基因治疗概论课件

1、 第六章 基因治疗概论 1基因治疗概论 随着近代医学的发展随着近代医学的发展,分子生物学的研究和应用已经逐渐进入分子生物学的研究和应用已经逐渐进入 临床领域临床领域.基因治疗是基因治疗是90年代出现的一种新的治疗技术年代出现的一种新的治疗技术,为现代治为现代治 疗学开辟了一条新途径疗学开辟了一条新途径.自自1990年对一位腺苷脱胺酶缺乏年对一位腺苷脱胺酶缺乏 (Adensine deaminase deficiency)引起严重免疫功能低下的患者引起严重免疫功能低下的患者,应应 用基因治疗获得成功以后用基因治疗获得成功以后,又有又有3种疾病取得良好的结果种疾病取得良好的结果:家族性高家族性高

2、胆固醇血症胆固醇血症 (Familial hypercholesterolemia)和高雪氏病和高雪氏病(Gaucher disease)及囊性纤维化及囊性纤维化(Cystic fibrosis).目前认为目前认为,基因治疗是治疗基因治疗是治疗 基因突变性疾病的一项根本措施基因突变性疾病的一项根本措施,同时它也是为非基因突变性疾同时它也是为非基因突变性疾 病提供了一个新的治疗手段病提供了一个新的治疗手段. 一基因治疗的意义一基因治疗的意义 从广义而言从广义而言,基因治疗是应用基因或基因产物基因治疗是应用基因或基因产物,治疗疾病的一种治疗疾病的一种 方法方法.从狭义而言从狭义而言,基因治疗是将外

3、界的正常基因或治疗基因基因治疗是将外界的正常基因或治疗基因,通过通过 载体转移到人体的靶细胞载体转移到人体的靶细胞,进行基因修饰和表达进行基因修饰和表达,改善疾病的一种改善疾病的一种 治疗手段治疗手段. 2基因治疗概论 癌基因癌基因 癌基因是指细胞中发生变异的一类基因，这些基因在细胞中行使癌基因是指细胞中发生变异的一类基因，这些基因在细胞中行使 正常的生物学功能，是机体生长和发育不可缺少的。这些基因所编码正常的生物学功能，是机体生长和发育不可缺少的。这些基因所编码 的蛋白质都存在与细胞的各个部分中。研究表明，肿瘤是多种基因突的蛋白质都存在与细胞的各个部分中。研究表明，肿瘤是多种基因突 变累积的

4、结果，基因突变主要发生在：癌基因、抑癌基因和变累积的结果，基因突变主要发生在：癌基因、抑癌基因和DNA修复修复 基因。基因。 其中绝大多数肿瘤的基因变异都是体细胞突变，包括点突变、扩增、其中绝大多数肿瘤的基因变异都是体细胞突变，包括点突变、扩增、 重排、缺失或甲基化状态的改变，在肿瘤的发生、发展过程中起促进重排、缺失或甲基化状态的改变，在肿瘤的发生、发展过程中起促进 作用。作用。 1982年人类从年人类从Harvey和和Kirsten肉瘤病毒中分离到第一个癌基因肉瘤病毒中分离到第一个癌基因Ras。 随后证明随后证明Ras蛋白是一个蛋白是一个G蛋白，具有蛋白，具有GTP酶活性，参与细胞的信号酶活

5、性，参与细胞的信号 传导。在人类一些肿瘤中点突变导致传导。在人类一些肿瘤中点突变导致Ras蛋白蛋白GTP酶活性下降。同年，酶活性下降。同年， 在在Burkitts淋巴瘤中发现淋巴瘤中发现Myc基因。进一步研究表明突变的基因。进一步研究表明突变的Ras基因和基因和 Myc基因联合转染细胞可诱导细胞发生恶性转化。基因联合转染细胞可诱导细胞发生恶性转化。 3基因治疗概论 人类又发现另一类基因可抑制肿瘤细胞的恶性增殖即抑癌基因。人类又发现另一类基因可抑制肿瘤细胞的恶性增殖即抑癌基因。 1987年年Dryja克隆到第一个抑癌基因克隆到第一个抑癌基因Rb，该基因编码一种未知功，该基因编码一种未知功 能的蛋

6、白，该蛋白失活则导致肿瘤发生。能的蛋白，该蛋白失活则导致肿瘤发生。1989年人类发现抑癌年人类发现抑癌 基因基因P53。肿瘤的基本特征是细胞的失控性生长，包括细胞的死。肿瘤的基本特征是细胞的失控性生长，包括细胞的死 亡（调王）的减少或增殖的增加，即细胞的区分化等多个细胞亡（调王）的减少或增殖的增加，即细胞的区分化等多个细胞 生命活动。众多的癌基因和抑癌基因改变与上述细胞的生命活生命活动。众多的癌基因和抑癌基因改变与上述细胞的生命活 动异常最终都汇集到细胞周期的调控上来。因此肿瘤又被认为动异常最终都汇集到细胞周期的调控上来。因此肿瘤又被认为 是细胞周期异常性疾病。是细胞周期异常性疾病。20世纪世

7、纪90年代，人们发现了许多与疾年代，人们发现了许多与疾 病相关的基因，细胞周期调控因子，凋亡相关基因，血管生长病相关的基因，细胞周期调控因子，凋亡相关基因，血管生长 因子和受体，端粒酶等都是具有重要生物学功能的基因，它们因子和受体，端粒酶等都是具有重要生物学功能的基因，它们 都参与细胞的增殖与分化的调控及维持正常生命活动，并进一都参与细胞的增殖与分化的调控及维持正常生命活动，并进一 步明确这些基因的异常改变与肿瘤的发生发展密切相关。肿瘤步明确这些基因的异常改变与肿瘤的发生发展密切相关。肿瘤 的研究已进入基因组学和蛋白组学时代，即分离和鉴定癌细胞的研究已进入基因组学和蛋白组学时代，即分离和鉴定癌

