生物芯片的制造及其应用

1、1. 基本概念回顾基本概念回顾 2. 基因芯片的制备技术基因芯片的制备技术 3. 基因芯片的应用基因芯片的应用 我是不听她上 化学课的，你 们看着办吧！ 1. 基本概念回顾基本概念回顾 just for chemistry people 核酸包括DNA和RNA两大类。 DNA 核苷酸中的嘌呤碱(purine)主要是鸟嘌呤(guanine,G)和腺嘌 呤(adenine,A)，嘧啶碱(pyrimidine)主要是胞嘧啶 (cytosine,C)、尿嘧啶(uracil,U)和胸腺嘧啶(thymine,T)。 DNA和RNA都含有鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)和胞嘧啶(C)； 胸腺嘧啶(T)一般而言只存

2、在于DNA中，不存在于RNA中； 而尿嘧啶(U)只存在于RNA中，不存在于DNA中。 嘌呤和嘧啶环中含有共轭双键，对260nm左右波长的紫外光 有较强的吸收。碱基的这一特性常被用来对碱基、核苷、 核苷酸和核酸进行定性和定量分析。 guanine adenine cytosine uracil thymine purine pyrimidine (1)同一生物的不同组织的DNA碱基组成 相同； (2)一种生物DNA碱基组成不随生物体的 年龄、营养状态或者环境变化而改变； (3)几乎所有的DNA，无论种属来源如何， 其腺嘌呤摩尔含量与胸腺嘧啶摩尔含量相 同(A=T)，鸟嘌呤摩尔含量与胞嘧啶摩 尔含

3、量相同(G=C)，总的嘌呤摩尔含量 与总的嘧啶摩尔含量相同(AG=C T)； (4)不同生物来源的DNA碱基组成不同， 表现在(AT)/(GC)比值的不同。 DNA的二级结构的二级结构双螺旋结构双螺旋结构 (double helix model) DNA的半保留复制 (semiconservative replication) Oligonucleotide Hybridization Tm=69.30.41(%G+C) .变性、复性和杂交。粗细线分别代表不同DNA。A是杂化双链; .突变体的鉴别。B代表天然DNA；C是B的缺失突变体； 虚线框内是已缺失的部分；D是显示从天然DNA链鼓出小泡;

4、 .粗线代表探针，粗线上的X表示放射性标记。 核酸杂交及其应用示意图核酸杂交及其应用示意图 RNA的结构与功能 DNA是遗传信息的载体，遗传信息的作用通常由蛋白质的功能来实现，但DNA并 非蛋白质合成的直接模板，合成蛋白质的模板是RNA。正常细胞遗传信息的流向 是： 反转录作用(reverse transcription) 与DNA相比，RNA种类繁多，分子量相对较小，一般以单股链存在，但可以有局 部二级结构RNA碱基组成之间无一定的比例关系，且稀有碱基较多。此外，tRNA 还具有明确的三级结构。 RNA的分类的分类 注：原核细胞不含后3种RNA 细胞核和胞液线粒体功能 核蛋白体RNArRNA

5、mt tRNA核蛋白体组成成分 信使RNAmRNAmt mRNA蛋白质合成模板 转运RNAtRNAmt tRNA转运氨基酸 不均一核RNAhnRNA成熟mRNA的前体 小核RNAsnRNA参与hnRNA的剪接、转运 小胞浆RNAscRNA/7SL-RNA 蛋白质内质网定位合成的信 号识别体的组成成分 miRNA和和siRNA的基本介绍及区别的基本介绍及区别 siRNA是RNAi途径中的中间产物，是RNAi发挥效应所必需的因子。 SiRNA的形成主要由Dicer和Rde-1(RNAi缺陷基因-1)调控完成。只降 解与其序列互补配对的mRNA。 MicroRNA（miRNA,微RNA）即为长度为2

