细胞生物反应器制药

1、1 转基因动物是指通过实验方法，人工地把人们想 要研究的动物或人类基因，或者是有经济价值的 药物蛋白质基因等，通常称为外源基因，导入动 物的受精卵（或早期胚胎细胞），使之与动物本 身的基因组整合在一起，这样外源基因能随细胞 的分裂而增殖，并能稳定地遗传给下一代的一类 动物。 外源目的基因的制备外源目的基因的制备 外源目的基因有效导入生殖细胞或胚胎干细胞外源目的基因有效导入生殖细胞或胚胎干细胞 选择获得携有目的基因的细胞选择获得携有目的基因的细胞 选择合适的体外培养系统和宿主动物选择合适的体外培养系统和宿主动物 转基因细胞胚胎发育及鉴定转基因细胞胚胎发育及鉴定 筛选所得的转基因动物品系筛选所得的

2、转基因动物品系 以绿色荧光蛋白转基因小鼠为例：以绿色荧光蛋白转基因小鼠为例：Gene constructGene construct pEGFP- N1 载体是一种把异源性的蛋白质融合至EGFP 的N端的哺乳动物表 达载体，含有人类巨细胞病毒（CMV）启动子，SV40 Poly A 尾，pUC 复 制起始点（原核）和SV40 复制起始点（真核），20 个多克隆位点，具有 筛选标志卡那霉素（原核）和新霉素（真核）的抗性基因。异源性蛋白与E GFP 阅读框一致地克隆入pEGFP-N1，形成的表达重组体在CMV 启动子启 动下，表达EGFP 和目标蛋白的融合蛋白。波长490 nm的紫外线激发后，可

3、在荧光显微镜下,观察到绿色荧光，在多种异源生物中表达且无细胞毒性。 microinjection 受精卵准备受精卵准备 胚胎操作过程胚胎操作过程 显微注射显微注射 假孕母鼠准备假孕母鼠准备( (养母养母) ) 胚胎移植胚胎移植 Biopsy PCR analysis Southern blot (9.5 dpc) GFP+, GFP- embryos GFP+ tail GFP-, GFP+ mice 第一阶段：方法的建立第一阶段：方法的建立 第二阶段：转基因小鼠模型及第二阶段：转基因小鼠模型及快速生长家畜快速生长家畜 半乳糖转移酶半乳糖转移酶 第三阶段：第三阶段：异种器官移植异种器官移植 (

4、pig)(pig)和乳腺反应器和乳腺反应器 2021-7-1212 2021-7-1213 1.1.可靠性高、重复性好可靠性高、重复性好 2.2.对于小鼠来说，产生转基因动物的效率比较高对于小鼠来说，产生转基因动物的效率比较高 3.3.导入导入DNADNA片段的大小和类型不受限制片段的大小和类型不受限制 4.4.转基因在代与代之间传递的稳定性好转基因在代与代之间传递的稳定性好 5.5.整合位点的随意性可能对转基因表达造成影响整合位点的随意性可能对转基因表达造成影响 6.6.可能会出现不希望的插入突变可能会出现不希望的插入突变 7.7.开发装置和技术的花费大时间长开发装置和技术的花费大时间长 2

5、021-7-1214 显微注射法获得转基因鼠的成活率显微注射法获得转基因鼠的成活率 2021-7-1215 利用脉冲电场提高细利用脉冲电场提高细 胞膜的通透性，从而胞膜的通透性，从而 使外源使外源DNADNA转移至细转移至细 胞中。此法简单、效胞中。此法简单、效 率较高，广泛应用于率较高，广泛应用于 培养细胞的基因转移。培养细胞的基因转移。 电穿孔法实现外源基因的转移电穿孔法实现外源基因的转移 转录启动子 2021-7-1217 缺点：缺点： 1.1. 低拷贝数低拷贝数 2.2. 需要逆转录病毒需要逆转录病毒 3.3. 插入插入DNADNA大小有限大小有限 4.4. 可能产生不希望的重组可能产

6、生不希望的重组 5.5. 高频的镶嵌现象高频的镶嵌现象 6.6. 逆转录病毒的序列可能干扰转基因表达逆转录病毒的序列可能干扰转基因表达 2021-7-1221 酵母人工染色体酵母人工染色体()载体是近年发展起来的新载体是近年发展起来的新 型载体型载体, , 它能克隆百万对碱基的大片段它能克隆百万对碱基的大片段DNADNA。 作为制作转基因动物载体具有以下作为制作转基因动物载体具有以下 一般把目的片段在器官或组织中表达的转基因动物一般把目的片段在器官或组织中表达的转基因动物 叫动物生物反应器叫动物生物反应器（bioreactor），），几乎任何有生命几乎任何有生命 的器官、组织或其中一部分都可经

7、过人为驯化为生物的器官、组织或其中一部分都可经过人为驯化为生物 反应器反应器, ,从生产的角度考虑，生物反应器选择的组织从生产的角度考虑，生物反应器选择的组织 和器官要方便产物的获得，例如，乳腺、膀胱、血液和器官要方便产物的获得，例如，乳腺、膀胱、血液 等，由此发展了动物乳腺生物反应器等，由此发展了动物乳腺生物反应器, ,动物血液生物动物血液生物 反应器和动物膀胱生物反应器等。其中，转基因动物反应器和动物膀胱生物反应器等。其中，转基因动物 乳腺生物反应器的研究最为引人注目。乳腺生物反应器的研究最为引人注目。 GenPharmGenPharm公司用转公司用转 基因牛基因牛 治疗肺气肿病）治疗肺气

