物的多样性，因而 产物的分离和纯化技术也是多种多产物的分离和纯化技术也是多种多 样的样的。 。 6/9/20213 一、下游加工一、下游加工过过程的特点程的特点 1、 、发发酵液的一般特性酵液的一般特性 1）、发酵液中发酵产物浓度较低，1-10%， 杂质杂质含量高含量高 。 6/9/20

2、214 2)、培养液是复培养液是复杂杂的多相分散体系的多相分散体系： 是多相体系，一般情况下，分散介质是水。 分散在其中的固体和胶体物质组成复杂，不仅 包含有相对大分子物质，如核酸、蛋白质、多 糖、类脂、磷脂和脂多糖，而且还包含有低分 子质量物质，即大量存在于代谢途径的中间产 物，如氨基酸、有机酸和碱，分散在其中的固 体和胶状物质其密度和液体相近，同时黏度很 大，分离难度很大。 6/9/20215 3)、发酵液的稳稳定性差定性差，易随时间变化，如 易受空气氧化、微生物污染、蛋白质水解等 作用。 4)、发酵液中的悬浮固形物主要是菌体和蛋 白质的胶状物，可可压缩压缩性大性大。 6/9/20216

3、2、微生物工程、微生物工程产产品的特点品的特点 （ （1） ）发发酵酵产产品的品的稳稳定性差，易随定性差，易随时间变时间变化，如易化，如易 受空气氧化、微生物受空气氧化、微生物污污染、蛋白染、蛋白质质水解等作用。水解等作用。 （ （2）欲提取物通常不）欲提取物通常不稳稳定，定，对热对热、酸、碱、酸、碱、酶酶、有、有 机溶机溶剂剂以及机械剪切力敏感，在不适宜的条件以及机械剪切力敏感，在不适宜的条件 下会引起失活或分解。下会引起失活或分解。 （ （3） ）对许对许多多发发酵酵产产品的品的质质量要求高。量要求高。许许多多发发酵酵产产 品是医品是医药药、生物制、生物制剂剂、食品，必、食品，必须须达到国

4、家达到国家药药典、典、 试剂标试剂标准或食品准或食品规规范的要求。范的要求。 6/9/20217 二、下游工作二、下游工作应应遵循的原遵循的原则则 1.时间时间要短要短 2.温度要低温度要低 3.pH要适中要适中 4.勤清洗、消毒-为以后生产排除隐患。 防止产物性质发生变化 6/9/20218 三、下游加工三、下游加工过过程的一般流程程的一般流程 发发酵液酵液预处预处理理细细胞分离胞分离细细胞破碎胞破碎细细胞胞 碎片分离初步碎片分离初步纯纯化高度化高度纯纯化成品加工。化成品加工。 胞外产物 6/9/20219 6/9/202110 1、 、发发酵液的酵液的预处预处理和理和过滤过滤是采用凝是采用

5、凝 聚和絮凝等技聚和絮凝等技术术来加速固、液两相来加速固、液两相 的分离，提高的分离，提高过滤过滤速度。速度。 6/9/202111 2. 初步初步纯纯化是除去与目化是除去与目标产标产物性物性质质 有很大差异的有很大差异的杂质杂质， ，这这一步可以使一步可以使产产 物物浓缩浓缩，并明，并明显显地提高地提高产产品品质质量。量。 常用的分离方法有沉淀、吸附、萃取、常用的分离方法有沉淀、吸附、萃取、 超超滤滤等。等。 6/9/202112 3、高度、高度纯纯化即精制常采用化即精制常采用对产对产品有高度品有高度选择选择 性的分离技性的分离技术术，以除去与，以除去与产产物化学物理性物化学物理性质质 相近

6、的相近的杂质杂质。 。 典型的典型的纯纯化方法有化方法有层层析、析、电电泳、离子交泳、离子交换换等。等。 4、成品加工是、成品加工是为为了了获获得得质质量合格的量合格的产产品，品，浓浓 缩缩、 、结结晶和干燥是重要的技晶和干燥是重要的技术术。 。 6/9/202113 第一第一节节 发发酵液的酵液的预处预处理和理和过滤过滤 第二第二节节 微生物微生物细细胞的破碎胞的破碎 和和细细胞碎片的分离胞碎片的分离 第三第三节节 产产品的品的纯纯化化 第四第四节节 产产品的加工品的加工 6/9/202114 6/9/202115 一、一、发发酵液酵液预处预处理的主要目的：理的主要目的： 1、改、改变发变发

