生物化学DNA复制RNA转录DNA复制

1、第一节半保留复制 第二节参与DNA复制的酶与蛋白质 第三节复制过程 第四节DNA损伤及修复 一、概念一、概念 以以亲代亲代DNADNA双链双链 为模板以为模板以碱基互补碱基互补 方式合成子代方式合成子代DNADNA， 这样新形成的子代这样新形成的子代 DNADNA中，一条链来自中，一条链来自 亲代亲代DNADNA，而另一条而另一条 链则是新合成的，链则是新合成的， 这种复制方式叫这种复制方式叫半半 保留复制保留复制。 几个相关概念：几个相关概念： 1. 复制起始点复制起始点 (origin, ori) 原核生物只有一个复制起始点；原核生物只有一个复制起始点； 真核生物染色体真核生物染色体DNA

2、有多个复制起始有多个复制起始 点，同时形成多个复制单位，点，同时形成多个复制单位， 两个起始点两个起始点 之间的之间的DNA片段称为片段称为复制子复制子(replicon)。 2. 复制叉复制叉 (replication fork) 复制时双链打开，分开成两股，新链复制时双链打开，分开成两股，新链 沿沿 着张开的模板生成，复制中形成的这种着张开的模板生成，复制中形成的这种Y 字形的结构称为字形的结构称为复制叉复制叉。 3 5 5 3 5 3 5 3 复制方向 二、实验依据 三、DNA复制的起点和方向 环状环状 DNA复制时复制时 所形成的所形成的Q结构结构 起始点起始点 复制叉复制叉 的推进的

3、推进 复制叉复制叉 起始点起始点 起始点起始点 起始点起始点 复制叉复制叉 复制叉复制叉 未复制未复制DNA 单向复制单向复制 双向复制双向复制 复制中的大肠杆菌染色体放射自显影图复制中的大肠杆菌染色体放射自显影图 (Caims实验实验) A B C 环状环状DNA的复制的复制 A B C 四、复制特点 半不连续复制 半保留复制 DNA的半不连续复制半不连续复制 复制过程 复制叉的复制叉的 移动方向移动方向 解旋酶解旋酶 DNA聚合聚合 酶酶III 解链酶解链酶 RNA引物引物 引发体引发体 DNA聚聚 合酶合酶I SSB 3 3 5 前导链前导链 随后链随后链 3 5 复制的复制的起始起始

4、DNADNA链的链的延长延长 DNADNA链链终止终止 5 RNA引物引物 3 3 复制特点 第二节参与DNA复制的酶与蛋白质 复制相关蛋白的复制相关蛋白的基因基因：dna A、dna B、 dna C dna X 相应的表达产物相应的表达产物蛋白质蛋白质：Dna A、Dna B、 Dna C Dna X Dna A：辨认复制起始位点：辨认复制起始位点 Dna B：解螺旋酶：解螺旋酶 Dna C：辅助解螺旋酶使其在起始点上：辅助解螺旋酶使其在起始点上 结结 合并打开双链。合并打开双链。 一、DNA聚合酶 （一）催化的反应特点 以四种dNTP为原料 需要模板 需要引物 催化反应方向为5-3 产物

5、性质与模板链相同 （二）大肠杆菌三种DNA聚合酶比较 DNA 聚合酶聚合酶 分子量分子量 每个细胞的分子统计数每个细胞的分子统计数 5 -3 聚合酶作用聚合酶作用 3 -5 核酸核酸外切酶作用外切酶作用 5 -3 核酸核酸外切酶作用外切酶作用 转化率转化率 DNA 聚合酶聚合酶 109，000 400 + + + 1 120，000 100 + + - 0 .05 400，000 10-20 + + - 50 比较项目比较项目 DNA 聚合酶聚合酶 切除引物切除引物 修复修复 修复修复复制复制功能功能 1999年发现聚合酶年发现聚合酶 和和，它们涉及，它们涉及DNA的错误倾向的错误倾向 修复（

