食品发酵菌种的选育与保藏

1、食品发酵与酿造技术食品发酵与酿造技术 菌种选育与保藏 l课时安排：4课时 l教学目标：了解发酵工业中常用的菌种。 掌握菌种选育方法。 掌握划线培养和涂布培养方法。 掌握菌种保藏方法。 教学重点： 菌种选育方法。 菌种保藏方法。 教学难点：菌种选育方法。 授课方式：多媒体教学、讲授法 发酵工业发酵工业常用微生物及要求常用微生物及要求 一、常见微生物一、常见微生物 （一）细菌（一）细菌（bacteriabacteria） 醋杆菌属（醋杆菌属（AcetobacterAcetobacter） 乳杆菌属（乳杆菌属（LactobacillusLactobacillus） 芽孢杆菌属（芽孢杆菌属（Bacil

2、lusBacillus） 短杆菌属（短杆菌属（BrevibacteriumBrevibacterium） 棒杆菌属（棒杆菌属（CorynebacteriumCorynebacterium） （二）放线菌（二）放线菌（actinomycesactinomyces） 最大的经济价值在于产生多种抗生素最大的经济价值在于产生多种抗生素 （antibioticantibiotic） 链霉菌（链霉菌（StreptomycesStreptomyces） 小单孢菌属（小单孢菌属（MicromonosporaMicromonospora） （三）霉菌（三）霉菌（mouldmould） 1.1.曲霉属（曲霉属（A

3、spergillusAspergillus） 黑曲霉（黑曲霉（A. nigerA. niger） 米曲霉（米曲霉（A. oryzaeA. oryzae） 黄曲霉（黄曲霉（A. flavusA. flavus） 2.2.青霉属（青霉属（PenicillumPenicillum） 桔青霉（桔青霉（P. citrinumP. citrinum） 产生产生5 5磷酸二酯酶，降解核糖核酸为四个单核苷酸。磷酸二酯酶，降解核糖核酸为四个单核苷酸。 3. 3. 根霉属（根霉属（RhizopusRhizopus ） 米根霉（米根霉（R. oryzaeR. oryzae） 华根霉（华根霉（R. chinensis

4、R. chinensis） 4. 4. 红曲霉属（红曲霉属（MonascusMonascus） （四）酵母（四）酵母（yeastyeast） 1.1.酵母属（酵母属（SaccharomycesSaccharomyces） 啤酒酵母（啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae） 2. 2. 假丝酵母属（假丝酵母属（CandidaCandida） 产朊假丝酵母（产朊假丝酵母（Candida utilisCandida utilis） 3. 3. 毕赤酵母属（毕赤酵母属（PichiaPichia） （五）其它微生物（五）其它微生物 1.

5、1.担子菌（担子菌（basidiomycetesbasidiomycetes）即菇类）即菇类 （mushroommushroom） 2. 2. 藻类（藻类（algaalga） 几几 种种 菌菌 落落 （六）噬菌体（六）噬菌体（phagephage） 危害以细菌和放线菌危害以细菌和放线菌 为生产菌株的发酵工业。为生产菌株的发酵工业。 烈性噬菌体烈性噬菌体 引起寄主细胞迅速裂解。引起寄主细胞迅速裂解。 受感染的细菌称受感染的细菌称敏感性细菌敏感性细菌。 温和噬菌体温和噬菌体 随寄主细胞的繁殖而繁殖。随寄主细胞的繁殖而繁殖。 含温和噬菌体的细菌称含温和噬菌体的细菌称溶原性细菌溶原性细菌。 二、微生物

6、工业对菌种的要求二、微生物工业对菌种的要求 1.1.原料廉价，生长迅速，目的产物产量高。原料廉价，生长迅速，目的产物产量高。 2.2.易控制培养条件，发酵周期较短。易控制培养条件，发酵周期较短。 3.3.抗杂菌和噬菌体的能力强。抗杂菌和噬菌体的能力强。 4.4.不易变异和退化，不产生任何有害物质和不易变异和退化，不产生任何有害物质和 毒素。毒素。 第二节第二节 工业微生物菌种的选育工业微生物菌种的选育 一、自然选育一、自然选育 1.1.采样采样 2.2.增殖培养增殖培养 方法：方法： （1 1）控制培养基成分）控制培养基成分 （2 2）控制培养条件）控制培养条件 （3 3）抑制不需要的菌类）抑