8、细胞 中的所有表达的蛋白质和特异性的标志蛋白。中的所有表达的蛋白质和特异性的标志蛋白。 4基因治疗概论 癌基因的分類癌基因的分類 根据基因产物资细胞内的定位和生物学功能根据基因产物资细胞内的定位和生物学功能 可将其分为：可将其分为： 生长因子（生长因子（Hst，扩增，扩增-胃癌）胃癌） 生长因子受体（生长因子受体（Neu-EerbB2，扩增，扩增乳腺癌、卵巢癌等）乳腺癌、卵巢癌等） 信号传导分子（信号传导分子（K-Ras，点突变，点突变-胰腺癌、肺癌、结肠癌）胰腺癌、肺癌、结肠癌） 转录因子（转录因子（Myc，易位、扩增，易位、扩增-淋巴瘤等）淋巴瘤等） 细胞凋亡基因（细胞凋亡基因（Bcl-2

9、，染色体易位，染色体易位-B细胞淋巴瘤）细胞淋巴瘤） 细胞周期蛋白（细胞周期蛋白（CYCD1，扩增、易位，扩增、易位-乳腺癌、淋巴瘤等）乳腺癌、淋巴瘤等） 等几大类。等几大类。 这些原癌基因是细胞中的固有基因，正常情况下参与细胞这些原癌基因是细胞中的固有基因，正常情况下参与细胞 增殖与分化的调控，只有当基因的结构和功能发生变异并增殖与分化的调控，只有当基因的结构和功能发生变异并 具有使细胞发生恶性转化的作用，此时的基因称为癌基因。具有使细胞发生恶性转化的作用，此时的基因称为癌基因。 癌基因蛋白组成细胞内庞大的信号网络，控制细胞的生长、癌基因蛋白组成细胞内庞大的信号网络，控制细胞的生长、 分化、

10、凋亡、分化、凋亡、DNA损伤修复、基因转录、表达调控等。损伤修复、基因转录、表达调控等。 5基因治疗概论 基因变异方式与原癌基因活化基因变异方式与原癌基因活化 细胞中活化的原癌基因细胞中活化的原癌基因 被称为癌基因。进一步明确原癌基因在物理、化学即生物的被称为癌基因。进一步明确原癌基因在物理、化学即生物的 致癌因素作用下发生改变。原癌基因活化的方式为：点突变、致癌因素作用下发生改变。原癌基因活化的方式为：点突变、 染色体易位或基因扩增等。实验结果表明，基因变异与肿瘤染色体易位或基因扩增等。实验结果表明，基因变异与肿瘤 的某些生物学特性相关，有待进一步研究。的某些生物学特性相关，有待进一步研究。

11、 （1）点突变与癌基因）点突变与癌基因 点突变是导致癌基因活化的主要方式。点突变是导致癌基因活化的主要方式。 人们针对基因的点突变在多聚酶链式反应（人们针对基因的点突变在多聚酶链式反应（PCR）等技术对）等技术对 Ras、Met、p53、Men等多种癌基因和抑癌基因进行了大量等多种癌基因和抑癌基因进行了大量 病例分析，明确了这些基因的点突变是基因变异的重要方式病例分析，明确了这些基因的点突变是基因变异的重要方式 并与细胞的癌变有关。但是，基因点突变与基因功能改变的并与细胞的癌变有关。但是，基因点突变与基因功能改变的 关系等有待进一步研究。关系等有待进一步研究。 6基因治疗概论 (2) DNA扩

12、增与癌基因扩增与癌基因 基因扩增是癌基因活化的另基因扩增是癌基因活化的另 一个主要形式一个主要形式,细胞内一些基因通过不明原因复制成细胞内一些基因通过不明原因复制成 多拷贝多拷贝,这些多拷贝的这些多拷贝的DNA以游离形式存在称双微体以游离形式存在称双微体 (DMS)获再次整合入人染色体形成均染区获再次整合入人染色体形成均染区(HSR),它表它表 示高度的染色体结构破坏与不稳定性。基因扩增和示高度的染色体结构破坏与不稳定性。基因扩增和 过量表达其结果均可影响细胞的正常生理功能。双过量表达其结果均可影响细胞的正常生理功能。双 微体微体(DMS)和均染区和均染区(HSR)包含数十万碱基对，扩增包含数

13、十万碱基对，扩增 量由二十至数百倍，量由二十至数百倍，DNA扩增区内一个或多个靶基扩增区内一个或多个靶基 因拷贝数和基因表达量因此而增加，这种肿瘤细胞因拷贝数和基因表达量因此而增加，这种肿瘤细胞 受生物选择的影响而将扩增的受生物选择的影响而将扩增的DNA序列维持下来。序列维持下来。 因此一些肿瘤细胞因此一些肿瘤细胞DNA的扩增区内可能含有数个的扩增区内可能含有数个 细胞癌基因。细胞癌基因。 7基因治疗概论 （3）染色体重排与癌基因）染色体重排与癌基因 研究表明，在各种肿瘤都有染色体结构异常，研究表明，在各种肿瘤都有染色体结构异常， 这种多种肿瘤或细胞系都有的特定染色体改变称为表标志染色体。如淋

14、这种多种肿瘤或细胞系都有的特定染色体改变称为表标志染色体。如淋 巴瘤中染色体第巴瘤中染色体第8号和第号和第14号易位、慢性粒细胞白血病中染色体第号易位、慢性粒细胞白血病中染色体第9号和号和 第第22号易位等。近号易位等。近10年来，通过实体瘤中特殊染色体异常提供的线索已年来，通过实体瘤中特殊染色体异常提供的线索已 鉴定出一些新基因，今后会有更多新基因被识别出来。鉴定出一些新基因，今后会有更多新基因被识别出来。 （4）癌基因甲基化改变）癌基因甲基化改变 DNA甲基化状态的改变可导致基因结构和功能甲基化状态的改变可导致基因结构和功能 的异常，是细胞癌变过程中重要的一步。的异常，是细胞癌变过程中重要

15、的一步。DNA甲基化具有重要的生物学甲基化具有重要的生物学 意义，它的作用表现在控制基因表达，维护染色体的完整性，调节意义，它的作用表现在控制基因表达，维护染色体的完整性，调节DNA 重组的某些环节，可能在低于外来入侵的寄生重组的某些环节，可能在低于外来入侵的寄生DNA中起重要作用。近来中起重要作用。近来 研究发现，正常的研究发现，正常的DNA甲基化模式如果被破坏，例如基因启动子区域过甲基化模式如果被破坏，例如基因启动子区域过 渡甲基化或过低甲基化都会导致细胞发生癌变。已发现，大量的肿瘤细渡甲基化或过低甲基化都会导致细胞发生癌变。已发现，大量的肿瘤细 胞中抑癌基因的失活是该基因的启动子区域的过