7、酵液的物理性酵液的物理性质质，促，促进进从从 悬悬浮液中分离固形物的速度，浮液中分离固形物的速度，实现实现 工工业规业规模的模的过滤过滤 2、使、使产产物物转转入便于以后入便于以后处处理的相中理的相中 （一般（一般为为液相）液相） 3、去除、去除发发酵液中部分酵液中部分杂质杂质，以利于，以利于 后后续续各步操作各步操作 6/9/202116 1. 降低液体粘度 加水稀释法：能降低液体粘度，但会增加 悬浮液的体积，加大后继过程的处理任务。 而且，单从过滤操作看，稀释后过滤速率提 高的百分比必须大于加水比才能认为有效， 即若加水一倍，则稀释后液体的粘度必须下 降50以上才能有效提高过滤速率。 二、

8、二、发发酵液酵液预处预处理工理工艺艺 6/9/202117 升高温度：可有效降低液体粘度，提 高过滤速率。同时，在适当温度和受热时 间下可使蛋白质凝聚，形成较大颗粒的 凝聚物，进一步改善了发酵液的过滤特 性。 6/9/202118 2. 调整pH pH值直接影响发酵液中某些物质的 电离度和电荷性质，适当调节pH值可改善 其过滤特性。此法是发酵工业中发酵液预 处理较常用的方法之一。 6/9/202119 3. 凝聚与絮凝 采用凝聚和絮凝技术能有效改变细胞、细 胞碎片及溶解大分子物质的分散状态，使其聚 结成较大的颗粒，便于提高过滤速率。除此之外， 还能有效地除去杂蛋白质和固体杂质，提高滤 液质量。

9、因此，凝聚和絮凝是目前工业上最常用 的预处理方法之一。常用于菌体细小而且粘度 大的发酵液的预处理。 6/9/202120 凝聚作用就是向胶体悬浮液中加入某种电解质， 在电解质中异电离子作用下，胶粒的双电层电位降 低，使胶体体系不稳定，胶体粒子间因相互碰撞而 产生凝集（1mm左右）的现象。 Al3+Fe 3+ H+ Ca2+ Mg2+ K + Na + Li + 。 常用的凝聚电解质有硫酸铝(明矾)、氯化铝、三氯 化铁、硫酸亚铁、石灰、硫酸锌、碳酸镁等。 6/9/202121 絮凝是指在某些高分子絮凝剂 存在下，基于桥架作用，当一 个高分子聚合物的许多链节 分别吸附在不同的胶粒表面 上，产生桥架

10、联接时，形成粗 大的絮凝团（10mm）的过程。絮 凝是一种以物理的集合为主 的过程。 6/9/202122 4. 加入助滤剂 助滤剂是一种不可压缩的多孔微粒，它 能使滤饼疏松，吸附胶体，扩大过滤面积，滤 速增大。 常用的助滤剂有硅藻土、纤维素、石棉粉、 珍珠岩、白土、炭粒、淀粉等，其中最常用的 是硅藻土。 6/9/202123 5. 加入反应剂 利用反应剂和某些可溶性盐类发生反应 生成不溶性沉淀。 作用：生成的沉淀能防止菌丝体粘结，使 菌丝具有块状结构，沉淀本身可作为助滤剂， 并且能使胶状物和悬浮物凝固，消除发酵液 中某些杂质对过滤的影响，从而改善过滤性 能。 6/9/202124 工工业业上