6、2nt左右的5端带磷酸 基团、3端带羟基的非蛋白编码的调控小RNA家族。miRNA广泛存在 于真核生物中，不具有开放阅读框架，不编码蛋白质，一般长20- 24nt，miRNA的转录产物是发夹状结构，在RNase酶切后以双链形 式存在，最后释放互补链，miRNA成熟。成熟的miRNA 5端的磷酸 基团和3端羟基则是它与相同长度的功能RNA降解片段的区分标志。 miRNA的又一特点基因表达时序性。MiRNA表达的时序性和组织 特异性提示人们miRNA的分布可能决定组织和细胞的功能特异性，也 可能参与了复杂的基因调控，对组织的发育起重要作用。是一类高度 保守的基因家族，按其作用模式不同可分为三种 。

7、 人类基因组中大约有255个编码miRNA基因，约占人类基因数的 1%，但尚不清楚其功能。最近科学家发现小RNA 与epigenetic现 象有联系。所谓epigenetic 是指并不涉及遗传序列的特征性的遗传改 变。有人已试图将小RNA 用于抗病毒治疗之用,认为它们有可能抑制 HIV21 和灰质类病毒丙型肝炎病毒的转录,以及也可能用于肿瘤的治疗。 miRNA与siRNA的不同点 1.根本区别是miRNA是内源的，是生物体的固有因素；而siRNA是人 工体外合成的，通过转染进入人体内，是RNAi的中间产物。 2.结构上，miRNA是单链RNA，而siRNA是双链RNA。 3.Dicer酶对二者

8、的加工过程不同，miRNA是不对称加工，miRNA仅 是剪切pre-miRNA的一个侧臂，其他部分降解；而siRNA对称地来源 于双链RNA的前体的两侧臂。 4.在作用位置上，miRNA主要作用于靶标基因3-UTR区，而siRNA可 作用于mRNA的任何部位。 5.在作用方式上，miRNA可抑制靶标基因的翻译，也可以导致靶标基 因降解，即在转录水平后和翻译水平起作用，而siRNA只能导致靶标 基因的降解，即为转录水平后调控。 6.miRNA主要在发育过程中起作用，调节内源基因表达，而siRNA不 参与生物生长，是RNAi的产物，原始作用是抑制转座子活性和病毒感 染。 miRNA Detecti

9、on and Expression Profiling What are the differences between miRNA and mRNA miRNAs are too short to allow the alternative probe sequence selections miRNAs do not have polyA tail to initiate cDNA synthesis miRNA labeling requires different strategy miRNAs short lengths give more dispersed hybridizati

10、on affinity and thus signal strength Formation of miRNA Micro RNA (miRNA) is endogenous and present across species. Primary miRNA transcripts (Pri-miRNAs) are processed by RNase III enzyme, Drosha, to generate 70 to 100 nucleotides (nt) hairpin precursors (Pre-miRNAs). Pre-miRNAs are then further pr

11、ocessed by another RNase III enzyme, Dicer, to yield mature miRNAs, ranging from 17 to 24 nt in length. miRNAs are incorporated into the RNA interference (RNAi) effector complex, RISC, and target specific messenger RNAs (mRNA) for translational repression or mRNA cleavage. Therefore, miRNAs play an

12、important role in regulating gene expression. From Bartel, D. P. MicroRNAs: Genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell 116, 281-297 (2004) PCR 核酸杂交核酸杂交是从核酸分子混合液中检测特定大小的核酸分子的传统方法。其原理是核 酸变性和复性理论。即双链核酸在某些理化因素作用下双链解开，而在条件恢复后 又可依碱基配对规律形成双链。杂交通常在一支持膜上进行，因此又称为核酸印迹 杂交。根据检测样品的不同又被分为DNA印迹杂交（Southern

13、blot hybridization ） 和RNA印迹杂交（Northern blot hybridization）。其基本过程包括下列几个步骤。 （1）制备样品：首先从待检测组织提取DNA或RNA。 DNA应先用限制性内切酶消 化以产生特定长度的片段，然后通过凝胶电泳将消化产物按分子大小进行分离。一 般来说DNA分子有其独特的限制性内切酶图谱，所以经酶切消化和电泳分离后可在 凝胶上形成特定的区带。再将含有DNA片段的凝胶进行变性处理后，直接转印到支 持膜上并使其牢固结合。这样等检测片段在凝胶上的位置就直接反映在了转印在膜 上。RNA样品则可直接在变性条件下电泳分离，然后转印并交联固定。 （2