16、渡甲基化有关。癌基因胞中抑癌基因的失活是该基因的启动子区域的过渡甲基化有关。癌基因 DNA甲基化水平越低，其表达水平愈高，肿瘤的生物学行为愈复杂。甲基化水平越低，其表达水平愈高，肿瘤的生物学行为愈复杂。 认为，进行认为，进行DNA甲基化状态的分析有可能成为判断肿瘤生物学行为特性甲基化状态的分析有可能成为判断肿瘤生物学行为特性 及临床预后的重要指标之一。及临床预后的重要指标之一。 8基因治疗概论 （5） 基因过量表达与癌基因的关系基因过量表达与癌基因的关系 人类拥有的人类拥有的35万个万个 基因中约有基因中约有15%左右的基因可以进行表达，这类基因具有左右的基因可以进行表达，这类基因具有 一定的

17、组织、细胞特异性。这些基因均参与细胞增殖与分一定的组织、细胞特异性。这些基因均参与细胞增殖与分 化的过程，控制细胞正常的生理功能。基因表达水平的改化的过程，控制细胞正常的生理功能。基因表达水平的改 变是细胞癌变的早期事件，通过对变是细胞癌变的早期事件，通过对Ras、ErbB2、Met几种几种 癌基因在胃粘膜病变过程中表达水平的分析，确定这三种癌基因在胃粘膜病变过程中表达水平的分析，确定这三种 基因表达水平的改变与胃粘膜病变演化有密切关系。基因表达水平的改变与胃粘膜病变演化有密切关系。 Ras基因突变、过量表达，被认为是肿瘤发生的重要原因基因突变、过量表达，被认为是肿瘤发生的重要原因 之一。研究

18、结果提示，基因表达水平的改变是细胞癌变的之一。研究结果提示，基因表达水平的改变是细胞癌变的 重要因素，无论是从基因的量变还是质变，这一过程是受重要因素，无论是从基因的量变还是质变，这一过程是受 体内和体外诸多因素的调节，由此可见细胞增殖与分化平体内和体外诸多因素的调节，由此可见细胞增殖与分化平 衡的调节和维持是通过对这样一类癌基因的表达来实现的。衡的调节和维持是通过对这样一类癌基因的表达来实现的。 9基因治疗概论 癌基因与人类肿瘤癌基因与人类肿瘤 目前已鉴定出许多与肿瘤细胞相关的癌基因，进一步研究癌基因目前已鉴定出许多与肿瘤细胞相关的癌基因，进一步研究癌基因 在肿瘤中的作用。在肿瘤中的作用。

19、（1）Ras基因变异与肿瘤基因变异与肿瘤 研究表明，约研究表明，约10%15%的肿瘤至少的肿瘤至少 有三种有三种Ras，因中一种的点突变，其中，因中一种的点突变，其中K-Ras基因更易称为突变基因更易称为突变 的基因。的基因。K-Ras基因点突变集中在第基因点突变集中在第12位氨基酸残基，少数病位氨基酸残基，少数病 理中也有第理中也有第13位及第位及第61位点突变。约位点突变。约50%结肠癌、结肠癌、70%90%胰胰 腺癌、腺癌、30%的肺癌均有的肺癌均有Ras点突变。在正常细胞中，每一种点突变。在正常细胞中，每一种Ras基基 因都分别编码一种鸟苷酸结合蛋白。因都分别编码一种鸟苷酸结合蛋白。R

20、as蛋白在细胞增殖分化信蛋白在细胞增殖分化信 号从激活的跨膜受体传递到下游蛋白激酶的过程中起作用。其结号从激活的跨膜受体传递到下游蛋白激酶的过程中起作用。其结 果导致果导致Ras蛋白与蛋白与GTP（三磷酸鸟苷）的持续结合具有促进细胞（三磷酸鸟苷）的持续结合具有促进细胞 增殖作用。研究表明，采用针对增殖作用。研究表明，采用针对Ras基因的变异将基因的变异将Ras基因的功能基因的功能 失活，可抑制肿瘤的恶性生长，进一步证明纠正突变型失活，可抑制肿瘤的恶性生长，进一步证明纠正突变型Ras引起引起 的信号传导通路的异常可能是一条控制肿瘤细胞恶性化增殖的的信号传导通路的异常可能是一条控制肿瘤细胞恶性化增

21、殖的 有效途径。有效途径。 10基因治疗概论 （2）Myc基因变异与肿瘤基因变异与肿瘤 Myc基因是一种癌基因。通过染色体基因是一种癌基因。通过染色体 易位而活化，通常通过第易位而活化，通常通过第8号染色体与第号染色体与第14号染色体间易位，破号染色体间易位，破 坏坏Myc基因的调控，在某些肿瘤细胞中基因的调控，在某些肿瘤细胞中Myc基因还受基因还受DNA扩增的扩增的 影响。影响。 Myc基因在细胞生长调控中具有重要作用，一旦发生突变，基因在细胞生长调控中具有重要作用，一旦发生突变， 导致细胞恶性增殖。导致细胞恶性增殖。 此外：此外：Nen基因变异与卵巢癌、乳腺癌及胃癌等，基因变异与卵巢癌、乳

22、腺癌及胃癌等，c-Met基因变异基因变异 与胃粘膜病变，与胃粘膜病变，Bcl-2基因与细胞凋亡等都是研究热点。基因与细胞凋亡等都是研究热点。 （3）端粒酶）端粒酶 端粒是真核细胞线形染色体末端由段粒端粒是真核细胞线形染色体末端由段粒DNA和端粒和端粒 蛋白质构成的一种特殊结构。人的端粒蛋白质构成的一种特殊结构。人的端粒DNA序列由序列由5向向3方向的方向的 （TTAGGG）n重复串联组成。正常情况下，随着细胞分裂，端粒重复串联组成。正常情况下，随着细胞分裂，端粒 的进行性缩短并诱发一系列分子事件，最终导致细胞凋亡。端粒的进行性缩短并诱发一系列分子事件，最终导致细胞凋亡。端粒 酶是一种能延长端粒

