生物信息学在基因芯片中的应用

1、1 l生物信息学和基因芯片是生命科学研究 领域中的两种新方法和新技术，生物信 息学与基因芯片密切相关，生物信息学 促进了基因芯片的研究与应用，而基因 芯片则丰富了生物信息学的研究内容。 2 、基因芯片简介 3 （）基因芯片的基本原理及生物信息学的作用（）基因芯片的基本原理及生物信息学的作用 l基因芯片（genechip），又称DNA微阵列 （microarray），把大量已知DNA或寡核苷酸 探针密集排列形成的探针阵列，并将经过标记 的若干靶核酸序列（样品）通过与芯片特定位 置上的探针杂交，便可根 据碱基互补匹配的原理确 定样本的基因序列、基因 表达信息等。 4 基因芯片 荧光标记的样品 共聚

2、焦显微镜 获取荧光图象 杂交结果分析 探 针 设 计 杂交 5 基因芯片技术流程图基因芯片技术流程图 芯片制作芯片制作样品的制备样品的制备 显微光蚀刻显微光蚀刻 压电打印压电打印 分子打印分子打印 原位合成芯片原位合成芯片 探针设计与制备探针设计与制备支持物预处理支持物预处理 探针打印探针打印 探针固化探针固化 DNA微集阵列微集阵列 样品核酸的样品核酸的 提取与纯化提取与纯化 扩增与标记扩增与标记 标记样品标记样品 的纯化的纯化 杂交及杂交后清洗杂交及杂交后清洗 扫描与分析扫描与分析 6 l根据探针的类型和长度，基因芯片可分为 两类。 l其中一类是较长的DNA探针（100mer） 芯片 这类

3、芯片的探针往往是PCR的产物，通过点样 方法将探针固定在芯片上，主要用于RNA的 表达分析。 l另一类是短的寡核苷酸探针芯片 其探针长度为25 mer左右，一般通过在片（原 位）合成方法得到，这类芯片既可用于RNA 的表达监控，也可以用于核酸序列分析。 7 8 l载体材料要求： l载体表面必须具有可以进行化学反应的活性基 团，以便与生物分子进行偶联。 l使单位载体上结合的生物分子达到最佳容量。 l载体应当是惰性的和有足够的稳定性，包括机 械的、物理的和化学的稳定性。 l惰性惰性:是指载体的其他性能或特异性吸附都不应该 干扰生物分子的功能。 l稳定性稳定性:是指在进行分子杂交或结合时，可能遭受

4、一定的压力或酸、碱条件而不发生变化。 （2）基因芯片制备）基因芯片制备 9 l实性材料 硅芯片、玻片和瓷片等。 l膜性材料 聚丙烯膜、尼龙膜、硝酸纤维素膜等。 10 l支持物（载体）的预处理原因： l支持物表面上要有一种合适的功能基团以连接探针，并使 探针稳定地固定于支持物表面，以防止杂交后清洗时被洗 脱。经处理后其表面衍生出氨基、醛基、异硫氰酸基及环 氧基团。这些活性基团可与DNA分子中的磷酸基、氨基、 羟基等基团形成离子键或共价结合而使打印在上面的DNA 牢固地固定在支持物表面。 l支持物表面经处理后，可减少亲水性探针在其表面的扩散， 因而提高了点阵密度。 11 l一是玻片来源方便，经表面

5、处理后可结合多种分 子； l二是适合光学检测要求。 l此外玻片还具有其它材料所不能比拟的优点： 玻片是一种耐用的材料，可在高温及用高离子强度溶液 清洗； 玻片是非孔性材料，因此杂交体积可以减至最小，从而 加快了探针与靶基因片段之间杂交和退火的动力学过程； 玻片的荧光信号本底低，背景干扰小 12 l基因芯片的制备主要有两种基本方法基因芯片的制备主要有两种基本方法: l一是在片合成法一是在片合成法: 在片合成法是基于组合化学的合成原理,它通 过一组定位模板来决定基片表面上不同化学 单体的偶联位点和次序。在片合成法制备 DNA芯片的关键是高空间分辨率的模板定位 技术和固相合成化学技术的精巧结合。 1