14、）制备探针：探针是指一段能和待检测核酸分子依碱基配对原则而结合的核酸 片段。它可以是一段DNA、RNA或合成的寡核苷酸。探针需要被标记上可直接检测 的元素或分子。 （3）杂交：先要进行预杂交，即用非特异的核酸溶液封闭膜上的非特异性结合位 点。由于转印在膜上的核酸分子已经是变性的分子，所以杂交过程中只需变性标记 好的探针，再让探针与膜在特定的温度下反应，然后洗去未结合的探针分子即可。 （4）检测：检测的方法依标记探针的方法而异。用放射性同位素标记的探针需要 用放射自显影来检测其在膜上的位置；而如果是用生物素等标记的探针则需要用相 应的免疫组织化学的方法进行检测。 基因诊断的方法基因诊断的方法 与

15、疾病相关的遗传背景改变主要有两类，一是遗传物质，即DNA或 RNA的水平变化。二是遗传物质的结构变化，即基因突变，如点突变 引起的基因失活，及染色体转位引起的基因激活或灭活等等。所以理 论上说检测基因水平或结构的方法都应可用于基因诊断。 组织中总RNA的提取 利用反转录酶合成cDNA PCR反应： 反应液组织：反应缓冲液 模板（上述合成的cDNA） 底物（dATP,dGTP,dCTP,dTTP） 引物（例如某种病毒特异性引物） TaqDNA聚合酶 循环：95，30sec（变性） 55，1min（退火）30 or more 循环 72，1min（聚合） 检测：电泳或核酸杂交 PCR用于病毒感染的

16、基因诊断用于病毒感染的基因诊断 在优化的条件下， 核酸杂交可检测 到pg水平的靶分 子，约相当于 106个分子。 但是在许多临床 情况下，无法得 到这样的样品量。 用PCR来特异性 地增加靶分子量， 提高敏感性。 2. 基因芯片的制备技术基因芯片的制备技术 生物芯片技术通过微加工工艺在厘米见方的芯片上集成有成 千上万个与生命相关的信息分子，它可以对生命科学与医学中的各种 生物化学反应过程进行集成，从而实现对基因、配体、抗原等生物活 性物质进行高效快捷的测试和分析。 生物芯片由于采用了微电子学的并行处理和高密度集成的概 念，因此具有高效、高信息量等突出优点。 生物芯片的设想最早起始于80年代中期

17、，90年代美国 Affymetrix公司实现了DNA探针分子的高密度集成，即将特定序列的 寡核苷酸片段以很高的密度有序地固定在一块玻璃、硅等固体片基上， 作为核酸信息的载体，通过与样品的杂交反应获取其核酸序列信息。 Affymetrix公司生物芯片的市场占有率超过50%。 2002年, Nimblegen公司、 Xeotron开始提供光引发原位合成微点阵 （microarray）芯片。 Xeotron公司，微流体 (microfluidic array)芯片; 2004年，Atantic、LC-Science; 2006年，LC-Bio; 2008年，LC-Genetics。 按用途分可分为检

18、测芯片和反应芯片；其形式主要为微点阵芯片。 仅就目前的发展情况，微点阵芯片主要包括DNA微点阵芯片（又称基因芯片 或DNA芯片）、蛋白或多肽微点阵芯片和组织芯片。基于其它生物大分子特 异性相互作用的生物芯片也会相继问世。组织芯片不能用原位合成的方法制 作。所谓DNA微点阵芯片是指同时将大量的探针分子固定到固相支持物上， 借助核酸分子杂交配对的特异性对DNA样品的序列信息进行高效率的解读和 分析，以用于基因表达谱的检测、突变筛查、DNA多肽性分析、DNA测序 和基因组文库作图等研究。 已有多种方法可以将寡核苷酸固定到固相支持物上。这些方法总体上 分为两种：原位合成(in situ synthes