6、修复（errooune repair） DNA聚合酶 I （1 1）5 5 3 3 聚合酶聚合酶功能（但持续合成功能（但持续合成DNADNA的能力差）；的能力差）； （2 2）3 3 5 5外切酶外切酶活性（在正常聚合条件下，此活性活性（在正常聚合条件下，此活性 不能作用于生长链，只作用于生长中不配对的单链，不能作用于生长链，只作用于生长中不配对的单链，校对校对 功能。）；功能。）； （3 3）还具有）还具有5 5 3 3外切酶外切酶活性（双链有效）；活性（双链有效）； 5 5 3 3 聚合酶功能聚合酶功能 (dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi 聚合反应机理聚合反应机理

7、： 5 3 O P G O P A 模 板 链 C T A 3 5 引物 3 3 5 5 OH O P G O P A O OH T P 模 板 链 C T A 3 5 引物 3 3 3 5 5 5 P O OH T PP 3 5 DNADNA聚合酶的聚合酶的3 - 5 外切酶水解位点外切酶水解位点 3 5 3 - 5 核酸外切核酸外切 酶水解位点酶水解位点 DNADNA聚合酶聚合酶3 3 - 5- 5 外切酶外切酶活力活力 切除引物、切除引物、 切除突变的片段切除突变的片段 DNADNA聚合酶聚合酶5 5 - 3- 3 外切酶外切酶活力活力 5 - 3 核酸外切核酸外切 酶水解位点酶水解位点

8、 单链缺口单链缺口 5 切除错配的核苷酸切除错配的核苷酸 DNA-pol I: 曾被称为复制酶曾被称为复制酶(replicase) 含量最多含量最多 可被水解成可被水解成两个片段两个片段 小片段小片段(N端端)：具有：具有5 3 外切酶活性；外切酶活性； 大片段大片段(C端端)：具有聚合活性和：具有聚合活性和3 5 外切酶活性，也称为外切酶活性，也称为Klenow片段片段，是常，是常 用的工具酶。用的工具酶。 DNA-pol III: 由由10种亚基组成的不对称聚合体种亚基组成的不对称聚合体 催化效率最高催化效率最高 大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶 全酶的结构和功能全酶的结构和功能 延长因

9、子延长因子 DNADNA聚合酶聚合酶 两个两个 亚基夹住亚基夹住DNADNA DNADNA聚合酶聚合酶异二聚体异二聚体 核心酶核心酶 校对校对 引物的结引物的结 合和识别合和识别 促使核心促使核心 酶二聚化酶二聚化 亚亚 基基 相对分相对分 子量子量 亚基亚基 数目数目 基因基因亚基功能亚基功能 132000 27000 10000 71000 52000 35000 33000 15000 12000 37000 2 2 2 2 2 1 1 1 1 4 dnaE dnaQ holE dnaX dadX holA holB holC holD dnaN 聚合作用聚合作用 3 5外切酶的校对功能

10、外切酶的校对功能 组建核心酶组建核心酶 使核心酶二聚化使核心酶二聚化 依赖依赖DNADNA的的ATPATP酶，形成酶，形成复合物复合物 与与亚基结合，形成亚基结合，形成复合物复合物 形成形成复合物复合物 形成形成复合物复合物 形成形成复合物复合物 两个两个亚基形成滑动夹子，以提亚基形成滑动夹子，以提 高酶的持续合成能力高酶的持续合成能力 DNADNA聚合酶聚合酶全酶的亚基组成全酶的亚基组成 Arthur Kornberg Arthur Kornberg 1918 Stanford University Stanford University Stanford, CA, USAStanford,

11、 CA, USA The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1959 for their discovery of the mechanisms in the biological synthesis of ribonucleic acid and deoxyribonucleic acid 二、解旋酶（解超螺旋，也叫拓扑异构酶、 DnaB蛋白） 拓扑异构酶：拓扑异构酶： 催化催化DNADNA的拓扑连环数发生变化的酶，的拓扑连环数发生变化的酶， 在在DNADNA重组修复和其它转变方面起重要作重组修复和其它转变方面起重要作 用。用。 拓扑异构酶拓扑异构酶