6、3 l美国Affymetrix公司开发的寡聚核苷酸原位 光刻DNA合成技术： l 采用的技术原理是在合成碱基单体的5羟基末端 连上一个光敏保护基，利用光照射使羟基端脱保护， 然后逐个将5端保护的核苷酸单体连接上去，这个 过程反复进行直至合成完毕。此方法的优点是合成 循环中探针数目呈指数增长。 14 15 l另一种方法是点样法另一种方法是点样法: 基因芯片点样法首先按常规方法制备cDNA （或寡核苷酸）探针库，然后通过特殊的针头 和微喷头, 分别把不同的探针溶液，逐点分配在 玻璃、尼龙或者其它固相基底表面上不同位点, 并通过物理和化学的结合使探针被固定于芯片 的相应位点。 16 （）靶基因样品的

7、制备及芯片杂交（）靶基因样品的制备及芯片杂交 l样品的准备过程包括从组织、细胞中分离纯 化核酸样品，以及对待测样品中的靶基因进 行特异性扩增。在扩增过程中，将耦联了荧 光染料(Cy3、Cy5等)的核苷酸掺入到扩增产 物中，对靶基因进行标记。 17 l 经荧光样品杂交后的芯片，荧光信号 可经过荧光显微镜、激光共聚焦显微镜 或激光扫描仪等进行信号的收集。收集 后的信号，经过计算机处理，并与探针 阵列的位点进行比较，可得出杂交的检 测结果。 18 l微型化和自动化微型化和自动化 l现已出现的芯片面积最大不过525cm,最小仅有1cm；每个 阵列中阵点样品DNA的用量仅为0.5g/L左右；同时杂交和

8、洗片等过程都可实现自动化,工作效率大幅度提高。 l高度平行性高度平行性 l基因芯片技术是将待研究的基因制作成芯片,并在同一张芯 片上同时对实验组和对照组材料进行杂交分析,从而使实验 结果具有可比性。 l巨大的信息产出率巨大的信息产出率 l在一张芯片上不仅可以获得组织、细胞、血液等基因表达 信号的定性、定量分析，还可实现全局检测静态到动态、 时间与空间上的差异及遗传信息。 19 l高度敏感性和专一性高度敏感性和专一性 l能可靠并准确检测出10 pg/L的DNA样品。 l高度重复性高度重复性 l一张由尼龙膜制作的微阵列，可以重复杂交使用多达20次。 l强大的类比性强大的类比性 l使得以往需多次处理

9、的遗传分析在同一时间和条件下快速 完成。 l哺育新的实验方法哺育新的实验方法 l此技术易与其它常规生物技术相融合交叉。基因芯片这些 独一无二的特点也代表了后基因组时代技术的发展方向。 20 l在生命科学领域中，基因芯片为分子生物学、 生物医学等研究提供了强有力的手段。 l利用基因芯片技术，可研究生命体系中不同 部位、不同生长发育阶段的基因表达，比较 不同个体或物种之间的基因表达，比较正常 和疾病状态下基因及其表达的差异。 l基因芯片技术也有助于研究不同层次的多基 因协同作用的生命过程，发现新的基因功能， 研究生物体在进化、发育、遗传过程中的规 律。 21 提取什么信息提取什么信息 如何提取信息

10、如何提取信息 如何处理和利用信息如何处理和利用信息 确定芯片检测目标确定芯片检测目标 芯片设计芯片设计 数据管理与分析数据管理与分析 22 l生物信息学在基因芯片中的应用主要体 现在三个方面: 确定芯片检测目标 芯片设计 实验数据管理与分析 23 l在基因芯片信息学方面要解决以下几个 关键的问题: 第一是芯片设计问题 第二是可靠性分析问题 第三是数据挖掘问题 24 、基因芯片设计的一般性原则、基因芯片设计的一般性原则 l基因芯片设计主要包括两个方面: l(1)探针的设计 指如何选择芯片上的探针 l(2)探针在芯片上的布局 指如何将探针排布在芯片上。 25 l确定芯片所要检测的目标对象确定芯片所