19、is)与合成后以微量点样技术点样。可用 许多先进的固定技术进行制备同时也可实现自动化生产。都适于以玻片为支 持物的芯片制作但有各自的优缺点。原位合成的具体方案有光引导原位合成 (light- directed in situ synthesis)、压电打印原位合成以及分子印章技术等。 微点阵生物芯片的制作方法微点阵生物芯片的制作方法 点样法在多聚物的设计方面与原位合成技术相似。只是合成工作用传统 的DNA、多肽合成仪或PCR扩增或体内克隆等方法完成。大量制备好的核酸探针、 多肽、蛋白等生物大分子再用特殊的自动化微量点样装置将其以较高密度互不干 扰地印点于经过特殊处理的玻片、尼龙膜、硝酸纤维素膜

20、上，并使其与支持物牢 固结合。支持物需预先经过特殊处理，例如多聚赖氨酸或氨基硅烷等。亦可用其 它共价结合的方法将这些生物大分子牢牢地附着于支持物上。现在已经有比较成 型的点样装置出售，例如美国Biodot公司的“喷印”仪以及Cartesian Technologies公司的Pix-Sys NQ/PA系列“打印”仪。这些自动化仪器依据所配 备的“打印”或“喷印”针将生物大分子从多孔板吸出直接“打印”或“喷印” 于芯片片基上(Fig2)。“打印”时针头与芯片片基表面发生接触而“喷印”时针 头与片基表面保持一定的距离。所以“打印”仪适宜制作较高密度的微阵列（例 如2500点/cm2），“喷印”法由于

21、“喷印”的斑点较大，所以只能形成较低密度 的探针阵列，通常400点/cm2。点样法制作芯片的工艺比较简单便于掌握、分析 设备易于获取，适宜用户按照自己的需要灵活机动地设计微点阵，用于科研和实 践工作。 点样法点样法 分子印章技术与上述两种方法在合成原理上相同，区别仅在于该技术利 用预先制作的印章将特定的合成试剂以印章印刷的方式分配到支持物的特定区域。 后续反应步骤类似与压电打印原位合成技术。分子印章类似于传统的印章，其表 面依照阵列合成的要求制作成凹凸不平的平面，依此将不同的核酸或多肽合成试 剂按印到芯片片基特定位点进而进行合成反应。选择适当的合成顺序、设计凹凸 位点不同的印章即可在支持物上原

22、位合成出位置和序列预定的寡核苷酸或寡肽阵 列。从这一点上讲，分子印章原位合成技术与压电打印原位合成技术更为相似。 分子印章除了可用于原位合成外还可以点样方式制作微点阵芯片。例如已有人将 分子印章技术用于蛋白微点阵芯片的制作。 以上三种原位合成技术所依据的固相合成原理相似，只是在合成前体试 剂定位方面采取了不同的解决办法，并由此导致了许多细节上的差异。但三种方 法合成时都必需解决的问题是必需确保不同聚合反应之间的精确定位，这一点对 合成高密度寡核苷酸或多肽阵列尤为重要。同时，由于原位合成每步合成产率的 局限较长(50nt)的寡核苷酸或寡肽序列很难用这种方法合成。但是，由于原位合 成的短核酸探针阵

23、列具有密度高、杂交速度快、效率高等优点，而且杂交效率受 错配碱基的影响很明显，所以原位合成的DNA微点阵适合于进行突变检测、多态 性分析、表达谱检测、杂交测序等需要大量探针和高的杂交严谨性的实验。 分子印章原位合成分子印章原位合成 打印原位合成打印原位合成 压电打印原位合成的方式类似于喷墨打印机，合成原理与传 统的核酸或寡肽固相合成技术相同。合成过程为：合成前以与光 引导原位合成类似的方式对芯片片基进行预处理，使其带有反应 活性基团，例如伯氨基。同时，将合成用前体分子（DNA合成碱 基、cDNA和其它分子）放入打印墨盒内，由电脑依据预定的程序 在xyz方向自动控制打印喷头在芯片支持物上移动，并

24、根据芯片不 同位点探针序列需要将特定的碱基合成前体试剂（不足纳升）喷 印到特定位点。 喷印上去的试剂即以固相合成原理与该处支持物发生偶联反 应。由于脱保护方式为酸去保护，所以每步延伸的合成产率可以 高达99%，合成的探针长度可以达到4050nt。以后每轮偶联反应 依据同样的方式将需要连接的分子喷印到预定位点进行后续的偶 联反应。类似地重复此操作可以在特定位点按照每个位点预定的 序列合成出大量的寡核苷酸探针。 目前，除了Affymetrix公司、Xeotron及Nimblegen等个别公司使用原位 合成技术制造芯片外，大多中小型公司普遍采用点样技术制作生物芯片。 Fig 2. Printing

