食品生物技术原理：第七章 食品安全的生物技术检测

1、食品安全的生物技术检测食品安全的生物技术检测 一、转基因生物的特性一、转基因生物的特性 n1、由启动子、结构基因和终止子组成的、由启动子、结构基因和终止子组成的 基因盒（基因盒（gene cassette）。）。 n2、抗性筛选标记基因和报告基因、抗性筛选标记基因和报告基因 n重组质粒基因包括：重组质粒基因包括： 标记片段启动子目的基因终止子 载 体 基 因 片 段 3、检测目标 n在检测转基因食品时，主要针对在检测转基因食品时，主要针对 外源启动子、终止子、筛选标记外源启动子、终止子、筛选标记 基因、报告基因和结构基因的基因、报告基因和结构基因的 DNA序列和产物进行检测。序列和产物进行检测

2、。 4、检测的方式、检测的方式 n基于核酸的基于核酸的PCR检测检测 技术技术 n基于蛋白质的酶学和基于蛋白质的酶学和 免疫学检测技术免疫学检测技术 n向自动化技术发展的向自动化技术发展的 生物传感器生物传感器 n生物芯片技术。生物芯片技术。 二、PCR检测技术 n1、策略：、策略： n针对外源的序列进行针对外源的序列进行 检测检测 ，如：，如： CaMV35S启动子，启动子， 和和NOS终止子，抗性终止子，抗性 筛选标记基因和报告筛选标记基因和报告 基因。基因。 2、优点优点 n可以从加工过的食品可以从加工过的食品 中检测出外源基因，中检测出外源基因， 并且具有操作相对简并且具有操作相对简

3、单的特点，因此成为单的特点，因此成为 目前应用最为广泛的目前应用最为广泛的 检测方法。检测方法。 n表 PCR检测植物源转基因食品目的DNA所用引物 n 靶基因 引物序列 产物长度（bp） n NPT TGCGGCCGCTTGGGTGGAGAG 470 n CTGGCGCGAGCCCCTGATGCT n CAT TCTTGCCCGCCTGATGAATGCTC 471 n GCCCCGCCCTGCCACTC n HPT AGCTGCGCCGATGGTTTCTACAA 509 n ATCGCCTCGCTCCAGTCAATG n GUS CTGCGACGCTCACACCGATACC 441 n TC

4、ACCGAAGTTCATGCCAGTCCAG n NOS终止子 AGAAGGAGTGCGTCGAAGCA 178 n AATCATAAAAACCCATCTCA n OCS终止子 ATCAAATCTTCCAGCTTTAA 185 n CAATCAGTAAATTGAACGGA n CaMV终止子 CGCAAATCACCAGTCTCTCT 201 n ACTGGATTTTGGTTTTAGGA n BAR GCCGACATCCGCCGTGCCAC 479 n GTCCAGCTGCCAGAAACCCA n BARNASE CTGGGTGGCATCAAAAGGGAACC 160 n TCCGGTCTGAA

5、TTTCTGAAGCCTG n BARSTAR TCAGAAGTATCAGCGACCTCCACC 235 n AAGTATGATGGTGATGTCGCAGCC nCamv35S GCTCCTACAAATGCCATCA 195 n 启动子 GATAGTTGGGATTGTGCGTCA 3、 PCR技术 n普通普通PCR技术技术 n巢式巢式PCR技术技术 n多重多重PCR技术技术 nPCR-ELISA技术技术 n定量定量PCR技术技术 nreal-time 实时定量实时定量PCR技术等。技术等。 1）普通PCR反应 *是目前应用最为广泛的技术，是其他是目前应用最为广泛的技术，是其他PCR技技 术的基

6、础。术的基础。 *通过对要扩增的目标通过对要扩增的目标DNA序列设计特异引物序列设计特异引物 （或简并引物），优化反应条件，达到对目标（或简并引物），优化反应条件，达到对目标 序列扩增的目的序列扩增的目的。 *普通普通PCR广泛应用于分子生物学研究的各个广泛应用于分子生物学研究的各个 领域。如病原菌的检测、转基因生物的检测、领域。如病原菌的检测、转基因生物的检测、 疾病的检测、基因的克隆、基因工程载体的构疾病的检测、基因的克隆、基因工程载体的构 建等。建等。 2）巢式、半巢式巢式、半巢式PCR技术技术 n是消除假阴性、是消除假阴性、 假阳性提高灵敏假阳性提高灵敏 度的方法。度的方法。 巢式巢式