12、：使使DNADNA一一条链发生断裂和再连条链发生断裂和再连 接。作用是松解负超螺旋，反应不需要能量。接。作用是松解负超螺旋，反应不需要能量。 主要集中在活性转录区，同主要集中在活性转录区，同转录转录有关。有关。 拓扑异构酶拓扑异构酶：使使DNADNA两两条链发生断裂和再连条链发生断裂和再连 接。当引入接。当引入负超螺负超螺旋时需要由旋时需要由ATPATP提供能量，提供能量， 同同复制复制有关。有关。 DNA的超螺旋结构（原核）的超螺旋结构（原核） 二级结构为闭环双螺旋；三级结构为超螺旋二级结构为闭环双螺旋；三级结构为超螺旋 连环数（连环数（linking number , L） DNA双螺旋中

13、，一条链以右手螺旋绕另一条链缠绕的次数 扭转数（扭转数（twisting number , T） DNA分子中的Watson-Crick螺旋数目，以T表示 超螺旋数（缠绕数超螺旋数（缠绕数 , writhing number , W） 连环数（L）缠绕数（T）扭曲数W 松驰环25250 解链环23230 超螺旋2325-2 L=T+W 三、解链酶（ DnaA蛋白） 四、SSB 五、引物酶 六、DNA连接酶 解螺旋解螺旋/链链酶酶 (helicase) （ DnaA蛋白） : 模板对复制的指导作用在于碱基的准确模板对复制的指导作用在于碱基的准确 配对，而碱基却埋在双螺旋的内部。只有把配对，而碱基

14、却埋在双螺旋的内部。只有把DNA解开解开 成单链，它才能起模板作用。成单链，它才能起模板作用。 解螺旋酶是最早发现的与复制有关的蛋解螺旋酶是最早发现的与复制有关的蛋 白质，当时称为白质，当时称为rep蛋白。作用是蛋白。作用是利用利用ATP供供 能，解开能，解开DNA双链。双链。 四、SSB SSB曾被称为螺旋反稳定蛋白（HDP）。 SSB与解开的DNA单链紧密结合，防止 重新形成双链，并免受核酸酶降解。在 复制中维持模板处于单链状态。 引物酶引物酶 (primase): 依赖依赖DNA的的RNA聚合酶。聚合酶。 催化催化RNA引物的合成。引物的合成。 在大肠杆菌，引物酶是在大肠杆菌，引物酶是d

15、na G基因的产物。基因的产物。 RNA引物引物： 在在DNA模板的复制起始部位由引物酶催模板的复制起始部位由引物酶催 化化NTP的聚合，形成短片段的的聚合，形成短片段的RNA，为，为DNA 聚合提供聚合提供3 -OH末端。末端。 连连 接接 酶酶 连连 接接 切切 口口 Mg2+ 连接酶连接酶 ATP或或NAD AMP+PPi或或NMN+AMP A TC G P TT PPP AACCT GA P AC PPPP OH TG G A TC G P TT PPP AACCT GA P AC PPP TG G P 缺口 3 35 5 5 53 3 模板链模板链 模板链模板链 大肠杆菌和其它细菌的

16、大肠杆菌和其它细菌的DNADNA连接酶连接酶要求要求NADNAD+ + 提供能量；在高等生物和噬菌体中，则提供能量；在高等生物和噬菌体中，则 要求要求ATPATP提供能量。提供能量。 DNADNA连接酶在连接酶在DNADNA复制、损伤修复、重组复制、损伤修复、重组等等 过程中起重要作用。过程中起重要作用。 第三节复制过程 一、复制起始一、复制起始 二、链的延长（冈崎片段的合成）二、链的延长（冈崎片段的合成） 三、三、复制的终止复制的终止 一、复制起始一、复制起始 1 1、拓扑异构酶解开超螺旋。、拓扑异构酶解开超螺旋。 2 2、Dna ADna A蛋白识别并在蛋白识别并在ATPATP存在存在 下

17、结合于四个下结合于四个9 9bpbp的重复序列。的重复序列。 3 3、在类组蛋白（、在类组蛋白（HUHU、ATPATP参与下参与下, , Dan ADan A蛋白变性蛋白变性1313个个bpbp的重复序的重复序 列列, ,形成形成开链复合物开链复合物。 4 4 、Dna BDna B借助于水解借助于水解ATPATP产生的产生的 能量在能量在Dna CDna C的帮助下沿的帮助下沿5 5 3 3 方向移动，解开方向移动，解开DNADNA双链，形成双链，形成 前引发复合物前引发复合物。 5 5、单链结合蛋白结合于单链。、单链结合蛋白结合于单链。 6 6、引物合成酶（、引物合成酶（Dna GDna