23、末端的核糖蛋白酶，以自身酶是一种能延长端粒末端的核糖蛋白酶，以自身RNA为模板合成为模板合成 端粒端粒DNA并整合到染色体末端，使染色体延长，从而延长细胞的并整合到染色体末端，使染色体延长，从而延长细胞的 寿命甚至是细胞永生化。绝大多数正常体细胞端粒酶为阴性，普寿命甚至是细胞永生化。绝大多数正常体细胞端粒酶为阴性，普 遍认为端粒酶的激活与恶性肿瘤的发生与发展密切相关。端粒酶遍认为端粒酶的激活与恶性肿瘤的发生与发展密切相关。端粒酶 的活化涉及一系列基因的表达和调控的变化，从而导致细胞增殖的活化涉及一系列基因的表达和调控的变化，从而导致细胞增殖 分化的异常。分化的异常。 11基因治疗概论 癌基因与

24、肿瘤的预防诊断和治疗癌基因与肿瘤的预防诊断和治疗 （1）环境致病因素抑癌基因变异的积累）环境致病因素抑癌基因变异的积累 目前认为，任何一目前认为，任何一 种肿瘤都与一种致病微生物相关，并往往伴某一类型的慢性种肿瘤都与一种致病微生物相关，并往往伴某一类型的慢性 炎症。去除致病因素，阻断细胞癌变是预防肿瘤发生的关键。炎症。去除致病因素，阻断细胞癌变是预防肿瘤发生的关键。 如早期发现如早期发现RNA病毒通过影响宿主细胞的基因而与肿瘤发生病毒通过影响宿主细胞的基因而与肿瘤发生 相关，煤焦油中的化学物质作用于相关，煤焦油中的化学物质作用于DNA引起细胞癌变及诱发引起细胞癌变及诱发 肿瘤。这些被确定为细胞

25、癌变的重要因素。同时多种肿瘤具肿瘤。这些被确定为细胞癌变的重要因素。同时多种肿瘤具 有家族聚集现象，因此遗传易感性是另一个致癌因素。在这有家族聚集现象，因此遗传易感性是另一个致癌因素。在这 些因素作用下，癌基因发生突变等导致肿瘤发生。说明肿瘤些因素作用下，癌基因发生突变等导致肿瘤发生。说明肿瘤 的发生发展是全身代谢障碍性导致的疾病。肿瘤的发生与发的发生发展是全身代谢障碍性导致的疾病。肿瘤的发生与发 展是多基因以多种形式变异积累的病变过程，任何一个单基展是多基因以多种形式变异积累的病变过程，任何一个单基 因都不能从基因水平阐明肿瘤发病的分子机制。因都不能从基因水平阐明肿瘤发病的分子机制。 12基

26、因治疗概论 （2）细胞癌变的分子模型与肿瘤相关基因的鉴定）细胞癌变的分子模型与肿瘤相关基因的鉴定 以胃癌研究为例：胃粘膜慢性病变不同阶段中某些肿瘤相以胃癌研究为例：胃粘膜慢性病变不同阶段中某些肿瘤相 关基因变异方式、频率给与病变演化关系。根据对处在不关基因变异方式、频率给与病变演化关系。根据对处在不 同阶段的胃粘膜组织的分析（正常胃粘膜、浅表性胃炎、同阶段的胃粘膜组织的分析（正常胃粘膜、浅表性胃炎、 慢性萎缩性胃炎、肠上皮化生、异型增生、胃癌），初步慢性萎缩性胃炎、肠上皮化生、异型增生、胃癌），初步 确定在胃癌中检出高频率的基因变异，包括癌基因的扩增、确定在胃癌中检出高频率的基因变异，包括癌基

27、因的扩增、 重排、点突变、过量表达。抑癌基因缺失、点突变、过量重排、点突变、过量表达。抑癌基因缺失、点突变、过量 表达和基因甲基化改变，此外，在胃粘膜病变异型性增生表达和基因甲基化改变，此外，在胃粘膜病变异型性增生 和肠上皮化生中也检测到和肠上皮化生中也检测到p53和和Ras基因的点突变及基因基因的点突变及基因Met、 ErbB2、Akt2过量表达。研究表明，基因过量表达多发生过量表达。研究表明，基因过量表达多发生 在细胞癌变的起始阶段，基因点突变可能是细胞癌变启动在细胞癌变的起始阶段，基因点突变可能是细胞癌变启动 阶段的一个主要事件，这一阶段的可逆性较大；基因扩增、阶段的一个主要事件，这一阶

28、段的可逆性较大；基因扩增、 重排多发生在癌变的促进阶段，癌变细胞可能开始向不同重排多发生在癌变的促进阶段，癌变细胞可能开始向不同 的生物学行为分化，可能表现出多样性和异质性；基因缺的生物学行为分化，可能表现出多样性和异质性；基因缺 失不仅能导致癌变细胞生物学行为的多样化并导致癌变细失不仅能导致癌变细胞生物学行为的多样化并导致癌变细 胞增值分化平衡失调，促使肿瘤迅速发展。胞增值分化平衡失调，促使肿瘤迅速发展。 13基因治疗概论 癌基因与肿瘤生物学的关键科学问题癌基因与肿瘤生物学的关键科学问题 随着基因组、蛋白组学研究的进展和生物芯片技术的发展，随着基因组、蛋白组学研究的进展和生物芯片技术的发展，

29、 以下几个科学为题有助于进一步阐明癌基因与肿瘤的关系：以下几个科学为题有助于进一步阐明癌基因与肿瘤的关系： （1）基因与不同肿瘤细胞的信号传导；）基因与不同肿瘤细胞的信号传导； （2）癌基因变异与肿瘤的易感性；）癌基因变异与肿瘤的易感性； (3）癌基因与不同个体肿瘤的生物学特性；）癌基因与不同个体肿瘤的生物学特性； （4）癌基因与机体内外环境平衡调控的分子机制；）癌基因与机体内外环境平衡调控的分子机制； （5）癌基因表达时空性与细胞的更新换代；）癌基因表达时空性与细胞的更新换代； （6）癌基因与肿瘤的临床病理学基因分型。）癌基因与肿瘤的临床病理学基因分型。 14基因治疗概论 抑癌基因抑癌基因