7、PCR技术技术 n设计两对引物，其中一对引物结合的位设计两对引物，其中一对引物结合的位 点在另一对引物扩增的产物之中。点在另一对引物扩增的产物之中。 具体过程：具体过程： 首先运行扩增大片段的引物，然后以第一首先运行扩增大片段的引物，然后以第一 次扩增的产物作为模板，进行第二次扩增，次扩增的产物作为模板，进行第二次扩增， 这样通过产物的琼脂糖凝胶电泳比较就可这样通过产物的琼脂糖凝胶电泳比较就可 以知道检测结果。以知道检测结果。 如果第一次扩增是非特异的，而且扩增的片断大如果第一次扩增是非特异的，而且扩增的片断大 小与设计的相似，在电泳中无法区别，这时通小与设计的相似，在电泳中无法区别，这时通

8、过第二次扩增，由于第二对引物与扩增产物中过第二次扩增，由于第二对引物与扩增产物中 没有配对的序列，因此不能扩增出产物。这样没有配对的序列，因此不能扩增出产物。这样 就消除了假阳性的干扰。就消除了假阳性的干扰。 n同时，由于第一次扩增起到模板数量放大的作同时，由于第一次扩增起到模板数量放大的作 用，使检测的灵敏度增加了用，使检测的灵敏度增加了3-6个数量级，使个数量级，使 检测的低限达到检测的低限达到pg乃至乃至fg级。级。 3）多重）多重PCR技术技术 即设计一组引物，在一个即设计一组引物，在一个PCR反应过程中，反应过程中， 对多个目的片断进行扩增。对多个目的片断进行扩增。 n特性：包括内部

9、对照、指示模板数量和质特性：包括内部对照、指示模板数量和质 量、消耗的时间和试剂少，使得多重量、消耗的时间和试剂少，使得多重PCR 技术已发展成为一种通用的技术。技术已发展成为一种通用的技术。 应用应用 n在病原体检测、性别筛选、连锁分析、在病原体检测、性别筛选、连锁分析、 法医研究、模板定量和遗传疾病诊断等。法医研究、模板定量和遗传疾病诊断等。 在对细菌的在对细菌的PCR分析中，应用多重分析中，应用多重PCR 技术非常有优越性，可以区分同一属中技术非常有优越性，可以区分同一属中 的种和株，这样我们就检测出在同一属的种和株，这样我们就检测出在同一属 病原菌中，是否有对人体有害的病原菌病原菌中，

10、是否有对人体有害的病原菌 或产毒菌。或产毒菌。 n目前，已有利用多重目前，已有利用多重PCR技术检测技术检测 Salmonella、Escherichia coli、 Listeria 等食品有害菌。等食品有害菌。 4）PCR-ELISA技术 n指用指用ELISA技术检测技术检测PCR的产物。的产物。 n在在PCR反应体系中加入生物素标记的反应体系中加入生物素标记的dUTP和和 其他其他3种种dNTP，这样在扩增反应中生物素标，这样在扩增反应中生物素标 记的核苷酸就会掺入到新合成的记的核苷酸就会掺入到新合成的DNA链中去，链中去， 经过电泳或过柱除去游离的经过电泳或过柱除去游离的dNTP、引物

11、和引、引物和引 物二聚体后，用物二聚体后，用3端经端经DIG标记的特异探针与标记的特异探针与 之结合，然后加到包被有抗生素抗体的酶标板之结合，然后加到包被有抗生素抗体的酶标板 上，此后，用上，此后，用ELISA法进行定性或定量分析。法进行定性或定量分析。 4、酶学检测技术 n目前在基因工程中应用的报告基因和抗性目前在基因工程中应用的报告基因和抗性 筛选标记基因都是编码某一种酶。筛选标记基因都是编码某一种酶。 n主要有：卡那霉素抗性标记基因（主要有：卡那霉素抗性标记基因（Npt）、）、 -葡萄糖苷酸酶基因（葡萄糖苷酸酶基因（GUS）、氯霉素乙）、氯霉素乙 酰转移酶基因（酰转移酶基因（Cat）、胭