11、常用的上常用的过滤过滤分离分离设备设备有板框有板框 压滤压滤机、膜机、膜过滤过滤机和离心沉降分离机机和离心沉降分离机 等。等。 这这些些过滤过滤装置各有其装置各有其优优缺点，根据不缺点，根据不 同同产产品的具体品的具体实际实际加以加以选择选择。 。 6/9/202125 6/9/202126 1.高价无机离子的去除（高价无机离子的去除（Ca 2+、 、Mg2+、 、 Fe2+等）等） 2.可溶性可溶性杂杂蛋白的去除蛋白的去除 6 其它方法其它方法 6/9/202127 (1)高价无机离子的去除 去除钙离子：通常使用草酸。但由于草酸溶解度较小，不适 合用量较大的场合，可用其可溶性盐，草酸价格昂贵

12、，注意 回收。 去除镁离子：加入三聚磷酸钠，与镁离子形成络合物。 用磷酸盐处理，也能大大降低钙离子和镁离子的浓度。例如： 环丝氨酸的提取。 去除铁离子，可加入黄血盐，使其形成普鲁士蓝沉淀而除去。 6/9/202128 （ （2） ） 杂杂蛋白蛋白质质的除去的除去 沉淀法沉淀法 蛋白质在酸性溶液中，能与一些阴离子， 如三氯乙酸盐、水杨酸盐、钨酸盐、苦味酸盐、 鞣酸盐、过氯酸盐等形成沉淀；在碱性溶液中， 能与一些阳离子如Ag+、 Cu2+ 、Zn 2+、Fe 3+ 和 Pb2+等形成沉淀。 6/9/202129 吸附法吸附法 加入某些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋白质而 除去。 例如：在枯草芽孢杆菌发酵液

13、中，加入氯化 钙和磷酸氢二钠，两者生成庞大的凝胶，把蛋白 质、菌体及其他不溶性粒子吸附并包裹在其中而 除去，从而可加快过滤速率。 6/9/202130 变性法 蛋白质由有规则的排列到无规则结构的变化过程成为变性。变 性的蛋白溶解性小。 使蛋白质变性的方法有：加热，大幅度调节pH，加酒精等有机 溶剂或表面活性剂等 。 变性法的局限性：加热法只适合于对热较稳定的目的产物；极 端pH也会导致某些目的产物失活，并且要消耗大量酸碱；而有机 溶剂法通常只适用于所处理的液体数量较少的场合。 6/9/202131 6/9/202132 一、微生物一、微生物细细胞的破碎胞的破碎 破碎破碎细细胞的方法很多，有机械

14、法和非胞的方法很多，有机械法和非 机械法。机械法。 （一）机械方法（一）机械方法 工工业业上上经经常使用的是机械法，因常使用的是机械法，因为为其其 处处理量大，破碎的速度理量大，破碎的速度较较快。快。 6/9/202133 方法方法技术技术原理原理效果效果成本成本举例举例 机械法机械法研磨法研磨法细胞被研磨物磨细胞被研磨物磨 碎碎 适中适中便宜便宜 超声波法超声波法用超声波的空穴用超声波的空穴 作用使细胞破碎作用使细胞破碎 适中适中昂贵昂贵细胞悬浮液细胞悬浮液 小规模处理小规模处理 匀浆法匀浆法须使细胞通过小须使细胞通过小 孔，使细胞受到孔，使细胞受到 剪切力而破碎剪切力而破碎 剧烈剧烈适中适

15、中细胞悬浮液细胞悬浮液 大规模处理大规模处理 珠磨破碎法珠磨破碎法细胞被玻璃珠或细胞被玻璃珠或 铁珠捣碎铁珠捣碎 剧烈剧烈便宜便宜细胞悬浮液细胞悬浮液 和植物细胞和植物细胞 的大规模处的大规模处 理理 细胞机械破碎法 6/9/202134 JJ-2组织捣碎匀浆机 6/9/202135 Ultrasonication 超声波 超声波破碎仪 6/9/202136 WSK卧式高效全能珠磨机 Crushing in ball mill 珠磨法 6/9/202137 ZM系列卧式密闭珠(砂)磨机 6/9/202138 （二）非机械法（二）非机械法 酶酶解法解法 渗透渗透压压冲冲击击法法 反复反复冻结冻结