25、device and the tips. 原位合成具有合成速度快、相对成本低、便于规模化生产等优点。照 相平板印刷技术是平板印刷技术与DNA和多肽固相化学合成技术相结合的产物， 可以在预设位点按照预定的序列方便快捷地合成大量寡核苷酸。 Affymetrix公司运用该技术制造大规模集成的基因芯片。原位合成后的 寡核苷酸或多肽分子与玻片共价连接。它用预先制作的蔽光板和经过修饰的4 种碱基，通过光进行活化从而以固相方式合成微点阵。合成前，预先将玻片氨 基化，并用光不稳定保护剂将活化的氨基保护起来。聚合用单体分子一端活化 另一端受光敏保护剂的保护。选择适当的挡光板（mask）使需要聚合的部位透 光，不

26、需要发生聚合的位点蔽光。这样，光通过挡光板照射到支持物上，受光 部分的氨基解保护，从而与单体分子发生偶联反应。每次反应在成千上万个位 点上添加一个特定的碱基。由于发生反应后的部位依然接受保护剂的保护，所 以可以通过控制挡光板透光与蔽光图案以及每次参与反应单体分子的种类，就 可以实现在特定位点合成大量预定序列寡核苷酸或寡肽的目的。由于每步的合 成产率较低（95%），合成30nt的终产率仅为20%，所以该技术只能合成30nt 左右长度的寡核苷酸（Fig1）。Michigan大学、Huston大学以及Xeotron公司， 将光引导合成技术与半导体工业所用的光敏抗蚀技术相结合，以光不稳定保护 的酸作为

27、去保护剂，将每步合成产率提高到98-99%。 光引导原位合成光引导原位合成 Affimatrix or Nimblegen Chips Parallel synthesis of oligonucleotides Parallel synthesis using acid-labile protecting groups. The DNA chain is deprotected in a spatially controlled manner using photogenerated acid (PGA) (b and d), followed by coupling and oxidati

28、on reactions (c and e). This cycle is repeated until the desired lengths and sequences are obtained (f). 如前所述，Michigan 芯片技术同Affymetrix及Nimblegen芯片技术类 似，都是采用光引发原位合成技术制造芯片，其合成化学都是用亚 磷酰胺偶联-酸脱保护法。其不同点在于，Affymetrix用光不稳定保 护剂将待反应碱基的氨基保护起来，用金属mask将不需要反应的碱 基位置屏蔽掉光；而Michigan 芯片以光不稳定保护的酸作为脱保护 剂，用计算机产生的图象作为mask

29、将不需要反应的碱基位置屏蔽掉 光。以合成45nt的DNA芯片为例，全合成过程需要约168步偶联反 应，即需要168个mask。所以Michigan 芯片技术与Affymetrix相比， 不仅产率高（如前所述，98%对95%），可以用于制作45nt以上的 芯片，而且成本低。 光引发原位合成光引发原位合成微流控芯片微流控芯片制作技术制作技术 PGA (deprotection) light Digital Photolithography Digital Photolithography N H CHC CH2 OH O N NH O (CH3)3C O Boc-His(H) N H CHC CH

30、2 OH O N NH O O O NO2 CH3 O A different method: Building blocks are not easily available. LC SciencesAffymetrix Microfluidic chip (appearance) hn n InletDrainDrain Si Substrate Glass CoverFluid Individual synthesis controlled by addressable light illumination on target reactors Highly miniaturized c

31、hip, 2cmX2cm 4000 individual microreactors! Need uniform reagent supply Ask for proper design thus, ; yet maintaining Microarrays have emerged as a useful tool to understand and correlate gene sequences and their related functions; to extend our knowledge to the proteomic level and to utilize it to