11、要检测的目标对象 查询生物分子数据库查询生物分子数据库 取得相应的取得相应的DNA序列数据序列数据 序列对比分析序列对比分析 找出特征序列，作为芯片设计的参照序列。找出特征序列，作为芯片设计的参照序列。 26 l在进行探针设计和布局时必须考虑以下在进行探针设计和布局时必须考虑以下 几个方面：几个方面： (1)互补性 (2)敏感性和特异性 (3)容错性 (4)可靠性 (5)可控性 (6)可读性 27 l对于DNA序列变异分析，最基本的要求是 能够检测出发生变异的位置，进一步的要 求是能够发现发生了什么样的变化。 l从杂交的单碱基错配辨别能力来看，当错 配出现在探针中心时，辨别能力强，而当 错配出

12、现在探针两端时，辨别能力非常弱。 所以，在设计检测DNA序列变异的探针时， 检测变化点应该对应于探针的中心，以得 到最大的分辨率。 28 lcDNA芯片设计的关键在于数据库的建立 和数据库信息的利用以及各种文库的建 立。 lcDNA芯片制备方法一般采用点样法，多 用于基因表达的监控和分析。 l寡核苷酸芯片制备一般采用在片合成方 法。优化是寡核苷酸芯片设计的一个重 要环节，包括探针的优化和整个芯片设 计结果的优化。 29 4、基因芯片优化、基因芯片优化 l高密度寡核苷酸芯片设计的结果是形成芯片合 成方案和步骤，产生制作掩膜板的CAD文件。 高密度基因芯片制备的一个关键是掩膜板技术， 利用掩膜板进

13、行定位并控制探针的在片合成， 从而得到很高的探针密度。 l但是制作掩膜板的代价较高，为了尽可能地提 高基因芯片制备效率，需要对设计好的基因芯 片进行优化，以减少制备芯片所需要的掩膜板 个数，同时也减少芯片探针循环合成次数，这 对于基因芯片应用有着重要的意义。 30 31 32 33 、测定未知序列 l 早期基于芯片杂交的序列分析实验中， 芯片上的探针是长度为k（一般为8）的 所有寡核苷酸的组合。这是一种完备的 探针集合，根据互补关系，通过各个探 针的杂交结果确定DNA靶序列中存在的 所有k长度片段，形成靶序列的k长度片 段谱，然后根据这些片段重构靶序列。 34 35 l 在同一块芯片上设计多组

14、探针，每一组 探针分别检测一条目标序列，探针的长 度在20到30之间。一般要求同一组探针 之间相互独立，尽可能不重叠或少重叠， 以提高探针的敏感性和特异性。 36 有两种方法可以进行已知突变点的分析: l一种方法是对于目标序列上已知的突变点，以 该点为中心，从目标序列选取一个片段，作为 设计探针的参考序列。根据参考序列，分别设 计四个高度特异的探针，这四个探针除中心位 置外均相同并与参考序列互补 l 另一种方法是对于目标序列上已知的突变点， 分别设计四组探针，其中每一组探针分别检测 一种核苷酸替换。同一组中的各个探针长度相 同，相互之间交叠，并且每个探针均覆盖对应 的突变点。 37 38 l为

15、了进行SNPs研究，发现目标序列上可 能出现的变化，最直接的方法就是根据 已知的目标序列设计一系列寡核苷酸探 针，其中每一个探针用于检测目标序列 特定位置上的核苷酸是否发生变化，探 察位置位于探针的中心。这种方法又称 等长等覆盖移位法 39 l 第二种方法为单核苷酸分析法。针对目标序列每第二种方法为单核苷酸分析法。针对目标序列每 个位置上所有可能出现的变化设计相应的探针。个位置上所有可能出现的变化设计相应的探针。 40 、基因表达分析 l基因表达是根据基因的DNA模板进行 mRNA和蛋白质合成的过程，各种基因 的表达存在差异，一种组织中基因表达 水平的差异可达1万倍。功能基因研究的 一种重要的