18、G蛋白）开蛋白）开 始合成始合成RNARNA引物。引物。 起始复合物起始复合物 前引前引 发复发复 合物合物 开链复合物开链复合物 引发体引发体 (primosome): 是由是由Dna B、Dna A、Dna C以及其他复制以及其他复制 因子一起形成复合体，再结合引物酶形成因子一起形成复合体，再结合引物酶形成 较大的聚合体，结合到模板较大的聚合体，结合到模板DNA上。上。 二、链的延二、链的延 长（冈崎片长（冈崎片 段的合成）段的合成） 真核生物的真核生物的 冈崎片段为：冈崎片段为： 100-200100-200bpbp 原核生物的原核生物的 冈崎片段为：冈崎片段为： 1000-200010

19、00-2000bpbp 冈崎片段引物的切除、缺口的填补和切口的连接冈崎片段引物的切除、缺口的填补和切口的连接: 引导链与随从链分别由哪些酶或蛋白参与？ 三、三、复制的终止复制的终止 oric 复制叉复制叉2 复制叉复制叉1 终止复制叉终止复制叉2终止复制叉终止复制叉1 复制叉复制叉1 复制叉复制叉2 完成复制完成复制 DNA拓扑异构酶拓扑异构酶 连锁染色体连锁染色体 DNA忠实性的保障 1 1、碱基的配对规律：、碱基的配对规律：摸板链与新生链之间的碱摸板链与新生链之间的碱 基配对保证碱基配错几率约为基配对保证碱基配错几率约为1/101/104 41/101/105 5。 2 2、DNADNA聚

20、合酶的聚合酶的3 355外切酶活性的校对功能，外切酶活性的校对功能， 使碱基的错配几率又降低使碱基的错配几率又降低10010010001000倍。倍。 3 3、复制中的即时校读功能。、复制中的即时校读功能。 真核细胞内有五种真核细胞内有五种DNADNA聚合酶聚合酶 DNADNA聚合聚合 酶酶 DNADNA聚合聚合 酶酶 DNADNA聚聚 合酶合酶 DNADNA聚合聚合 酶酶 DNADNA聚合聚合 酶酶 定位定位 亚基数目亚基数目 外切酶活性外切酶活性 引物合成引物合成 酶活性酶活性 持续合成能力持续合成能力 抑制剂抑制剂 功能功能 细胞核细胞核 4 4 中等中等 蚜肠霉素蚜肠霉素 引物合成引物

21、合成 细胞核细胞核 1 1 低低 双脱氧双脱氧 TTPTTP 修复修复 线粒体线粒体 2 2 3 3 55 外切酶外切酶 高高 双脱氧双脱氧 TTPTTP 线粒体线粒体 DNADNA合成合成 细胞核细胞核 2 2 3 5 外切酶外切酶 有有PCNAPCNA时时 高高 蚜肠霉素蚜肠霉素 核核DNADNA合成合成 细胞核细胞核 1 1 5 3 外外 切酶切酶 高高 蚜肠霉素蚜肠霉素 修复修复 真核和原核真核和原核DNA细胞复制比较细胞复制比较 真核细胞真核细胞DNA复制的特点复制的特点 多个起点复制多个起点复制 起起 点点 起起 点点 起起 点点 起起 点点 起起 点点 起起 点点 端粒酶（端粒酶

22、（telomerase） 初步研究表明，人体中生殖细胞的端初步研究表明，人体中生殖细胞的端 粒长度保持不变，而体细胞的端粒长度粒长度保持不变，而体细胞的端粒长度 则随个体的老化而逐步缩短。对此的一则随个体的老化而逐步缩短。对此的一 个推论是：人的生殖细胞具端粒酶的活个推论是：人的生殖细胞具端粒酶的活 力，体细胞则否。这一问题的解决无疑力，体细胞则否。这一问题的解决无疑 会有助于对生命衰老的认识会有助于对生命衰老的认识。 5 3 AAAACCCCAAAACCC C C C A 端粒酶端粒酶 特点：特点： 1. 由由RNA和蛋白质构成的复合物和蛋白质构成的复合物 2. 为特殊的逆转录酶，能以自身的

