产青霉素酶菌种的分离

1、产青霉素酶菌种的分离、产青霉素酶菌种的分离、 纯化及活性测定纯化及活性测定 目录目录 l实验原理 l实验内容 l实验结果 l讨论 实验原理实验原理 l青霉素酶又称-内酰胺酶(- lactamase,EC3.5.2.6),可水解-内酰胺类抗生 素。利用青霉素酶具有水解-内酰胺类抗生素 的特点, 可将其用于抗菌药物筛选。 l枯草芽孢杆菌是常见的青霉素酶分泌菌种，革 兰氏阳性菌，属芽孢杆菌。无荚膜，周生鞭毛， 能运动；芽孢呈椭圆到柱状，位于菌体中央或 稍偏。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色， 在液体培养基中生长时，常形成皱醭。 实验原理实验原理 l紫外线作为物理诱变因子对诱变最有效的波长是在 25

2、3-265 nm。紫外线诱变的主要生物学效应是由于 DNA 变化而造成的，DNA 对紫外线有强烈的吸收作 用，尤其是碱基中的嘧啶，它比嘌呤更为敏感。 l在进行酶活力诱导时，采用剩余碘量法测定，以标准 对照法计算含量。青霉素在碱性条件下水解，生成的 青霉噻唑酸在酸性条件下与定量过量的碘作用，剩余 的碘用硫代硫酸钠滴定，同时做空白试验。 实验内容实验内容 （一）从土壤中分离菌种（一）从土壤中分离菌种 1、青霉素溶液的制备：称取0.625g 160万单位/0.96g青 霉素溶解于10ml生理盐水中，即得10万单位/ml的青霉素。 2、采集一个土壤样品，约取10g，75水浴加热20min， 取1ml上

3、层液稀释1000倍，取1ml上层液到100ml（1000、 2000、5000单位）液体培养基，封口摇床培养，即为实 验所用菌液。 3、取菌液分别接种到1000单位，2000单位，5000单位的 培养基，37培养24h。 5.取5000单位的菌，按照上述方法诱导至1万单位。 实验内容实验内容 （二）筛选菌种（二）筛选菌种 1、挑取干燥的菌落（5000单位）进行革兰氏 染色，镜检，将形状为杆状的菌落标上记 号。 （1）涂片（2）晒干（3）固定（4）染色 （5）水洗（6）干燥（7）镜检 2、将筛选出的菌种保存到斜面培养基（4） 实验内容实验内容 （三）酶活力的测定（三）酶活力的测定 1、取菌体平板

4、培养物，接种至发酵培养基内， 在25摇床培养24小时，取摇瓶培养基中菌 液15ml，4000r/min离心15min，沉淀菌体， 取上清液保存。 2、称取青霉素钠（钾）适量，用磷酸盐缓冲液 (pH7.0)，溶解成每1ml中含青霉素1万单位的 溶液。另取粗酶溶液，按估计单位用磷酸盐缓 冲液(pH7.0)稀释1000倍，在37预热。 实验内容实验内容 3、精密量取青霉素溶液50ml,置100ml量瓶中，预热至37 后，精密加入已预热的青霉素酶稀释液25ml，迅速混匀， 在37准确放置1小时，精密量取3ml，立即加至已精密 量取的碘滴定液(0.01mol/L) 25ml中,在室温暗处放置15分 钟，

5、用硫代硫酸钠滴定液(0.01mol/L)滴定，至近终点时， 加淀粉指示液，继续滴定至颜色消失。 4、取已预热的青霉素溶液2ml，在37放置1小时，精密加 入上述碘滴定液(0.01mol/L)25ml，然后精密加粗酶稀释液 1ml，在室温暗处放置15分钟，用硫代硫酸钠滴定液 (0.01mol/L)滴定。得空白滴定消耗。 实验内容实验内容 按下式计算： E(BA)MFD100 式中E为青霉素酶活力，单位(ml.小时)； B为空白滴定所消耗的上述硫代硫酸钠滴定液的容量， ml； A为样品滴定所消耗的上述硫代硫酸钠滴定液的容量， ml； M为硫代硫酸钠滴定液的浓度，mol/L； F为在相同条件下，每1

6、ml的上述碘滴定液(0.01mol/L相 当于青霉素的效价单位（742） D为青霉素酶溶液的稀释倍数。 实验内容实验内容 （四）诱变育种（四）诱变育种 1、将之前保种的10000单位的菌种接种在250ml液体培养基 里面摇床培养18h。 2、将试管里的菌液稀释到100万单位/ml。 3、将稀释后的菌液平铺（约取3ml)在6个灭菌的空平板上， 分别于紫外灯下照射0min、1min、3min、5min、7min、 9min。 4、取照射后的菌液分别涂布在含有青霉素10000单位/ml、 15000单位/ml的固体培养基上，于37培养箱保存，之 后观察菌落生长情况。 5、挑取长出来的菌落在液体培养基

7、里面培养48h，取培养液 进行测酶活，得出结论。 实验结果实验结果 （一）从土壤中分离菌种（一）从土壤中分离菌种 5000单位 1000 10000单位 实验结果实验结果 （二）镜检（二）镜检 实验结果实验结果 （三）酶活测定结果（三）酶活测定结果 结果数据记录：稀释100倍 滴定刻度变化 A 样品 1.73.5 mL 1.8ml B 空白 2.04.1 mL 2.1ml 硫代硫酸钠滴定液浓度 0.01mol/L 碘滴定液浓度 0.05mol/L 计算：E=(BA)MFD100 =（2.1-1.8）0.01742100100 =22260单位 实验结果实验结果 （四）紫外诱变结果（四）紫外诱变结果 第一次做的诱变育种没有长出菌落，因此 重复了诱导步骤，培养48h后仅长出5min平板 其余均未长菌。 总结总结 1、实验过程中尝试很多菌株的诱变方法，平板筛选不成功后及时改 进方案，改为液体培养基梯度培养，我们最终得到了耐10000青 霉素的菌株。经过镜检发现该菌株确实是杆菌，对此菌株进行了 保存。 2、在酶活力测定过程中，按药典配制的滴定液浓度经滴定测定不准 确，原因可能是没有及时将硫代硫酸钠避光保存，因而最终结果 酶活力偏小。 3、第一次紫外诱变后所有平板包括对照均没有长菌，对菌株进行了 第二次10000单位诱导发现其确实为所需要的菌株，于是进行了第 二次诱导。 第二次诱导12h