12、脂碱合成酶基因）、胭脂碱合成酶基因 （Nos）、章鱼碱合成酶基因（）、章鱼碱合成酶基因（Oct）等。）等。 特点特点 n酶学检测方法一般适用于对酶学检测方法一般适用于对 鲜活组织的检测和对接受基鲜活组织的检测和对接受基 因工程改造生物体的初步检因工程改造生物体的初步检 测。测。 n目前在许多情况下，国外一目前在许多情况下，国外一 些公司可以通过一些技术手些公司可以通过一些技术手 段删除抗性筛选标记基因，段删除抗性筛选标记基因， 因此用酶学检测转基因食品因此用酶学检测转基因食品 原料，在应用中有一定的局原料，在应用中有一定的局 限性。限性。 1）GUS基因的检测基因的检测 nGUS基因存在于某些

13、细菌体基因存在于某些细菌体 内，编码内，编码-葡萄糖苷酸酶葡萄糖苷酸酶 （-glucuronidase， GUS）。）。 n是一种水解酶，可以催化许是一种水解酶，可以催化许 多多-葡萄糖苷酯类的化合物葡萄糖苷酯类的化合物 水解。水解。 特性特性 n该酶在表现活性时不需要辅酶，最该酶在表现活性时不需要辅酶，最 适适pH范围较宽为范围较宽为5.28.0，同时也，同时也 适应较宽的离子浓度。适应较宽的离子浓度。 n该酶的专一性较差，该酶的专一性较差，-葡萄糖苷酸葡萄糖苷酸 酯（酯（X-Gluc）、）、4-甲基伞形酮酰甲基伞形酮酰- D-葡萄糖醛酸苷酯（葡萄糖醛酸苷酯（4-MUG）和对）和对 硝基苯硝

14、基苯-D-葡萄糖醛酸苷（葡萄糖醛酸苷（PNPG） 都可以作为底物。都可以作为底物。 常用方法： na）组织化学染色定位法；）组织化学染色定位法； nb）荧光光度法测定）荧光光度法测定Gus活性；活性； nc）分光光度法测定）分光光度法测定Gus的活的活 性性 2）Cat基因的检测基因的检测 nCat基因编码氯霉素乙酰转移酶。基因编码氯霉素乙酰转移酶。 n催化乙酰催化乙酰COA上的乙酰基转向氯霉素生成上的乙酰基转向氯霉素生成 1-乙酰氯霉素、乙酰氯霉素、3-乙酰氯霉素、乙酰氯霉素、1，3-二二 乙酰氯霉素。乙酰化的氯霉素不再具有氯乙酰氯霉素。乙酰化的氯霉素不再具有氯 霉素的活性，失去了干扰蛋白质

15、的作用。霉素的活性，失去了干扰蛋白质的作用。 n真核细胞不含真核细胞不含Cat基因，无该酶的内源活基因，无该酶的内源活 性，转化性，转化Cat基因的细胞可以产生对氯霉基因的细胞可以产生对氯霉 素的抗性，并可通过检测转化细胞中素的抗性，并可通过检测转化细胞中Cat 活性来了解是否是转基因生物。活性来了解是否是转基因生物。 检测检测 nCat的活性通过反应底物乙酰的活性通过反应底物乙酰CoA 的减少或反应产物乙酰化氯霉素及的减少或反应产物乙酰化氯霉素及 还原型还原型CoASH的生成来测定。的生成来测定。 n目前常用的方法有硅胶目前常用的方法有硅胶G薄层层析薄层层析 法及法及DTNB分光光度法。分光