30、在肿瘤发生中，有一种通过纯合缺失或失活而引以恶化的基因，被称在肿瘤发生中，有一种通过纯合缺失或失活而引以恶化的基因，被称 之为抑癌基因，这类基因在控制细胞生长、增殖及分化过程中起着十之为抑癌基因，这类基因在控制细胞生长、增殖及分化过程中起着十 分重要的负调节作用，并能潜在的抑制肿瘤生长，如果其功能失活或分重要的负调节作用，并能潜在的抑制肿瘤生长，如果其功能失活或 出现基因缺失、突变等异常，可导致出现基因缺失、突变等异常，可导致 细胞恶性转化而发生肿瘤。抑细胞恶性转化而发生肿瘤。抑 癌基因的生物学功能与癌基因相反，他们是机体细胞在增殖、分化、癌基因的生物学功能与癌基因相反，他们是机体细胞在增殖、

31、分化、 凋亡等生命过程中正和负两类调控信号，癌基因的调控属正信号，而凋亡等生命过程中正和负两类调控信号，癌基因的调控属正信号，而 抑癌基因的调控属负信号范围。确定一种抑癌基因需要在理论上符合抑癌基因的调控属负信号范围。确定一种抑癌基因需要在理论上符合 三个条件：三个条件： （1）该恶性肿瘤的相应正常组织中该基因必须正常表达；）该恶性肿瘤的相应正常组织中该基因必须正常表达； （2）该恶性肿瘤中这种基因应有功能失活、结构改变、表达缺陷；）该恶性肿瘤中这种基因应有功能失活、结构改变、表达缺陷； （3）将这种基因的野生型导入基因异常的肿瘤细胞内，可部分或全）将这种基因的野生型导入基因异常的肿瘤细胞内，

32、可部分或全 部改变其恶性表型。目前研究，还未发现任何一种抑癌基因的异常存部改变其恶性表型。目前研究，还未发现任何一种抑癌基因的异常存 在与人类全部肿瘤中，均表现为不同频率的异常。在与人类全部肿瘤中，均表现为不同频率的异常。 15基因治疗概论 抑癌基因大多属于一类对细胞增殖产生负调控作用的基因及其产物，抑癌基因大多属于一类对细胞增殖产生负调控作用的基因及其产物， 其促癌作用一般是在两个等位基因都丢失或失活后才显示出来，其促癌作用一般是在两个等位基因都丢失或失活后才显示出来， 故发现和分离都比较困难。目前已被克隆的抑癌基因和未被可隆故发现和分离都比较困难。目前已被克隆的抑癌基因和未被可隆 的候选抑

33、癌基因已达的候选抑癌基因已达30余种，而且新的抑癌基因还在不断出现。余种，而且新的抑癌基因还在不断出现。 例如：例如： 基因名称基因名称 染色体定位染色体定位 基因产物定位基因产物定位 常见主要肿瘤常见主要肿瘤 P53 17P13 细胞核细胞核 多种肿瘤多种肿瘤 P16 9q21 细胞核细胞核 多种肿瘤多种肿瘤 P19 19p13。2 细胞核细胞核 多种肿瘤多种肿瘤 Rb 13q14 细胞核细胞核 视网膜母细胞瘤视网膜母细胞瘤 APC 5q21 细胞膜细胞膜 结肠癌结肠癌 FHIT 3p14。2 细胞质细胞质 消化道肿瘤、肾癌、肺癌等消化道肿瘤、肾癌、肺癌等 等等。等等。 16基因治疗概论 以

34、以p53 基因为例：基因为例： p53基因是基因研究最为深入的肿瘤基因之一。人类肿瘤中约基因是基因研究最为深入的肿瘤基因之一。人类肿瘤中约50% 以上与以上与p53基因变化有关，仅基因变化有关，仅19912002年年1月的相关文献超过月的相关文献超过9800 余篇，余篇，p53基因也被基因也被Science杂志评为杂志评为1993年的明星分之子。年的明星分之子。 P53基因的结构和生物学特性基因的结构和生物学特性 P53基因全长约基因全长约20kb，定位在人类染色体，定位在人类染色体17p13.1，由，由11个外显子组个外显子组 成，编码成，编码393个氨基酸组成的个氨基酸组成的53kb的核内

35、磷酸化蛋白，具有蛋白的核内磷酸化蛋白，具有蛋白 质质-DNA和蛋白质和蛋白质-蛋白质结合的功能。现已明确蛋白质结合的功能。现已明确p53是细胞生长周是细胞生长周 期中负调节因子，与细胞周期的调控、期中负调节因子，与细胞周期的调控、DNA修复、细胞分化、细修复、细胞分化、细 胞凋亡等重要的生物学功能有关。胞凋亡等重要的生物学功能有关。P53可正调节一些在细胞增殖周可正调节一些在细胞增殖周 期调控过程中起关键作用的基因，包括可调期调控过程中起关键作用的基因，包括可调CDK活性的活性的p21和和DNA 损伤导致的细胞生长受阻相关的损伤导致的细胞生长受阻相关的GADD45基因。基因。 P53突变可影响

36、与突变可影响与 DNA相互作用的关键氨基酸，也可由于相互作用的关键氨基酸，也可由于p53基因突变蛋白发生错误基因突变蛋白发生错误 重叠而不能与特定的重叠而不能与特定的DNA识别序列相互结合。识别序列相互结合。P53在细胞内的核心在细胞内的核心 作用是介导作用是介导DNA顺伤后的细胞应激反应，维持遗传稳定性。对细顺伤后的细胞应激反应，维持遗传稳定性。对细 胞周期的调节主要是在胞周期的调节主要是在G1/S控制点起作用，以决定细胞是否启动控制点起作用，以决定细胞是否启动 DNA合成，而在另一些情况下，却决定细胞是否进行程序化死亡。合成，而在另一些情况下，却决定细胞是否进行程序化死亡。 P53的失活可