16、方法就是采用高通量基因表 达检测技术，全面分析基因的表达水平， 了解基因的功能。 41 l基于芯片的表达监控实验产生大量的数 据，在这些数据背后隐藏着丰富的基因 相互作用、基因功能信息，需要通过细 致的数据分析揭示这些信息，得到有益 的结果 l这种根据基因芯片获得的新的表达图谱 有别于以前的物理图和功能图，它能够 更为直接地揭示基因组中各基因相互关 系。 42 3、寻找基因功能、寻找基因功能 l DeRisi等应用酵母cDNA基因芯片研究在有丝 分裂和孢子状态下基因转录和表达水平的差异。 lAffymetrix公司制备的酵母基因表达型芯片， 包括酵母基因组开放读码框中的260 000个 25m

17、er探针阵列。Wodicka 等采用这种基因芯 片对不同生活状态下酵母细胞的基因表达进行 了研究。 43 、荧光检测图像处理 l基因芯片与样本杂交以后，用图像扫描 仪器捕获芯片上的荧光图像。在计算机 中，一幅图像由二维象素点所组成，通 常用一个8-bit的整数存贮象素点的灰度 值，取值范围为0,255，其中0代表 “黑”，255代表“白”。 44 l一个理想的基因芯片图像具有以下几 个性质： （1）芯片单元的形状和尺寸相同； （2）每个单元的中心位于象素点上； （3）无灰尘等引起的噪声信号； （4）最小和均匀的图像背景强度。 45 网格定位结果 46 l如果芯片检测的目的是测定样本序列，则 需

18、要根据芯片上每个探针的杂交结果判断 样本中是否含有对应的互补序列片段，并 利用生物信息学中的片段组装算法连接各 个片段，形成更长的目标序列。 47 l如果芯片检测的目的是进行序列变异分 析，则要根据全匹配探针以及错配探针 在基因芯片对应位置上的荧光信号强度， 给出序列变化的位点，并指明发生什么 变化。 48 l如果芯片检测的目的是进行基因表达分 析，则需要给出芯片上各个基因的表达 图谱，定量描述基因的表达水平，进一 步的分析还包括根据基因表达模式进行 聚类，寻找基因之间的相关性，发现协 同工作的基因 49 可靠性分析可以从两个方面进行： l一是根据实验统计误差（如探针合成的 错误率、全匹配探针

19、与错配探针的误识 率等），计算出基因芯片最终实验结果 的可靠性。 l二是对基因芯片与样本序列杂交过程进 行分子动力学研究，建立芯片杂交过程 的计算机仿真实验模型，以便在制作芯 片之前分析所设计芯片的性能，预测芯 片实验结果的可靠性。 50 l基因芯片数据分析包括实验数据管理、 数据质量控制、数据处理等 l进一步将基因芯片实验数据与公共数据 库中的信息相关联，利用数据挖掘方法 进行分析处理，揭示各种数据之间的关 系，发现新的生物学知识。 51 、芯片信息管理 l目前已出现一些芯片信息管理数据库， 这些数据库主要收集、管理表达型基因 芯片的实验数据。与基因芯片相关的信 息包括芯片功能的描述、芯片的

20、描述、 实验对象的描述、实验结果和分析结果 的描述。 52 l以基因表达型芯片为例，数据库至少含 有下列信息： (1)数据来源 (2)杂交目标序列 (3)目标对象 (4)mRNA转录的数量 (5)统计的显著性 53 l基因组信息是相互关联的，合理地解释 实验检测数据依赖于将实验数据与其它 相关数据库的集成。 l对于基因表达数据，通过用户定义的或 缺省的标准进行数据链接，经分析可以 得到关于基因调控的概貌。 54 第七节、基因芯片的应用第七节、基因芯片的应用 l基因表达分析：基因表达分析： l人类基因组编码大约人类基因组编码大约30,000 个不同的基因，仅掌握基因个不同的基因，仅掌握基因 序列