7、制不需要的菌类 3. 3. 纯种分离纯种分离 （1 1）划线法：简单、快捷。）划线法：简单、快捷。 （2 2）稀释法：菌落单一均匀。）稀释法：菌落单一均匀。 生产菌种斜面生产菌种斜面 制备单孢子悬浮液制备单孢子悬浮液 分离出单菌落分离出单菌落 1.2自然选育流程图自然选育流程图 为何进行复筛？为何进行复筛？ 生产菌种斜面生产菌种斜面 制备单孢子悬浮液制备单孢子悬浮液 分离出单菌落分离出单菌落 移种 进一步选育或保藏进一步选育或保藏 斜面种子斜面种子(初筛初筛) 高产菌株高产菌株 沙土管菌株沙土管菌株 斜面种子斜面种子 摇瓶复筛摇瓶复筛 高产纯化株高产纯化株 生产试验生产试验生产菌种斜面生产菌种

8、斜面 制备单孢子悬浮液制备单孢子悬浮液 分离出单菌落分离出单菌落 自然选育是一种 纯种选育的方法 接种针先以火焰灭菌法灭菌接种针先以火焰灭菌法灭菌 步骤一步骤一 固体培养基四区划法接种法固体培养基四区划法接种法 轻触营养平板上无菌的琼脂处冷却轻触营养平板上无菌的琼脂处冷却 步骤二步骤二 以接种针轻触菌落，使接种针上沾有细菌。以接种针轻触菌落，使接种针上沾有细菌。 步骤三步骤三 更换一个新的无菌营养平板更换一个新的无菌营养平板 步骤四步骤四 将接种针上的细菌划于一个新的营养平板将接种针上的细菌划于一个新的营养平板 上。此为第一菌区上。此为第一菌区 。 重复第一步骤，将接种针以火焰灭菌法重复第一步

9、骤，将接种针以火焰灭菌法 灭菌，然后轻触琼脂无菌处冷却。灭菌，然后轻触琼脂无菌处冷却。 步骤六步骤六 由第五步骤的第一区中划出第二由第五步骤的第一区中划出第二 区，如右上图。区，如右上图。 步骤七步骤七 重复第六以及第七步骤，由第七步骤的重复第六以及第七步骤，由第七步骤的 第二区中划出第三区，如右上图。第二区中划出第三区，如右上图。 步骤八步骤八 重复第六以及第七步骤，由第八步骤的第三重复第六以及第七步骤，由第八步骤的第三 区中划出第四区，划满剩下的空间。完成后区中划出第四区，划满剩下的空间。完成后 的营养平板，如右上图。的营养平板，如右上图。 步骤九步骤九 在营养平板上贴好标在营养平板上贴好

10、标 签，标示好接种日期、操签，标示好接种日期、操 作者姓名、菌种学名以及作者姓名、菌种学名以及 培养基名称。培养基名称。 步骤十步骤十 需要使用的仪器需要使用的仪器震荡机震荡机 固体培养基的稀释涂抹接种法固体培养基的稀释涂抹接种法 吸取准备好欲稀释的菌液吸取准备好欲稀释的菌液 吸取充分均匀后的菌液吸取充分均匀后的菌液 取含有取含有 9mL9mL无菌水之试管，将试管口过火灭菌。无菌水之试管，将试管口过火灭菌。 将菌液置入，此时试管须做记号为第一次稀释。将菌液置入，此时试管须做记号为第一次稀释。 将试管于震荡机上，使菌液混合均匀将试管于震荡机上，使菌液混合均匀 取出试管中的第一次十倍稀释菌液取出试

11、管中的第一次十倍稀释菌液1mL1mL， 加入另一个新的含加入另一个新的含9mL9mL无菌水的试管中。无菌水的试管中。 重复此步骤直至所需要的稀释浓度。重复此步骤直至所需要的稀释浓度。 从最后稀释菌液中吸取从最后稀释菌液中吸取 0.1mL0.1mL菌液，菌液， 置入准备好的无菌琼脂内。置入准备好的无菌琼脂内。 将三角玻璃棒浸于酒精中将三角玻璃棒浸于酒精中 将三角玻璃棒在火焰上燃烧将三角玻璃棒在火焰上燃烧 （须注意勿使燃烧中的酒精滴入酒精瓶中，引起燃烧）（须注意勿使燃烧中的酒精滴入酒精瓶中，引起燃烧） 使用玻璃棒将菌液均匀涂布开来，将培养皿置使用玻璃棒将菌液均匀涂布开来，将培养皿置 于恒温培养箱中

