《酶的组织化学》

1、1 2 酶组织化学反应主要经过两步：酶组织化学反应主要经过两步： 1.1.酶促反应，即酶催化细胞内相应底物，酶促反应，即酶催化细胞内相应底物， 生成无色的初级反应底物。生成无色的初级反应底物。 2.2.显色反应，捕获和偶联。将初级反应产显色反应，捕获和偶联。将初级反应产 物与捕获剂反应，经过一步或两步反应物与捕获剂反应，经过一步或两步反应 生成有色的最终反应产物，或将初级反生成有色的最终反应产物，或将初级反 应产物与一些偶联剂发生偶联反应生成应产物与一些偶联剂发生偶联反应生成 有色沉淀，显示酶活性部位。有色沉淀，显示酶活性部位。 3 遵循原则：遵循原则： 1.1.尽量保持组织细胞生活时的形态和

2、结构。尽量保持组织细胞生活时的形态和结构。 2.2.尽量保持组织细胞生活时酶及其他成分的尽量保持组织细胞生活时酶及其他成分的 活性，不影响酶的活性和分布。活性，不影响酶的活性和分布。 3. 3. 底物和辅助剂必须迅速而同步地渗透到组底物和辅助剂必须迅速而同步地渗透到组 织和细胞中去。织和细胞中去。 4. 4. 底物最好只能被一种酶催化分解。底物最好只能被一种酶催化分解。 4 5. 5. 尽量减少初级反应产物在组织细胞内尽量减少初级反应产物在组织细胞内 的弥散程度。的弥散程度。 6. 6. 反应产生的最终反应产物应是不溶于反应产生的最终反应产物应是不溶于 水的有色而稳定的物质，沉积于原位，其水的

3、有色而稳定的物质，沉积于原位，其 颜色深度与物质含量或酶活性应有一定量颜色深度与物质含量或酶活性应有一定量 效关系。效关系。 5 7. 7. 由于酶的活性可受到很多因素影响，由于酶的活性可受到很多因素影响， 因而在酶生化方面有许多要求，以保证因而在酶生化方面有许多要求，以保证 充分显示酶的活性：充分显示酶的活性： 最适孵育温度（最适孵育温度（25-3725-37。 。C C） ） 最适最适pHpH值值 最适底物及辅助物浓度最适底物及辅助物浓度 激活剂与抑制剂激活剂与抑制剂 6 酶的组织化学方法基本原理酶的组织化学方法基本原理 沉淀反应法沉淀反应法 1. 1. 金属盐法金属盐法（金属阳离子沉淀反

4、应）由（金属阳离子沉淀反应）由 于酶的活性可使孵育底物分解，其生成于酶的活性可使孵育底物分解，其生成 的基团可与金属离子结合而产生沉淀，的基团可与金属离子结合而产生沉淀， 最后在酶的活性部位生成不溶性的有色最后在酶的活性部位生成不溶性的有色 金属盐沉淀。如金属盐沉淀。如钙钙- -钴法显示碱性磷酸酶。钴法显示碱性磷酸酶。 7 2. 2. 偶联偶氮色素法偶联偶氮色素法 由于酶活性可使由于酶活性可使 含萘酚的底物化合物分解，其分解产物含萘酚的底物化合物分解，其分解产物 可与重氮盐结合，引起偶联偶氮反应，可与重氮盐结合，引起偶联偶氮反应， 形成不溶性的偶氮色素，以证明酶的活形成不溶性的偶氮色素，以证明

5、酶的活 性部位。性部位。 8 电子传递法电子传递法 根据氧化还原的原理显示氧化酶和根据氧化还原的原理显示氧化酶和 脱氢酶。脱氢酶的作用使底物脱氢氧化，脱氢酶。脱氢酶的作用使底物脱氢氧化， 脱下的氢可与作为受氢体的无色四唑盐脱下的氢可与作为受氢体的无色四唑盐 或双四唑盐结合，后者被还原成甲或双或双四唑盐结合，后者被还原成甲或双 甲潜紫蓝色沉淀。如甲潜紫蓝色沉淀。如琥珀酸脱氢酶显示琥珀酸脱氢酶显示 方法属于此法。方法属于此法。 9 水解酶类水解酶类 水解酶催化下列反应水解酶催化下列反应 ： AB+HAB+H2 2O AH+BOHO AH+BOH 包括酯酶、糖苷酶、肽酶、磷酸酶等。包括酯酶、糖苷酶、

6、肽酶、磷酸酶等。 10 碱性磷酸酶钙碱性磷酸酶钙- -钴显示法钴显示法 原理：原理：AKPAKP在有激活剂（在有激活剂（MgMg+ +）存在和 ）存在和 pH9.4pH9.4时，将磷酸盐底物分解产生磷酸根时，将磷酸盐底物分解产生磷酸根 离子，磷酸根离子被孵育液中高浓度的离子，磷酸根离子被孵育液中高浓度的 钙盐所捕获，在有酶活性存在处生成磷钙盐所捕获，在有酶活性存在处生成磷 酸钙沉淀，再加入硝酸钴，用酸钙沉淀，再加入硝酸钴，用CoCo2+ 2+置换 置换 CaCa2+ 2+ ，从而生成磷酸钴沉淀，因其无色 ，从而生成磷酸钴沉淀，因其无色 需通过硫化铵处理形成黑色硫化钴颗粒需通过硫化铵处理形成黑色