21、信息资料，要理解其基序列信息资料，要理解其基 因功能是远远不够的。因功能是远远不够的。 l因此，具有监测大量因此，具有监测大量mRNA 的实验工具很重要。基因芯的实验工具很重要。基因芯 片技术可清楚地直接快速地片技术可清楚地直接快速地 检测出以检测出以1:300,000水平出现水平出现 的的mRNA，且易于同时监测，且易于同时监测 成千上万的基因。成千上万的基因。 55 l杂交测序：杂交测序： l芯片技术中杂交测序芯片技术中杂交测序(sequencing by hybridization， SBH)技术是一种新的高效快速测序方法。技术是一种新的高效快速测序方法。 l用含用含65,536个个8聚

22、寡核苷酸的微阵列，采用聚寡核苷酸的微阵列，采用SBH技技 术，可测定术，可测定200bp长长DNA序列。采用序列。采用67,108,864个个 13聚寡核苷酸的微阵列，可对数千个碱基长的聚寡核苷酸的微阵列，可对数千个碱基长的 DNA测序。测序。SBH技术的效率随着微阵列中寡核苷技术的效率随着微阵列中寡核苷 酸数量与长度的增加而提高，但微阵列中寡核苷酸数量与长度的增加而提高，但微阵列中寡核苷 酸数量与长度的增加则提高了微阵列的复杂性，酸数量与长度的增加则提高了微阵列的复杂性， 降低了杂交准确性。降低了杂交准确性。 56 l疾病的诊断与治疗：疾病的诊断与治疗： l基因芯片在感染性疾病、遗传性疾病和

23、肿瘤等疾病的临床基因芯片在感染性疾病、遗传性疾病和肿瘤等疾病的临床 诊断方面具有独特的优势。与传统检测方法相比：诊断方面具有独特的优势。与传统检测方法相比： l它可以在一张芯片同时对多个病人进行多种疾病的检测；它可以在一张芯片同时对多个病人进行多种疾病的检测； l无需机体免疫应答反应，能及早诊断，待测样品用量小；无需机体免疫应答反应，能及早诊断，待测样品用量小； l能检测病原微生物的耐药性，病原微生物的亚型；能检测病原微生物的耐药性，病原微生物的亚型； l极高的灵敏度和可靠性；检测成本低，自动化程度高，利极高的灵敏度和可靠性；检测成本低，自动化程度高，利 于大规模推广应用。于大规模推广应用。

24、l这些特点使得医务人员在短时间内，可以掌握大量的疾病这些特点使得医务人员在短时间内，可以掌握大量的疾病 诊断信息，这些信息有助于医生在短时间内找到正确的治诊断信息，这些信息有助于医生在短时间内找到正确的治 疗措施。疗措施。 57 l药物研究与开发：药物研究与开发：芯片技术具有高通量、大规模、芯片技术具有高通量、大规模、 平行性等特点可以进行新药的筛选，尤其对我国平行性等特点可以进行新药的筛选，尤其对我国 传统的中药有效成分进行筛选。目前，国外几乎传统的中药有效成分进行筛选。目前，国外几乎 所有的主要制药公司都不同程度地采用了基因芯所有的主要制药公司都不同程度地采用了基因芯 片技术来寻找药物靶标

25、，查检药物的毒性或副作片技术来寻找药物靶标，查检药物的毒性或副作 用，用芯片作大规模的筛选研究可以省略大量的用，用芯片作大规模的筛选研究可以省略大量的 动物试验，缩短药物筛选所用时间，在基因组药动物试验，缩短药物筛选所用时间，在基因组药 学（学（pharmacogenomics）领域带动新药的研究和）领域带动新药的研究和 开发。开发。 58 l基因功能研究：基因功能研究：在基因组学和后基因组学研究在基因组学和后基因组学研究 中，基因芯片也起到重要的作用。应用基因芯片中，基因芯片也起到重要的作用。应用基因芯片 可以开展可以开展DNA测序、基因表达检测、基因突变性、测序、基因表达检测、基因突变性、

26、 基因功能研究、寻找新基因、单核苷酸多态性基因功能研究、寻找新基因、单核苷酸多态性 （SNP）测定等研究。与传统的）测定等研究。与传统的Northern blot杂杂 交或点杂交方法相比，基因芯片技术具有大规模交或点杂交方法相比，基因芯片技术具有大规模 平行处理的能力。平行处理的能力。 59 l在营养与食品卫生领域的应用：在营养与食品卫生领域的应用：采用基因芯采用基因芯 片技术研究营养素与蛋白和基因表达的关系，将片技术研究营养素与蛋白和基因表达的关系，将 为揭示肥胖的发生机制及预防打下基础。还可用为揭示肥胖的发生机制及预防打下基础。还可用 于营养与肿瘤相关基因表达的研究，如癌基因、于营养与肿瘤