37、使肿瘤细胞进一步出现基因组的不稳定性，突变型的失活可使肿瘤细胞进一步出现基因组的不稳定性，突变型p53 则具有癌基因的作用，促进细胞恶性化。则具有癌基因的作用，促进细胞恶性化。 17基因治疗概论 1 P53基因异常与肿瘤基因异常与肿瘤 P53基因的缺失或突变已被证实是许多肿瘤发生的原因之一。基因的缺失或突变已被证实是许多肿瘤发生的原因之一。 自自1989年以来，人们发现在多种不同类型的肿瘤中发现了年以来，人们发现在多种不同类型的肿瘤中发现了 p53基因的突变，其频率可达基因的突变，其频率可达50%60%，其突变的形式可，其突变的形式可 表现为点突变、缺失突变、插入突变、移码突变、基因重表现为点

38、突变、缺失突变、插入突变、移码突变、基因重 排等。目前已知的突变位点约有排等。目前已知的突变位点约有3500余种，大多数集中于余种，大多数集中于 第第58外显子。外显子。P53基因异常的另一个形势为等位基因的缺基因异常的另一个形势为等位基因的缺 失，特别是当一个等位基因发生突变时，另一个等位基因失，特别是当一个等位基因发生突变时，另一个等位基因 便存在缺失的倾向，这种两个等位基因都缺失的现象在结便存在缺失的倾向，这种两个等位基因都缺失的现象在结 肠癌、乳腺癌发生频率较高。另外，肠癌、乳腺癌发生频率较高。另外，p53基因甲基化状态的基因甲基化状态的 变化也是较为常见的基因异常。变化也是较为常见的

39、基因异常。 18基因治疗概论 1 P53基因产物的研究进展基因产物的研究进展 P53蛋白具有与双链或单链蛋白具有与双链或单链DNA结合的能力，同时还具结合的能力，同时还具 有与有与DNA病毒编码产物结合的能力。病毒编码产物结合的能力。P53基因突变和等基因突变和等 位基因缺失是导致位基因缺失是导致p53蛋白表达异常的主要原因，由于蛋白表达异常的主要原因，由于 突变型突变型p53蛋白的半衰期可延长至蛋白的半衰期可延长至612小时，所以用抗小时，所以用抗 p53蛋白的抗体通过免疫组化法检测肿瘤组织，过表达蛋白的抗体通过免疫组化法检测肿瘤组织，过表达 常提示常提示p53基因存在错义突变，应用这一方法

40、可为一些基因存在错义突变，应用这一方法可为一些 肿瘤如乳腺癌提供临床预后的指标。然而新近的研究表肿瘤如乳腺癌提供临床预后的指标。然而新近的研究表 明明,，除突变性，除突变性p53蛋白可以增加在细胞内积聚外，如果蛋白可以增加在细胞内积聚外，如果 以某种结合的方式存在，特别是与肿瘤性以某种结合的方式存在，特别是与肿瘤性DNA病毒编码病毒编码 产物结合，也可使细胞内产物结合，也可使细胞内p53蛋白集聚，含量增加，导致蛋白集聚，含量增加，导致 其正常的负调节功能丧失。其正常的负调节功能丧失。 19基因治疗概论 1 P53基因对细胞内基因转录的调节基因对细胞内基因转录的调节 P53除可以与某些病毒癌蛋白

41、结合外，还可以与细胞内的除可以与某些病毒癌蛋白结合外，还可以与细胞内的 转录因子结合，起到活化和调节作用，目前已发现转录因子结合，起到活化和调节作用，目前已发现p53激激 活转录的基因有活转录的基因有107种，抑制转录活性的基因有种，抑制转录活性的基因有54种，其种，其 中关系较为密切且进行较深入研究的相关基因有十几种。中关系较为密切且进行较深入研究的相关基因有十几种。 激活转录：激活转录：Bax、Fas/Apol、CyclinG、GADD45、GD-AIF、 HIC1、MCK等。等。 抑制转录活型：抑制转录活型：P21WAF1/CIP1、BcL2、C-myc、FGF、 C-fos、HSP70

42、等。等。 P53蛋白在调节细胞周期和基因稳定性方面的研究也有很蛋白在调节细胞周期和基因稳定性方面的研究也有很 大进展。在细胞周期中，当大进展。在细胞周期中，当DNA受到损伤后，便停止受到损伤后，便停止DNA 的修复，使细胞停留在的修复，使细胞停留在G1期，如损伤的期，如损伤的DNA被修复，则可被修复，则可 进入进入S期，如果损伤严重而不能修复，则会出现程序性死亡期，如果损伤严重而不能修复，则会出现程序性死亡 。野生型。野生型p53基因对控制细胞周期、维持细胞遗传稳定性具基因对控制细胞周期、维持细胞遗传稳定性具 有重要作用，认为可能是通过有重要作用，认为可能是通过GADD45及及Mdm2行使调节

43、作用。行使调节作用。 20基因治疗概论 INK4基因家族基因家族 INK4（inhibitors of CDK4）基因家族包括了）基因家族包括了p16、p15、p18 及及p19基因等。在细胞周期调控中具有十分重要的意义，这基因等。在细胞周期调控中具有十分重要的意义，这 类蛋白具有周期依赖性表达模式，特异性抑制类蛋白具有周期依赖性表达模式，特异性抑制CDK的激酶活的激酶活 性，并参与某些组织细胞的分化、增殖的调节。性，并参与某些组织细胞的分化、增殖的调节。 例：例：p16 基因异常与肿瘤基因异常与肿瘤 p16基因异常的主要表现特点以基因基因异常的主要表现特点以基因 缺失为主，且多为纯和性缺失，

44、在肿瘤细胞系中可达缺失为主，且多为纯和性缺失，在肿瘤细胞系中可达80%以上，以上， 在实体瘤中可达在实体瘤中可达70%左右，而点突变发生率较低；不同肿瘤的左右，而点突变发生率较低；不同肿瘤的 突变频率不同，同一肿瘤的不同分化程度其缺失和突变率也不突变频率不同，同一肿瘤的不同分化程度其缺失和突变率也不 同，细胞株的基因异常高于实体瘤，基因异常总发生率高于其同，细胞株的基因异常高于实体瘤，基因异常总发生率高于其 他已知的抑癌基因。他已知的抑癌基因。P16基因异常分布的瘤谱范围广，包括了人基因异常分布的瘤谱范围广，包括了人 类肿瘤的大部分类型，也包括散发性和具有遗传倾向的肿瘤。类肿瘤的大部分类型，也