12、隔天观察菌落数目，再依照稀释倍于恒温培养箱中隔天观察菌落数目，再依照稀释倍 数推算出菌液浓度。数推算出菌液浓度。 4. 4. 生产性能的测定生产性能的测定 一般采用两步法：一般采用两步法： 初筛：以量为主初筛：以量为主 复筛：以质为主复筛：以质为主 二、诱变育种二、诱变育种 用各种物理、化学的因素人工诱发基因用各种物理、化学的因素人工诱发基因 突变。突变。 诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质。诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质。 诱变剂诱变剂 物理：紫外线，快中子物理：紫外线，快中子 化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍 诱变育种的主要环节诱变育种的主要环节 （1 1）以合

13、适的诱变剂处理细胞悬浮液）以合适的诱变剂处理细胞悬浮液 诱变诱变 （2 2）用合适的方法淘汰负效应变异株，）用合适的方法淘汰负效应变异株， 选出性能优良的正变异株选出性能优良的正变异株筛选筛选 2.3.1 诱变剂的种类诱变剂的种类 物理诱变剂 射线如紫外线、X-射线、-射线，快中子 化学诱变剂 碱基类似物、5-氟尿嘧啶、烷化剂、亚硝基胍和甲 基磺酸乙酯等。 化学诱变剂，比物理诱变剂电离辐射有效，而且 很经济，但大部分诱变剂是致癌剂，危害性大。 碱基类似物、吖啶类、烷化剂 特点：高效、经济、但应注意使用安全 2.3.2 诱变处理的基本方法 A.诱变剂的选择 不稳定菌株温和诱变剂不稳定菌株温和诱变

14、剂 稳定菌株强烈的、广谱的诱变剂稳定菌株强烈的、广谱的诱变剂 低剂量诱变剂有利于高产菌株的稳定性低剂量诱变剂有利于高产菌株的稳定性 B.B.诱变剂剂量的选择 剂量的表示方法：常用杀菌率表示诱变剂的剂量。 杀菌率 =（ mn）/m 100 m：未被处理菌体长出的菌落数 n：被处理菌体长出的菌落数 C.增效（变）剂 有一些因素本身并不是诱变剂，但它们与诱变剂配 合使用起到协同作用。 D、影响诱变效果的因素 外部环境条件对诱变效果的影响，如温度、氧气、PH、 水分等 出发菌株的选择对提高诱变效果具有重要作用。 选择合适的诱变因素剂量也是提高诱变效果的重要条 件。 出发菌株的生理状态也影响诱变效率。

15、诱变效应的测定，可分为直接法和浓缩法两种。 诱变方法 优良突变菌株的筛选 直接摇瓶筛选法和琼脂柱预筛选法 突变株的筛选（Selection） I.随机筛选 (Random selection) 1)摇瓶筛选法 初筛一般是一个菌株只初筛一般是一个菌株只 做一个摇瓶，从大量菌做一个摇瓶，从大量菌 株中选出株中选出10-20%10-20%较好的较好的 菌株，淘汰菌株，淘汰80-90%80-90%的菌的菌 株；而复筛中摇瓶培养株；而复筛中摇瓶培养 一般是一个菌株培养一般是一个菌株培养3 3瓶，瓶， 并要重复并要重复3-53-5次，选出次，选出3-3- 5 5个较好的菌株，再做进个较好的菌株，再做进 一

16、步比较，选出最佳的一步比较，选出最佳的 菌株。菌株。 复杂、耗时 2)琼脂块筛选法 简单、快速，但不准确 3) 自动化筛选（筛选几千个菌落数/天） 3 3 杂交育种杂交育种 （二）杂交育种的程序（二）杂交育种的程序 1 1、菌种准备：使用两种菌株，原始亲本和直接亲本菌株。、菌种准备：使用两种菌株，原始亲本和直接亲本菌株。 方法方法1 1：抗生素富集法：抗生素富集法 方法方法2 2：过滤法：过滤法 方法方法1.1.逐个检出法：逐个检出法： 方法方法2.2.影印法：具体操作误差较大。影印法：具体操作误差较大。 方法方法3.3.夹层法：先长出的菌落在底部作出标记，加夹层法：先长出的菌落在底部作出标记