7、硫化钴颗粒 沉淀，显示酶活性所在部位，此沉淀与沉淀，显示酶活性所在部位，此沉淀与 AKPAKP含量成正比。含量成正比。 11 试剂配制：试剂配制： 1. 1. 作用液作用液 2%2%巴比妥钠巴比妥钠 5ml5ml；3%-3%-甘甘 油磷酸钠油磷酸钠 5 ml5 ml；2%2%无水氯化钙无水氯化钙 10ml10ml； 0.1%0.1%硫酸镁硫酸镁 0.5 ml0.5 ml；蒸馏水；蒸馏水 2.5 ml2.5 ml。 此液此液pHpH为为9.49.4，如不到，如不到9.49.4，可用，可用0.1N 0.1N NaOHNaOH调节。调节。 2. 2% 2. 2% 硝酸钴硝酸钴 3. 1-2% 3.

8、1-2% 硫化铵硫化铵 （现配）（现配） 12 操作步骤操作步骤 1. 1. 新鲜组织恒冷切片，切片直接入孵育新鲜组织恒冷切片，切片直接入孵育 液液3737。 。C 10-40 C 10-40 分钟。分钟。 2. 2. 流水洗流水洗2 2分钟。分钟。 3. 2%3. 2%硝酸钴硝酸钴5 5分钟。分钟。 4. 4. 蒸馏水洗。蒸馏水洗。 5. 5. 硫化铵硫化铵3030秒秒-1-1分钟。分钟。 6. 6. 蒸馏水洗。蒸馏水洗。 7. 7. 甘油明胶封固。甘油明胶封固。 13 碱性磷酸酶 结果：结果： AKPAKP所在部位呈所在部位呈 黑色硫化钴沉黑色硫化钴沉 淀。淀。 14 6-磷酸磷酸 葡萄糖

9、酶葡萄糖酶 结果结果： 酶活性处酶活性处 为棕黄色为棕黄色 硫化铅沉硫化铅沉 淀，细胞淀，细胞 核为阴性核为阴性 反应。反应。 15 对照对照 去底物对照，作用液中以蒸馏水代去底物对照，作用液中以蒸馏水代 替替-甘油磷酸钠，其他步骤同上，酶反甘油磷酸钠，其他步骤同上，酶反 应阴性。应阴性。 16 氧化还原酶氧化还原酶 催化氧化还原反应的酶。催化氧化还原反应的酶。 17 琥珀酸脱氢酶（琥珀酸脱氢酶（SDHSDH）硝基四唑盐法）硝基四唑盐法 原理：原理：琥珀酸脱氢酶琥珀酸脱氢酶（SDHSDH）作用于底作用于底 物琥珀酸钠，脱下氢，以无色的硝基四唑物琥珀酸钠，脱下氢，以无色的硝基四唑 盐为受氢体，后

10、者获氢后被还原为不溶于盐为受氢体，后者获氢后被还原为不溶于 水的有色甲潜，原位沉积于酶活性部位水的有色甲潜，原位沉积于酶活性部位。 18 试剂配制试剂配制 0.2M0.2M磷酸缓冲液磷酸缓冲液pH7.6 5mlpH7.6 5ml 1 1A A液液 0.2M0.2M琥珀酸钠琥珀酸钠 5ml5ml B B液液 0.1%0.1%（1mg/ml1mg/ml）硝基四唑盐）硝基四唑盐 （Nitro-BTNitro-BT） 10ml10ml 临用前将两液等量混合，调整临用前将两液等量混合，调整pHpH至至7.67.6。 19 操作步骤：操作步骤： 1. 1. 新鲜组织恒冷切片，切片直接入孵育新鲜组织恒冷切片，切片直接入孵育 液液3737。 。C 5-40 C 5-40分钟。分钟。 2. 2. 蒸馏水洗。蒸馏水洗。 3. 3. 甘油明胶封固。甘油明胶封固。 20 琥珀酸脱氢酶琥珀酸脱氢酶 结果：结果： 酶活性部位为紫蓝色颗粒沉淀。酶活性部位为紫蓝色颗粒沉淀。 21 对照对照 另配一孵育液，以等量的蒸馏水代另配一孵育液，以等量的蒸馏水代 替替0.2M0.2M琥珀酸钠液，酶活性部位呈阴性。琥珀酸钠液，酶活性部位呈阴性。 22 注意事项：注意事项： 1. 1. 取材要迅速，立即低温冷冻，否则容取材要迅速，立即低温