32、capture more information. Our technology enables us to manufacture flexible, high-performance and cost effective microarrays of high fidelity, based on our platform that combines massively parallel light-gated in situ synthesis process, digital photolithography and microfluidic technology. Combined

33、with the above technological advantages, OligoArray 2.0, our oligonucleotide design software and OligoArrayDb, our database of predesigned oligonucleotides, allows expression analysis at the genome scale for any organism for which the genome sequence is known, without relying on cDNA or oligonucleot

34、ide libraries. 1. Gao X. et al, A Flexible light-directed DNA Chip Synthesis Gated By Deprotection Using Solution Photogenerated Acids, Nucleic Acids Research, 29, 4744-4750 (2001). 2. Gao X. et al, Oligonucleotide Synthesis Using Solution Photogenerated Acids, Journal of American Chemical Society,

35、120, 12698-9 (1998). 3. Komolpis K. et al, Light-directed Simultaneous of Oligopeptides on Microarray Substrate Using a Photogenerated Acid, Biotechnology Progress, 18, 641-646 (2002). 4. Leproust E. et al, Digital Light-Directed Synthesis: A Microarray Platform That Permits Rapid Reaction Optimizat

36、ion on a Combinatorial Basis, Journal of Combinatorial Chemistry, 2, 349-354 (2000). 5. Pellois J. P. et al, Individually Addressable Parallel Peptide Synthesis on Microchips, Nature Biotechnology, 20, 922-926 (2002). 6. Rouillard J. M. et al, OligoArray: Genome-Scale Oligonucleotide Design for Micr

37、oarrays, Bioinformatics, 18, 486-7 (2002). DARPA ATO MICHIGAN LIFE SCIENCES CORRIDOR FUND GRANT NO. 1805 MICHIGAN STATE UNIVERSITY UNIVERSITY OF HOUSTON UNIVERSITY OF MICHIGAN-ANN ARBOR MEDICAL SCHOOL XEOTRON CORPORATION Our technology of DNA synthesis on chips combined with the availability of an i

38、ncreasing number of sequenced genomes, have prompted us to implement a software to design specific oligonucleotides for microarrays. Ideally, such oligonucleotides should be totally specific to their respective targets to avoid any cross-hybridization and should not form stable secondary structures

39、that may interfere with the labeled probes during hybridization. We have developed OligoArray (Rouillard et al, 2002), a program to design specific oligonucleotides at genome scale. The latest version, OligoArray 2.0 (Rouillard et al. submitted), uses a thermodynamic approach to predict secondary st

40、ructures and calculate the specificity of a probe on the chips to a unique target in a mixture of labeled targets. We have used our OligoArray 2.0 software to design pangenomic sets of oligonucleotides devoted to gene expression analysis for most of the organisms with a sequenced genome. As of today

41、, we have designed 774,642 oligonucleotides representing 277,976 transcripts from 80 organisms (14 archaea, 59 bacteria and 7 eucaryotes including Homo sapiens and some genetic models). We have successfully designed at least one oligonucleotide for more than 99% of all transcripts from all organisms

42、 processed and there is at least one specific oligonucleotide for 94% of these transcripts. All these oligonucleotide sets are stored into OligoArrayDb, a public database that allows not only to retrieve a complete set of oligonucleotides, but also to build subsets according to user defined keywords

43、 (Rouillard et al, submitted). The combinatorial synthesis has brought about novel opportunities for efficiently creating reactions of a scaffold chemical moiety with a number of different compounds to yield a library of various compounds with different substituent groups, i.e. nucleotides, amino ac

44、ids. A digital microarray platform consisting of a microarray reactor, a micromirror array image projector, a controller computer and an automated synthesizer. By in situ synthesis, an array of oligonucleotides is synthesized using conventional DMT-protected phosphoramidite chemistry. This is differ

45、ent from conventional synthesis by the use of a photogenerated acid (PGA) rather than an acid in DMT deprotection step to control the parallel synthesis. Deprotection is initiated by directing light at selected three-dimensional chambers in microfluidic chips. Upon activation, acid forms in seconds,

46、 removing DMT group. Parallel synthesis using acid-labile protecting groups. The DNA chain is deprotected in a spatially controlled manner using photogenerated acid (PGA) (b and d), followed by coupling and oxidation reactions (c and e). This cycle is repeated until the desired lengths and sequences