16、-融化法融化法 干燥破碎法干燥破碎法 酸、碱或表面活性酸、碱或表面活性剂处剂处理理 6/9/202139 1、 、酶酶解法是利用解法是利用酶酶反反应应分解破坏分解破坏细细胞胞 壁成分的特殊化学壁成分的特殊化学键键，达到使，达到使细细胞破碎胞破碎 的目的。的目的。 酶酶解法的另一种方式是利用微生物的自解法的另一种方式是利用微生物的自 溶作用，即溶胞溶作用，即溶胞酶酶是微生物自身是微生物自身产产生的。生的。 6/9/202140 2、渗透、渗透压压冲冲击击法是将法是将细细胞先放入高渗透胞先放入高渗透 压压的介的介质质中，在达到平衡后，介中，在达到平衡后，介质质突然稀突然稀 释释，或将，或将细细胞胞

17、转转入水中或入水中或缓缓冲液中，水就冲液中，水就 会迅速会迅速进进入入细细胞内，至使胞内，至使细细胞膨胞膨胀胀，引起，引起 细细胞壁的破裂。胞壁的破裂。 6/9/202141 3、反复、反复冻结冻结-融化法是将融化法是将细细胞反复在低温下胞反复在低温下 突然冷突然冷冻冻后在室温下融化，最后引起后在室温下融化，最后引起细细胞破胞破 碎。碎。 4、干燥破碎法是通、干燥破碎法是通过过干燥使干燥使细细胞膜渗透性胞膜渗透性 改改变变。再用丙。再用丙酮酮、丁醇等、丁醇等处处理理时时，胞内物，胞内物质质就就 容易抽提出来。容易抽提出来。 5、酸、碱或表面活性、酸、碱或表面活性剂处剂处理可使蛋白理可使蛋白质质

18、水解，水解， 细细胞溶解或某些代胞溶解或某些代谢产谢产物从物从细细胞内渗漏出来。胞内渗漏出来。 6/9/202142 二、二、细细胞碎片的分离胞碎片的分离 细细胞碎片的分离可以使用离心的方法，胞碎片的分离可以使用离心的方法， 但要求离心的但要求离心的转转数高（数高（3万万转转分）分）。 。 6/9/202143 6/9/202144 一、一、吸附法 吸附法是利用吸附吸附法是利用吸附剂剂和和发发酵酵产产物物间间的的 分子吸引力，而将分子吸引力，而将发发酵酵产产物吸附在吸物吸附在吸 附附剂剂上的方法，主要上的方法，主要应应用于小分子物用于小分子物 质质的提取。的提取。 6/9/202145 凡能凡

19、能够够将其它物将其它物质质聚集到自己表面上聚集到自己表面上 的物的物质质都称都称为为吸附吸附剂剂 聚集于吸附聚集于吸附剂剂表面的物表面的物质质就称就称为为吸附吸附 物物 常用的吸附常用的吸附剂剂有硅胶、氧化有硅胶、氧化铝铝、活性炭、活性炭 和大网格聚合物等。和大网格聚合物等。 6/9/202146 二、二、离子交离子交换换法法 原理原理： ：利用某些能利用某些能够够离子化的极性物离子化的极性物质质或两或两 性性电电解解质产质产物能物能够电够电离成阳离子或阴离子，离成阳离子或阴离子， 这这些离子可以与阳离子或阴离子交些离子可以与阳离子或阴离子交换树换树脂脂 的离子的离子进进行交行交换换，从而把，

20、从而把发发酵液中的酵液中的产产物固物固 定到交定到交换树换树脂上去，然后再用另一种脂上去，然后再用另一种对树对树脂脂 有更大有更大亲亲和力的离子溶液把和力的离子溶液把产产物从物从树树脂上脂上 洗脱下来，达到分离、提取、洗脱下来，达到分离、提取、浓缩浓缩和和纯纯化的化的 目的。目的。 6/9/202147 离子交离子交换树换树脂的分子可分成两部分：脂的分子可分成两部分： 一部分是不能一部分是不能够够移移动动的多价高分子基的多价高分子基团团 构成构成树树脂的骨架，使脂的骨架，使树树脂具有良好的脂具有良好的稳稳定定 性。性。 另一部分是可移另一部分是可移动动的活性离子，使其具有的活性离子，使其具有