16、光度法。 3）冠瘿碱合成酶基因的检测）冠瘿碱合成酶基因的检测 n冠瘿碱合成酶基因存在于农冠瘿碱合成酶基因存在于农 杆菌杆菌Ti质粒或质粒或Ri质粒上，该质粒上，该 基因与基因与Ti质粒的致瘤作用无质粒的致瘤作用无 关，该基因的启动子是真核关，该基因的启动子是真核 性的，在农杆菌中并不表达，性的，在农杆菌中并不表达， 整合到植物染色体上后就可整合到植物染色体上后就可 以表达。以表达。 冠瘿碱合成酶有两种： n 一种是胭脂碱合成酶（一种是胭脂碱合成酶（nopaline synthase），）， 催化冠瘿碱的前体物质精氨酸与催化冠瘿碱的前体物质精氨酸与-酮戊二酸进行酮戊二酸进行 缩合反应，生成胭脂碱

17、。缩合反应，生成胭脂碱。 n 精氨酸精氨酸 + -酮戊二酸酮戊二酸 + NADH 胭脂碱胭脂碱 + NAD+ n另一种是章鱼碱合成酶另一种是章鱼碱合成酶,催化精氨酸与丙氨酸缩合催化精氨酸与丙氨酸缩合 而成。而成。. n 精氨酸精氨酸 + 丙酮酸丙酮酸 + NADH 章鱼碱章鱼碱 + NAD+ 检测 n植物细胞中胭脂碱的检出植物细胞中胭脂碱的检出,目前主要采取目前主要采取 Otten的方法。的方法。 Otten法法 n原理是利用纸电泳分离被检组原理是利用纸电泳分离被检组 织的抽提物，然后用菲醌染色。织的抽提物，然后用菲醌染色。 n因为菲醌是胍基类化合物的特因为菲醌是胍基类化合物的特 异性染色剂，

18、与精氨酸、胭脂异性染色剂，与精氨酸、胭脂 碱、章鱼碱作用后在紫外光下碱、章鱼碱作用后在紫外光下 显示黄色荧光，放置两天后变显示黄色荧光，放置两天后变 成兰色。成兰色。 4）Npt基因的检测 n 该基因来源于细菌转座子该基因来源于细菌转座子Tn5上的上的aphA2， 编码氨基糖苷编码氨基糖苷-3-磷酸转移酶，使氨基糖苷类磷酸转移酶，使氨基糖苷类 抗生素（新霉素、卡那霉素、庆大霉素等）磷抗生素（新霉素、卡那霉素、庆大霉素等）磷 酸化而失活。酸化而失活。 n使用了使用了Npt基因转化植物可以使植物细胞产基因转化植物可以使植物细胞产 生对氨基糖苷类抗生素的抗性，因此，是一个生对氨基糖苷类抗生素的抗性，

19、因此，是一个 有效的选择标记基因；有效的选择标记基因； n该酶可以通过反应检测其表达，因而又是一个该酶可以通过反应检测其表达，因而又是一个 常用的报告基因。常用的报告基因。 检测原理 n利用放射性标记同位素利用放射性标记同位素-32PATP，通，通 过过-32P基团转移，生成带放射性的磷基团转移，生成带放射性的磷 酸卡那霉素，通过点渍法、层析法、凝酸卡那霉素，通过点渍法、层析法、凝 胶原位检测法对放射性胶原位检测法对放射性-32P进行定量进行定量 分析检测。分析检测。 5） Pat基因检测 nPat基因编码抗除草剂基因编码抗除草剂PPT 的乙酰转移酶（的乙酰转移酶（PAT）。）。 n除草剂除草剂PPT是一种谷氨酸结是一种谷氨酸结 构的类似物，可以竞争性的构的类似物，可以竞争性的 抑制谷氨酰氨合成酶（抑制谷氨酰氨合成酶（GS） 的活性，使细胞内的的活性，使细胞内的NH4+ 积累而中毒死亡。积累而中毒死亡。 nPat编码的编码的PPT乙酰乙酰 转移酶（转移酶（PAT）可）可 以催化乙酰以催化乙酰CoA分分 子上的乙酰基转移子上的乙酰基转移 到游离氨基上，使到游离氨基上，使 PPT乙酰化失去对乙酰化失去对 GS的抑制作用，而的抑