47、 are obtained (f). The key to this parallel synthesis is the generation of a photogenerated acid to remove the acid- labile protecting group. The removal of the protecting group is spatially controlled. Based on this fact, many conventional chemical reactions can be adapted to form diverse combinato

48、rial molecular libraries; RNA sequences, peptide analogs and a variety of organic molecules. An incoming phosphoramidite nucleoside monomer is then coupled to the growing oligomer chain. The synthesis cycle is repeated for each additional monomer until an array of thousands of oligonucleotides is fo

49、rmed. The main advantage in this technique is to be able to p r o d u c e l o n g c h a i n s o f oligonucleotides, i.e. 150mer, with a considerably high stepwise efficiency (98.5 %). Schematic illustration of (a) the structure; and (b) the operation of a microfluidic array device. Microreactors (a)

50、 (b) Our fabrication of three-dimensional microchambers is simply a combination of photolithographical techniques, surface and bulk micromachining, applied on silicon based substrate, with the glass bonded at the top; forming a closed system. We are able to fabricate hundreds to thousands of nanocha

51、mbers in an area the size of a dime; each of them being an isolated site for chemical synthesis. These microfluidic chips provide several attractive benefits for use as biological microarrays: - Flexiblity in design - Small inner volume; less than 10 l per chip - Controllable temperature and flow co

52、nditions using a chip processing instrument - Easy to handle because molecules are inside the chip; not on the chip Our microfluidic chip with nanochambers Miniaturized spatially addressable microchips of oligonucleotides and peptides are powerful tools for high-throughput medical, biomedical, envir

53、onmental research, and the advancement of genomics and proteomics. We have validated our oligonucleotide sequence fidelity by testing for the ability to discriminate single base m i s m a t c h e s b y t h e m e a n s o f hybridization using fluorescein-labeled target sequences. FRE images of o-DNA

54、chip hybridization with fluorescein-labeled target sequence. Moving from single mismatch detection, we have started to work on genomic studies for different organisms; investigating gene expression. Some on-going projects: - Gene screening to detect microbial activity in water - Gene expression trac

55、king for beast cancer Microfluidic array used in differential gene expression of brain and skeletal muscle samples. This chip contains 253 cancer genes in 15 replicates throughout the chip. Green shows over expressed genes in brain and red shows over expressed genes in muscle. The right image demons

56、trates well-differentiation as well as uniform spot intensities. Different peptide analogues have shown to have affinities for different metal ions. The peptidomimetic sequences on the microchip shows specific antibody binding and provide insights into molecular details for specificity of epitope bi

57、nding. Peptides are driven from RHSVV epitope sequence for PAb240 antibody, corresponding to residues 213- 217 of p53. Peptides are designed for mutational analysis of the RHSVV epitope sequence, and positional scanning of p53 in the region covering RHSVV; confirming the reported epitope sequence as

58、 well as our success in peptide synthesis. Microarray of tetrapeptides for Pb(II) and As(III) binding: (a) Pattern of localized parallel synthesis of labeled tetrapeptide Glu-Cys-Glu-Glu ( ), Glu-Glu-Glu- Glu ( ), Cys-Cys-Cys-Cys ( ) and Gly-Gly-Gly-Gly ( ). (b) Fluorescence image of labeled tetrape

59、ptides when Pb(II) sensing is introduced. (c) Fluorescence image of the same array when As(III) is introduced. The fluorescence intensity in the image is the increased intensity as a result of metal-peptide binding. L T LLL C LLLLLLLL AC TTT AC CCCCC GC CG A TA T C A T C A T C G A C G A A C T A C T

60、A G C A G C TT O POPOP O POPOP O POPOP O POPOP L T LLL C LLLLLLLL AC TTT AC CCCCC GC CG A TA T C A T C A T C G A C G A A C T A C T A G C A G C TT O POPOP O POPOP O POPOP O POPOP L T LLL C LLLLLLLL AC TTT AC CCCCC GC CG A TA T C A T C A T C G A C G A A C T A C T A G C A G C TT O POPOP O POPOP O POPOP