21、离子交离子交换换能力。能力。 6/9/202148 6/9/202149 三、沉淀法三、沉淀法 沉淀法是溶液中的溶沉淀法是溶液中的溶质质由液相由液相变变成固相成固相 析出的析出的过过程程 。 。 沉淀法的用沉淀法的用处处很多：很多： 一可通一可通过过沉淀达到沉淀达到浓缩浓缩的目的；的目的； 二可通二可通过过沉淀除去非必要的成分；沉淀除去非必要的成分； 三可将已三可将已纯纯化的化的产产物物转为转为固体便于保存。固体便于保存。 6/9/202150 沉淀法的沉淀法的类类型：型： 1.盐盐析法：析法： 其原理是当加入高其原理是当加入高浓浓度的度的盐类时盐类时，它，它们们 能破坏能破坏酶酶和蛋白和蛋白

22、质质表面的水膜并中和其表面的水膜并中和其 电电荷，而使沉淀析出。荷，而使沉淀析出。 常用的常用的盐类盐类是硫酸是硫酸铵铵。 。 6/9/202151 2.有机溶有机溶剂剂沉淀法：沉淀法： 有机溶有机溶剂剂能破坏蛋白能破坏蛋白质质的某种的某种键键如如氢键氢键， ， 使其空使其空间结间结构构发发生某种程度的生某种程度的变变形，使一形，使一 些原来包在内部的疏水些原来包在内部的疏水键键基基团团暴露于表暴露于表 面，与有机溶面，与有机溶剂剂疏水基疏水基团结团结合形成疏水合形成疏水层层， ， 而使蛋白而使蛋白质质沉淀。沉淀。 常用有机溶常用有机溶剂剂:乙醇、甲醇、丙乙醇、甲醇、丙酮酮等。等。 6/9/2

23、02152 3.等等电电点沉淀法：点沉淀法： 其机理是其机理是处处于等于等电电点点时发时发酵酵产产物的溶物的溶 解度最小，从而解度最小，从而产产生沉淀，生沉淀，这这种沉淀方种沉淀方 法沉淀能力不法沉淀能力不强强。 。 4.非离子多聚物沉淀法：非离子多聚物沉淀法： 5. 金属离子沉淀法：金属离子沉淀法： 6/9/202153 四、溶四、溶剂剂萃取法萃取法 其作用机理是利用一种溶其作用机理是利用一种溶剂剂将将产产物自物自 另一种溶另一种溶剂剂中提取出来，达到中提取出来，达到浓缩浓缩和和 提提纯纯的目的。的目的。 通常将被提取的溶液称为料液； 欲提取物称为溶质； 用以进行萃取的溶剂称为萃取剂； 当大

24、部分溶质转移到萃取剂中得到的 溶液称为萃取液。 6/9/202154 工工业业上萃取的操作包括三个步上萃取的操作包括三个步骤骤： ： 一是混合一是混合 将料液和萃取将料液和萃取剂剂充分混合形成乳充分混合形成乳浊浊液，液， 让让溶溶质质自料液自料液转转入萃取入萃取剂剂中，此中，此过过程通常程通常 在在搅搅拌罐中拌罐中进进行，也可以在很高速度的管行，也可以在很高速度的管 道内混合。道内混合。 6/9/202155 二是分离二是分离 用离心机用离心机进进行高速离心，将乳行高速离心，将乳浊浊液分液分 成两相（萃取相和萃余相）。成两相（萃取相和萃余相）。 三是溶三是溶剂剂的回收的回收 将萃取液利用液体蒸将萃取液利用液体蒸馏馏的方式分的方式分别别 得到得到产产物和溶物和溶剂剂。 。 6/9/202156 6/9/202157 1. 结结晶晶 结结晶晶是物是物质质从液从液态态或气或气态态形成晶体的形成晶体的过过程叫程叫 做做结结晶。晶。 晶体晶体是具有一定形状的固是具有一定形状的固态态物物质质， ，这这种固种固态态 物物质质由由许许