保加利亚乳杆菌

1、保加利亚乳杆菌的分离保加利亚乳杆菌的分离 第一组 组员：占小芸、王明振、 杨和敏、吴蕊意、桂方 课题 现提供一瓶酸奶（光明益生菌发酵 乳），内有保加利亚乳杆菌、嗜热 链球菌，嗜酸乳杆菌，两歧双歧杆 菌、干酪乳杆菌。现分离出保加利 亚乳杆菌，并制成斜面冰箱保存 保加利亚乳杆菌形态：菌体长约2-9um,宽约0.5-0.8um,呈单 个体长杆状,不具运动性,也不会产生孢子。 培养特性：在牛奶上培养,菌落为无色到淡白色,通常呈不光 滑状,直径1-3mm左右。生长需维生素B3和烟碱酸的帮助 培养：氧气需求方面,此菌为厌氧性,但在有氧状况下也可作 用;酸碱度方面,为耐酸或嗜酸性,因低 pH能防止一些微生

2、物的生长;温度方面,为嗜温至少许嗜热,最适生长温度在 37-45之间,对低温非常敏感。 能发酵的醣类有lactose（乳糖）,glucose葡萄糖）,fructose （果糖）,mannose（甘露糖）,sorbitol（山梨糖醇）等。 利用MRS琼脂培养基对保加利亚乳 杆菌进行分离,分别挑取可疑菌落 进行革兰氏染色,对镜检结果为革 兰氏阳性菌,且细菌形状为杆状的 菌种进行糖发酵试验生物化学鉴 定.结论:在MRS琼脂培养基上,菌 落较大、透明、灰白色,镜检细菌 形状为杆状,麦芽糖和七叶苷发酵 试验均为阴性,乳糖发酵阳性的菌 种,即为保加利亚乳杆菌. 实验设计原理实验设计原理 试验流程试验流程

3、检样检样25ml样品样品+ 225ml稀释液，均质稀释液，均质 10倍系列稀释倍系列稀释 选择选择23个适宜稀释度个适宜稀释度 的样品菌液的样品菌液,各取各取1ml分分 别涂布别涂布MRS琼脂培养基琼脂培养基 上上 平板置于平板置于37CO2培养箱培养箱 培养培养23天天 选取选取50300个菌落的个菌落的 稀释度稀释度,挑取可疑菌落的挑取可疑菌落的 一半进行革兰氏染色一半进行革兰氏染色 另一半接种于乳清琼另一半接种于乳清琼 脂培养基脂培养基,准备做生化准备做生化 鉴定鉴定 将疑似菌落穿刺接种于五将疑似菌落穿刺接种于五 种糖发酵半固体琼脂培养种糖发酵半固体琼脂培养 基基(麦芽糖、七叶苷、乳糖麦

4、芽糖、七叶苷、乳糖 蔗糖、葡萄糖蔗糖、葡萄糖) 平板置于平板置于37CO2 培养箱培养培养箱培养23天天 判断、制斜面、冰箱判断、制斜面、冰箱 保存保存 可疑菌落可疑菌落:菌落较大，透明，灰白色 的为疑似菌落 1.1材料与设备材料与设备 原料原料：酸奶酸奶、MRS琼脂培养基、乳清培养基、乳琼脂培养基、乳清培养基、乳 清、糖发酵培养基、化学试剂均为分析纯或生化清、糖发酵培养基、化学试剂均为分析纯或生化 试剂胰蛋白膏、酵母膏、酵母提取物、鱼肉蛋白试剂胰蛋白膏、酵母膏、酵母提取物、鱼肉蛋白 胨、生化鉴定糖类（麦芽糖、七叶苷、乳糖、蔗胨、生化鉴定糖类（麦芽糖、七叶苷、乳糖、蔗 糖、葡萄糖糖、葡萄糖）

5、设备及仪器设备及仪器：超净工作台、高压灭菌锅、超净工作台、高压灭菌锅、CO2培培 养箱、显微镜养箱、显微镜 、培养皿、烧杯、电炉、试管、搪培养皿、烧杯、电炉、试管、搪 瓷杯、酒精灯、吸量管、试管架、电子天平、瓷杯、酒精灯、吸量管、试管架、电子天平、pH 试纸、玻璃棒、恒温水浴箱、冰箱、接种环、接试纸、玻璃棒、恒温水浴箱、冰箱、接种环、接 种针、量筒种针、量筒纱布纱布脱脂棉等脱脂棉等 1.2培养基的配置培养基的配置 MRS琼脂培养基的制备 配方配方：葡萄糖：葡萄糖20、胰蛋白胨、胰蛋白胨10、牛肉膏、牛肉膏 10、酵母提取物、酵母提取物5、柠檬酸二铵、柠檬酸二铵2、磷、磷 酸二氢钾酸二氢钾2、M

6、gSO47H2O0.58、 MnSO44H2O0.25、吐温、吐温80为为1ml、蒸馏水、蒸馏水 1L、琼脂、琼脂20 制法制法：将：将MgSO47H2O、MnSO44H2O葡葡 萄糖以及吐温萄糖以及吐温80以外的各成分溶解、冷却至以外的各成分溶解、冷却至 50，以醋酸调节，以醋酸调节pH值为值为6.06.5而后加入而后加入 MgSO47H2O、 MnSO44H2O，最后加葡萄，最后加葡萄 糖和吐温糖和吐温80，在，在121高温灭菌高温灭菌20min 2.乳清培养基的制备乳清培养基的制备 配方配方：乳清：乳清500ml;蒸馏水蒸馏水500ml；胰蛋白胨；胰蛋白胨5g；葡萄糖；葡萄糖1g； 酵母