8、肿病） 1999 1999年，只有三种产品进入临床实验；到年，只有三种产品进入临床实验；到20092009年，年， 已经有已经有7070多种进入临床实验或即将进入市场。多种进入临床实验或即将进入市场。 2021-7-1227 应用重组DNA 技 术和转基因技术,先 将外源基因置于乳腺 特异性调控序列之下, 再将该基因转移到尚 处于原核阶段或12 细胞的受精卵的动物 胚胎中,经胚胎移植 得到转基因乳腺表达 的动物个体,通过回 收乳汁获得表达产物。 动物乳腺生物反应器动物乳腺生物反应器 表达载体的构建表达载体的构建 制备乳腺生物反应器的关键是保证目的蛋白制备乳腺生物反应器的关键是保证目的蛋白 特异

9、性在乳腺中的高效表达，特异性在乳腺中的高效表达， 传传 统表达载体都是选用某种统表达载体都是选用某种乳蛋白基因的调控序列作乳蛋白基因的调控序列作 为启动子元件为启动子元件。这些基因的调控区主要包括。这些基因的调控区主要包括启动子启动子 区区、增强子序列增强子序列和其他众多转录、翻译相关元件。和其他众多转录、翻译相关元件。 2021-7-1229 目前已克隆并用作构建载体的乳蛋白基因有：目前已克隆并用作构建载体的乳蛋白基因有： -乳球蛋白乳球蛋白(BLG)(BLG)基因、基因、SlSl- -酪蛋白基因、酪蛋白基因、- 酪蛋白基因、乳清酸蛋白酪蛋白基因、乳清酸蛋白(WAP)(WAP)及乳清白蛋白基

10、因。及乳清白蛋白基因。 牛的牛的-乳球蛋白（乳球蛋白（BLGBLG）基）基 因，该基因非常稳定，并能在乳腺中特异性表达因，该基因非常稳定，并能在乳腺中特异性表达 乳清酸蛋白乳清酸蛋白 2006年6月2日上市。治疗 先天性抗凝血酶缺失症病，我国2008年11月首 次用乳腺生物反应器获得抗凝血酶蛋白纯品 -乳球蛋白乳球蛋白 （ 人体器官的最佳替补人体器官的最佳替补 无论体积大小，还无论体积大小，还 是外观形状，甚至结构是外观形状，甚至结构 功能，与人体器官最相功能，与人体器官最相 似的应属猪的器官。因似的应属猪的器官。因 此，猪被视为异体器官此，猪被视为异体器官 移植的理想移植的理想“替补替补”。

11、 移植难题移植难题 猪体内存在两个猪体内存在两个-1-1，3 3半乳糖转移酶半乳糖转移酶(GT)(GT) 基因基因) )，“GT”GT”基因控制半乳糖基转移酶的产生，基因控制半乳糖基转移酶的产生， 这种酶使猪细胞表面形成一种标记性的多糖。当这种酶使猪细胞表面形成一种标记性的多糖。当 猪器官或细胞被移植给人体时，人类免疫系统能猪器官或细胞被移植给人体时，人类免疫系统能 识别这种糖，从而产生强烈的排异反应，把移植识别这种糖，从而产生强烈的排异反应，把移植 的器官或细胞视作外来异物进行攻击。使器官在的器官或细胞视作外来异物进行攻击。使器官在 数小时之内死亡。数小时之内死亡。 解决方案解决方案 目前，

12、科学家已经敲除了转基因克隆猪体内的一目前，科学家已经敲除了转基因克隆猪体内的一 个个“GT”GT”基因，另一个基因，另一个“GT”GT”基因尚有待攻克。基因尚有待攻克。 Lai et al 2002, Science. (GT out pig) 下一步研究方向下一步研究方向 1. 1. 将培养出的小猪两两配对，由此进一步繁殖将培养出的小猪两两配对，由此进一步繁殖 出体内两个出体内两个“GT”GT”基因均无功能的小猪。基因均无功能的小猪。 2. 2. 从两个从两个“GT”GT”基因均无功能的猪身上取下各基因均无功能的猪身上取下各 种器官，移植到人类以外的灵长目动物身上。种器官，移植到人类以外的灵

13、长目动物身上。 3. 3. 动物试验若能成功，人体临床实验将有望启动物试验若能成功，人体临床实验将有望启 动。动。 2021-7-1245 2021-7-1246 显微注射法获得转基因鼠的成活率显微注射法获得转基因鼠的成活率 2021-7-1247 表达载体的构建表达载体的构建 制备乳腺生物反应器的关键是保证目的蛋白制备乳腺生物反应器的关键是保证目的蛋白 特异性在乳腺中的高效表达，特异性在乳腺中的高效表达， 传传 统表达载体都是选用某种统表达载体都是选用某种乳蛋白基因的调控序列作乳蛋白基因的调控序列作 为启动子元件为启动子元件。这些基因的调控区主要包括。这些基因的调控区主要包括启动子启动子 区区、增强子序列增强子序列和其