17、，加 入入CMCM培养基后长出的菌落为营养缺陷型，可用打培养基后长出的菌落为营养缺陷型，可用打 孔器取出。孔器取出。 3.3 杂交育种使用的培养基杂交育种使用的培养基 完全培养基：一种含有糖类、多种氨基酸、 维生素及核酸碱基等比较完全的营养基质。 基本培养基：只含有纯的碳源、无机氮和无 机盐类，不含有氨基酸、维生素、核苷酸等 有机营养物。 有限培养基：在基本培养基或蒸馏水中含有 10%20%完全培养基成分。 补充培养基：在基本培养基中加入已知成分 的氨基酸、维生素、核苷酸等 生产生产菌种的改良菌种的改良 一、原生质体融合（一、原生质体融合（protoplast fusionprotoplast

18、 fusion） 1.1.标记菌株的筛选标记菌株的筛选 2.2.原生质体的制备原生质体的制备 3.3.原生质体的融合与再生原生质体的融合与再生 聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG）脱水剂）脱水剂 助融剂助融剂 CaCa2+ 2+提高融合频率 提高融合频率 4.4.融合子的选择融合子的选择 3） 3. 3. 原生质体形成率的计算原生质体形成率的计算 4. 4. 原生质体的融合原生质体的融合 在融合剂在融合剂PEGPEG和和CaCa2+ 2+作用下发生融合。或脉冲点 作用下发生融合。或脉冲点 击进行电融合。击进行电融合。 二、二、DNADNA重组技术重组技术 （DNA recombination t

19、echnologyDNA recombination technology） 1.1.目标目标DNADNA片断的获得片断的获得 2.2.与载体与载体DNADNA分子的连接分子的连接 3.3.重组重组DNADNA分子引入宿主细胞分子引入宿主细胞 4.4.从中选出所需重组从中选出所需重组DNADNA分子的宿主细胞分子的宿主细胞 菌种保藏 （一）保藏目的及原理 目的 原理 创造不利于菌种生长的一切条件， 使其代谢处于休眠状态。 使菌种 不生长不死亡不污染 不降低或不丧失其优良性 以尽量延长使用时间 低温 干燥 无氧 缺营养 不利 条件 （二）常用保藏法 1.斜面低温保藏法 将菌种转接在适宜固体斜面培

20、养基上，待其充 分生长后，用牛皮纸将棉塞部分包扎好（棉塞换成 胶塞效果更好），置4C冰箱中包藏。 保藏时间依微生物的种类而定。霉菌、放线菌 及芽孢菌保存24个月移种一次，酵母菌间隔两个 月，普通细菌一个月，假单胞菌两周传代一次。 此法优点是操作简单、使用方便，缺点是保藏 时间短、易被污染。 将无菌石蜡（最好的矿物油灭菌方法是以烤箱在170 下加热1-2h，而非以灭菌锅灭菌）加在已长好菌的斜面上， 其用量以高出斜面顶端1cm为准，使菌种与空气隔绝。 将试管直立，置低温或室温下保存。 此法实用而效果好。霉菌、放线菌、芽孢细菌可保藏2 年以上不死，酵母菌可保藏1-2年，一般无芽孢细菌也可保 藏1年左右，甚至用一般方法很难保藏的脑膜炎球菌，在 37温箱内，亦可保藏3个月之久。 此法的优点是制作简单，不需特殊设备，且不需经常移 种。缺点是保存时必须直立放置，所占位置较大，同时也不 便携带。 2、液体石蜡保藏法 3. 沙土管保藏法沙土管保藏法 沙土管保藏法是载体保藏法的一种。将培养 好的微生物细胞或孢子用无菌水制成悬浮液,注入 灭菌的沙土管中混合均匀，或直接将成熟孢子刮 下接种于灭菌的沙土管中，使微生物细胞或孢子 吸附在沙土载体上，将管中水分抽干后熔封管口 或置干燥器中于4-6或室温进