45、包括散发性和具有遗传倾向的肿瘤。 在高级别的胶质瘤中，在高级别的胶质瘤中，P16基因缺失达基因缺失达71%，而在二级胶质瘤中，而在二级胶质瘤中 为发现有丢失，在胶质瘤细胞株中可达为发现有丢失，在胶质瘤细胞株中可达82%，在实体瘤中平均，在实体瘤中平均 丢失率可达丢失率可达55%。 越来越多的证据表明越来越多的证据表明P16作为一种新的抑癌基因。作为一种新的抑癌基因。 21基因治疗概论 六六 肿瘤转移抑制基因肿瘤转移抑制基因 肿瘤转移机制的研究是肿瘤分子生物学研究的热点之一，与肿瘤肿瘤转移机制的研究是肿瘤分子生物学研究的热点之一，与肿瘤 发生一样，肿瘤转移不仅有促转移基因的激活，也伴有转移抑制发

46、生一样，肿瘤转移不仅有促转移基因的激活，也伴有转移抑制 基因的失活，肿瘤异质性理论为肿瘤转移抑制基因和相关基因的基因的失活，肿瘤异质性理论为肿瘤转移抑制基因和相关基因的 发现提供了理论基础，并在细胞融合实验中得到证实。目前已发发现提供了理论基础，并在细胞融合实验中得到证实。目前已发 现并研究较多的肿瘤转移抑制基因主要有现并研究较多的肿瘤转移抑制基因主要有nm-23、KAI1等。等。 nm-23基因定位与人类染色体基因定位与人类染色体17q22，编码区为，编码区为533bp，产物为，产物为152 个氨基酸组成的个氨基酸组成的17kd核内及胞浆蛋白，与二磷酸核苷激酶（核内及胞浆蛋白，与二磷酸核苷激

47、酶（NDPK） 的氨基酸序列具有高度同源型。的氨基酸序列具有高度同源型。nm-23基因在肿瘤的研究主要是其基因在肿瘤的研究主要是其 与肿瘤转移的关系，在乳腺癌、胃癌、结肠癌、前列腺癌等许多与肿瘤转移的关系，在乳腺癌、胃癌、结肠癌、前列腺癌等许多 肿瘤研究中有报道。肿瘤研究中有报道。nm-23表达水平与肺癌转移呈负相关，表达水平与肺癌转移呈负相关，mRNA 水平在低转移癌细胞中比高水平转移癌细胞高水平在低转移癌细胞中比高水平转移癌细胞高10倍以上。倍以上。nm-23与与 肿瘤转移的关系除了与表达水平有关外，另一异常变化是等位基因肿瘤转移的关系除了与表达水平有关外，另一异常变化是等位基因 缺失或突

48、变，在缺失或突变，在64%乳腺癌、乳腺癌、42%肺癌、肺癌、20%肾癌均存在等位基因肾癌均存在等位基因 杂合性缺失。有关杂合性缺失。有关nm-23基因两种类型基因两种类型H1和和H2在肿瘤转移中的作用，在肿瘤转移中的作用， 较多的结果倾向于较多的结果倾向于nm-23H1在抑制肿瘤转移中其主要作用。在抑制肿瘤转移中其主要作用。 22基因治疗概论 七七 存在的问题及发展方向存在的问题及发展方向 Vogelstein在对在对p53基因的研究中形象的将抑癌基因在细胞分化、基因的研究中形象的将抑癌基因在细胞分化、 增殖过程中的作用比喻为汽车的刹车，刹车控制着汽车的行使增殖过程中的作用比喻为汽车的刹车，刹

49、车控制着汽车的行使 或停止，而抑癌基因通过对细胞周期、细胞凋亡的控制，使细或停止，而抑癌基因通过对细胞周期、细胞凋亡的控制，使细 胞分裂、增殖处于一种平衡状态，抑癌基因一旦出现异常，这胞分裂、增殖处于一种平衡状态，抑癌基因一旦出现异常，这 一正常的调控功能丧失，细胞则会出现恶性转化。一正常的调控功能丧失，细胞则会出现恶性转化。 人们在研究中逐步认识到，既有癌基因的作用，也有抑癌基因人们在研究中逐步认识到，既有癌基因的作用，也有抑癌基因 的作用，在肿瘤的不同阶段和时期，有着不同基因的参与，是的作用，在肿瘤的不同阶段和时期，有着不同基因的参与，是 肿瘤发生多步骤、多基因参与的生物学过程得到更为合理

50、的解肿瘤发生多步骤、多基因参与的生物学过程得到更为合理的解 释，各种相关肿瘤发生的分子模型也相继出现，如结肠癌、胃释，各种相关肿瘤发生的分子模型也相继出现，如结肠癌、胃 癌、乳腺癌、肝癌等肿瘤发生的分子模型。癌、乳腺癌、肝癌等肿瘤发生的分子模型。 目前新的候选抑癌基因仍在不断出现，除对这些新基因进行克目前新的候选抑癌基因仍在不断出现，除对这些新基因进行克 隆、鉴定和功能研究外，对抑癌基因的生物学功能、抑癌作用隆、鉴定和功能研究外，对抑癌基因的生物学功能、抑癌作用 机制、与肿瘤易感性的关系、肿瘤细胞诱导分化和凋亡、信号机制、与肿瘤易感性的关系、肿瘤细胞诱导分化和凋亡、信号 传导、基因调节网络以及

51、肿瘤的基因治疗等方面都是极受关注传导、基因调节网络以及肿瘤的基因治疗等方面都是极受关注 的研究领域。的研究领域。 23基因治疗概论 在对病人实施基因治疗之前在对病人实施基因治疗之前,必须完成下列几项工作必须完成下列几项工作: 1. 疾病的确认疾病的确认 2. 基因检测与克隆基因检测与克隆 3. 基因突变的鉴定基因突变的鉴定 4. 基因突变与疾病病理表现的关系基因突变与疾病病理表现的关系 5. 基因转移到靶细胞基因转移到靶细胞 6. 检测基因在靶细胞中的表达检测基因在靶细胞中的表达,及其蛋白质功能的测定及其蛋白质功能的测定 7. 基因转移有效性和安全性的检测系统基因转移有效性和安全性的检测系统