27、相关基因表达的研究，如癌基因、 抑癌基因的表达与突变，营养与心脑血管疾病关抑癌基因的表达与突变，营养与心脑血管疾病关 系的分子水平研究。食品营养成分的分析、食品系的分子水平研究。食品营养成分的分析、食品 中有毒、有害成分的分析和检测等。中有毒、有害成分的分析和检测等。 60 l在环境科学领域中的应用：在环境科学领域中的应用：在环境保护上，在环境保护上， 基因芯片也广泛的用途，一方面可以快速检测基因芯片也广泛的用途，一方面可以快速检测 污染微生物或有机化合物对环境、人体、动植污染微生物或有机化合物对环境、人体、动植 物的污染和危害，同时也能够通过大规模的筛物的污染和危害，同时也能够通过大规模的筛

28、 选寻找保护基因，制备防治危害的基因工程药选寻找保护基因，制备防治危害的基因工程药 品、或能够治理污染源的基因产品。品、或能够治理污染源的基因产品。 61 l农业和畜牧业：农业和畜牧业：利用基因芯片技术，对有重利用基因芯片技术，对有重 要经济价值的农作物和水果等的基因组进行大要经济价值的农作物和水果等的基因组进行大 规模高通量的研究，筛选农作物的基因突变，规模高通量的研究，筛选农作物的基因突变， 并寻找高产量、抗病虫、抗干旱、抗冷冻的相并寻找高产量、抗病虫、抗干旱、抗冷冻的相 关基因，以开发高技术含量、高附加值的新产关基因，以开发高技术含量、高附加值的新产 品。也可利用基因芯片技术筛选、开发高

29、效低品。也可利用基因芯片技术筛选、开发高效低 毒的生物农药。毒的生物农药。 62 l司法：司法： l基因芯片还可用于司法，现阶段可以通过基因芯片还可用于司法，现阶段可以通过DNA指指 纹对比来鉴定罪犯，未来可以建立全国甚至全世纹对比来鉴定罪犯，未来可以建立全国甚至全世 界的界的DNA指纹库，到那时以直接在犯罪现场对可指纹库，到那时以直接在犯罪现场对可 能是疑犯留下来的头发、唾液、血液等进行分析，能是疑犯留下来的头发、唾液、血液等进行分析， 并立刻与并立刻与DNA罪犯指纹库系统存储的罪犯指纹库系统存储的DNA“指纹指纹” 进行比较，以尽快、准确的破案。进行比较，以尽快、准确的破案。 63 64

30、基因芯片 荧光标记的样品 共聚焦显微镜 获取荧光图象 杂交结果分析 探 针 设 计 杂交 65 l另一种方法是点样法另一种方法是点样法: 基因芯片点样法首先按常规方法制备cDNA （或寡核苷酸）探针库，然后通过特殊的针头 和微喷头, 分别把不同的探针溶液，逐点分配在 玻璃、尼龙或者其它固相基底表面上不同位点, 并通过物理和化学的结合使探针被固定于芯片 的相应位点。 66 l微型化和自动化微型化和自动化 l现已出现的芯片面积最大不过525cm,最小仅有1cm；每个 阵列中阵点样品DNA的用量仅为0.5g/L左右；同时杂交和 洗片等过程都可实现自动化,工作效率大幅度提高。 l高度平行性高度平行性 l基因芯片技术是将待研究的基因制作成芯片,并在同一张芯 片上同时对实验组和对照组材料进行杂交分析,从而使实验 结果具有可比性。 l巨大的信息产出率巨大的信息产出率 l在一张芯片上不仅可以获得组织、细胞、血液等基因表达 信号的定性、定量分析，还可实现全局检测静态到动态、 时间与空间上的差异及遗传