7、膏酵母膏2.5g；琼脂粉；琼脂粉20g；pH值为值为6.5. 制法制法：将上述各成分加热溶解于乳清中，调整：将上述各成分加热溶解于乳清中，调整pH为为6.5，加，加 入琼脂，加热溶解，入琼脂，加热溶解，115，高压灭菌，高压灭菌20min，倾注平板，倾注平板 3.乳清的制备乳清的制备 称取乳清粉称取乳清粉100g加入加入90的的1L蒸馏水中溶解蒸馏水中溶解 （先将水加热，而后加入乳清粉，以防糊底（先将水加热，而后加入乳清粉，以防糊底)。 去去68ml浓度为浓度为1mol/L的的HCl倒入上述倒入上述1L乳清粉乳清粉 液中，调节液中，调节pH值至值至4.5左右（最好一次调成），左右（最好一次调成

8、）， 保持保持9030min，使酪蛋白大量析出，凝结成，使酪蛋白大量析出，凝结成 块。用脱脂棉和纱布过滤出乳清，将乳清用浓度块。用脱脂棉和纱布过滤出乳清，将乳清用浓度 为为1mol/L的的NaCl调回调回pH值至值至6.5，而后煮沸，再，而后煮沸，再 用滤纸过滤，流通蒸汽灭菌用滤纸过滤，流通蒸汽灭菌30min备用。备用。 4.糖发酵培养基的制备 配方：鱼肉蛋白胨鱼肉蛋白胨5g，酵母提取物，酵母提取物5g，胰蛋白胨，胰蛋白胨5g， 柠檬酸二铵柠檬酸二铵2g，乙酸钠，乙酸钠5g，磷酸氢二钾，磷酸氢二钾2g， MgSO4, 7H2O为为0.2g， MnSO4, 4H2O为为0.2g， CaCO33g

9、，吐温，吐温80为为1ml，蒸馏水，蒸馏水1L，质量分数，质量分数 为为1.6溴甲酚紫，琼脂粉溴甲酚紫，琼脂粉5g，麦芽糖（七叶苷、，麦芽糖（七叶苷、 乳糖、蔗糖、葡萄糖）乳糖、蔗糖、葡萄糖）10g。 制法：将将MgSO4, 7H2O， MnSO4, 4H2O，麦芽糖，麦芽糖 （七叶苷、乳糖、蔗糖、葡萄糖），吐温（七叶苷、乳糖、蔗糖、葡萄糖），吐温80以外以外 的各成分溶解，冷去至的各成分溶解，冷去至50，以醋酸调节，以醋酸调节pH值至值至 6.26.4，在，在121高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌20min 取酸奶取酸奶25ml，放入无菌三角瓶中，加入无菌生理盐水，放入无菌三角瓶中，加入无菌生理盐水

10、225ml，充分溶，充分溶 解混匀。解混匀。 从试管中取出从试管中取出1ml菌液，于另一试管中，再加入菌液，于另一试管中，再加入9ml无菌生理盐水。无菌生理盐水。 如此稀释四次。如此稀释四次。5个试管分别按顺序记为个试管分别按顺序记为1,2,3,4,5。 分别从分别从5个试管中取出个试管中取出0.05ml菌液涂布于菌液涂布于MRS琼脂平板，稀释菌液置琼脂平板，稀释菌液置 于于4冰箱备用，冰箱备用， 平板置于平板置于37，在，在CO2培养箱中培养培养箱中培养23d。 挑取可疑菌落的一半进行革兰氏染色。挑取可疑菌落的一半进行革兰氏染色。 另一半分纯种接种于乳清琼脂培养基，准备做生化鉴定另一半分纯种

11、接种于乳清琼脂培养基，准备做生化鉴定 取麦芽糖、七叶苷、乳糖、蔗糖和葡萄糖五种糖发酵半固体培养基，取麦芽糖、七叶苷、乳糖、蔗糖和葡萄糖五种糖发酵半固体培养基， 分装试管，高度约为分装试管，高度约为45。 用接种环以无菌操作从纯培养于乳清琼脂培养基的疑似菌种穿刺接种。用接种环以无菌操作从纯培养于乳清琼脂培养基的疑似菌种穿刺接种。 置于置于37下下CO2培养箱中培养培养箱中培养23d 挑取纯种的保加利亚杆菌于含有培养基的试管中，并制做成斜面发在适挑取纯种的保加利亚杆菌于含有培养基的试管中，并制做成斜面发在适 当的条件下进行保藏当的条件下进行保藏。 实验步骤实验步骤 试验中使用了5个菌液稀释度（102,103,104,105,106）进行涂 布，目的是为了确定哪个稀释度最适宜。一般在培养基上 长出50300个菌落的稀释度为最佳。 生化鉴定的结果是：乳糖发酵试管中培养基由紫色变为黄色 者，其余4种糖发酵培养基均未变色的菌落。 生化鉴定结果生化鉴定结果 3 结论 将实验结果与鉴定流程和生化特性对照，可以得出：利用 MRS培养基分离出的菌种，表现为菌落较大、透明、灰白 色，镜检细菌形状为杆状，麦芽糖和七叶苷发酵试验均为 阴性。乳糖发酵为阳性的菌种，即为保加利亚乳杆菌 实验用品的依据 MRS琼脂培养基琼脂培养基的选择:当乳酸菌生长代谢出乳酸后，会使 pH下降而使颜色由绿变为黄绿，也