23、为特殊的逆转录酶，能以自身的RNA为为 模板逆转录合成端粒模板逆转录合成端粒DNA 功能：功能： 合成端粒合成端粒DNA，维持端粒的长度，维持端粒的长度 爬行模型：爬行模型： 端粒合成的一种模型端粒合成的一种模型 3 5 TTTTGGGGTTTTG 5 3 AAAACCCCAAAACCC C C C A AA 3 5 TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTG 5 3 AAAACCCCAAAACCC C C C A AA T T G G G T G G G T 3 5 AA TTTTG 5 3 AAAACCCCAAAACCC C C C A GTTTTG 整合和整合和 杂交杂交 移位和移位和

24、再杂交再杂交 端粒合成的完成端粒合成的完成 TTTTGGGG TTTTGGGG TTTTGGGGTTTT 5 3 n AA 3 TTTTGGGG TTTTGGGG TTTTGGGGT 5 3 T T CCCCT n AA3 TTTTGGGG TTTTGGGG TTTTGGGGT 5 3 T T AAAACCCC AAAACCCC AAAACCCCT n 进一步加工进一步加工 继续继续 延伸延伸 第四节DNA损伤及修复 四、四、诱导修复（诱导修复（SOS修复）修复） 一、一、光修复光修复 二二、切除修复切除修复 三、三、重组修复重组修复 DNA紫外线损伤的光裂合酶修复紫外线损伤的光裂合酶修复 1

25、、形成嘧啶二聚体、形成嘧啶二聚体 2、光复合酶结合于、光复合酶结合于 损伤部位损伤部位 3、酶被可见光激活、酶被可见光激活 4、修复后酶被释放、修复后酶被释放 切除修复切除修复 碱基丢失碱基丢失碱基缺陷或错配碱基缺陷或错配 结构缺陷结构缺陷 切开切开 核酸内切酶核酸内切酶 核酸外切酶核酸外切酶切除切除 DNA聚合酶聚合酶 DNA连接连接酶酶 核酸内切酶核酸内切酶 核酸外切酶核酸外切酶 切开切开 切除切除 修复修复 连接连接 糖苷酶糖苷酶 DNA的重组修复的重组修复 胸腺嘧啶胸腺嘧啶 二聚体二聚体 复制复制 核酸酶及核酸酶及 重组蛋白重组蛋白 修复复制修复复制 DNA聚合酶聚合酶 DNA连接酶连

26、接酶 重组重组 重组修复重组修复 SOS修复修复： 这是一种在这是一种在DNA分子受到较大范围损伤并分子受到较大范围损伤并 且使复制受到抑制时出现的修复机制，且使复制受到抑制时出现的修复机制， 以以SOS借喻细胞处于危急状态。借喻细胞处于危急状态。 DNA分子受到长片段高密度损伤，使分子受到长片段高密度损伤，使DNA 复制过程在损伤部位受到抑制。复制过程在损伤部位受到抑制。 损伤诱导一种特异性较低的新的损伤诱导一种特异性较低的新的DNA聚合聚合 酶，以及重组酶等的产生。酶，以及重组酶等的产生。 由这些特异性较低的酶继续催化损伤部位由这些特异性较低的酶继续催化损伤部位 DNA的复制，复制完成后，

27、保留许多错的复制，复制完成后，保留许多错 误的碱基，从而造成突变。误的碱基，从而造成突变。 DNA聚合酶 I （1 1）5 5 3 3 聚合酶聚合酶功能（但持续合成功能（但持续合成DNADNA的能力差）；的能力差）； （2 2）3 3 5 5外切酶外切酶活性（在正常聚合条件下，此活性活性（在正常聚合条件下，此活性 不能作用于生长链，只作用于生长中不配对的单链，不能作用于生长链，只作用于生长中不配对的单链，校对校对 功能。）；功能。）； （3 3）还具有）还具有5 5 3 3外切酶外切酶活性（双链有效）；活性（双链有效）； 聚合反应机理聚合反应机理： 5 3 O P G O P A 模 板 链 C T A 3 5 引物 3 3 5 5 OH O P G O P A O OH T P 模 板 链 C T A 3 5 引物 3 3 3 5 5 5 P O OH T PP 3