52、目前临床试用的几种基因治疗遗传性疾病目前临床试用的几种基因治疗遗传性疾病: 1. -抗胰蛋白酶缺乏症抗胰蛋白酶缺乏症 2.慢性肉芽肿慢性肉芽肿 3. 家族性高胆固醇血症家族性高胆固醇血症 4.范可范可 尼氏综合症尼氏综合症 5.高雪氏病高雪氏病 6. 腺苷脱胺酶缺乏引起的免疫缺乏症腺苷脱胺酶缺乏引起的免疫缺乏症 目前临床试用的几种基因治疗后天性疾病目前临床试用的几种基因治疗后天性疾病: 1. 爱滋病爱滋病 2.周围动脉血管疾病周围动脉血管疾病 3.类风湿性关节炎类风湿性关节炎 4.肿瘤肿瘤 24基因治疗概论 二.基因疾病的诊断方法 (一一).临床诊断临床诊断 主要通过病史、查体和遗传家谱的分析

53、主要通过病史、查体和遗传家谱的分析,得出初步诊断得出初步诊断. (二二).生化检查生化检查 蛋白质分析和酶学测定蛋白质分析和酶学测定 (三三).分子生物学检查分子生物学检查 1. 聚合酶链反应聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR) 提取病人提取病人DNA后后,经高温变性处理经高温变性处理,使双链使双链DNA分成二条单链分成二条单链DNA,在特异在特异 性引物和性引物和DNA聚合酶作用下聚合酶作用下,以单链以单链DNA为模板进行复制为模板进行复制.经反复循环经反复循环,可使可使 DNA扩增几百倍扩增几百倍,然后对然后对PCR产物进行测定产物进行测定.如果用突变

54、基因的引物进行扩增如果用突变基因的引物进行扩增, 只有在病人的只有在病人的DNA也有同样突变时才能扩增也有同样突变时才能扩增,而正常而正常DNA不会扩增不会扩增. 2. DNA杂交杂交 (DNA hybridization) 将病人的将病人的DNA变成单链后变成单链后,滴在硝酸纤维膜上滴在硝酸纤维膜上,在加入带有放射性的已知突在加入带有放射性的已知突 变基因变基因.如果病人如果病人DNA带有相同的突变基因片断带有相同的突变基因片断,可与之杂交可与之杂交,在纤维膜上出在纤维膜上出 现放射性斑点现放射性斑点,反之则无反之则无. 25基因治疗概论 3. 限制性内切酶限制性内切酶(restrictio

55、n enzymes) 用一种或几种限制性内切酶消化病人的用一种或几种限制性内切酶消化病人的DNA, 由于该酶具有特异性识别和裂解碱基序列的功能由于该酶具有特异性识别和裂解碱基序列的功能, 可将可将DNA分解成特定长度的分解成特定长度的DNA片段片段,经过电泳经过电泳, 使使DNA片断按大小排列成图谱片断按大小排列成图谱.如果病人如果病人DNA有有 突变突变,及可增加或减少几个切点及可增加或减少几个切点,某些部位就不能被某些部位就不能被 内切酶切开内切酶切开,出现某些出现某些DNA片断的缺如或增多片断的缺如或增多,根根 据这些异常的据这些异常的DNA片断序列图谱片断序列图谱,可初步确定突变可初步

56、确定突变 的部位的部位.进一步可用进一步可用DNA杂交杂交,如果该部位能与带如果该部位能与带 有放射性的突变基因杂交有放射性的突变基因杂交,则可做出诊断则可做出诊断.如果能于如果能于 正常基因杂交正常基因杂交,则可否认诊断则可否认诊断.必要时做必要时做DNA碱基碱基 序列分析序列分析. 26基因治疗概论 4.单链构象多态分析单链构象多态分析(single-strand conformation polymorphism,SSCP) 将病人的将病人的DNA作为膜板作为膜板,应用特异性引物和应用特异性引物和32P-dCTP做做 PCR,然后将然后将PCR产物进行聚丙烯酸胺产物进行聚丙烯酸胺/尿素凝

57、胶电泳分析尿素凝胶电泳分析, 如果病人的基因有一个碱基丢失如果病人的基因有一个碱基丢失,使使PCR产物的构象发生产物的构象发生 变异变异,在电泳中的速度就会与正常不一样在电泳中的速度就会与正常不一样,出现异常的显影出现异常的显影 带带,从而得出诊断从而得出诊断. 5. 其它其它 随着分子生物学的不断发展随着分子生物学的不断发展,新的检测技术不断出现新的检测技术不断出现,如如 连接酶链反应连接酶链反应(Ligase Reaction,LCR)外显示扫描技术外显示扫描技术 (Exon scanning technique)等等. 27基因治疗概论 三基因转移 基因转移可载体外或体内进行基因转移可载

58、体外或体内进行.体外基因转移是从病人体内选择适合的靶体外基因转移是从病人体内选择适合的靶 细胞细胞,在体外进行培养和基因修饰在体外进行培养和基因修饰,然后将被修饰基因的细胞送回病人体内然后将被修饰基因的细胞送回病人体内. 体内基因转移是通过一种媒介物体内基因转移是通过一种媒介物,将正常基因输送给病人将正常基因输送给病人.这种媒介物可这种媒介物可 以亲和到病人体内的特定组织细胞以亲和到病人体内的特定组织细胞,将正常基因送入靶细胞将正常基因送入靶细胞. 基因转移的主要方法基因转移的主要方法: 1. 显微注射法显微注射法(Microinjection) 应用特制的玻璃管应用特制的玻璃管,将基因片断直

59、接注入到靶细胞核将基因片断直接注入到靶细胞核.一般说来一般说来,约有约有1/4的的 外界基因可在靶细胞中存活外界基因可在靶细胞中存活,并能表达其功能并能表达其功能.目前西德的一家研究所应用目前西德的一家研究所应用 计算机显微注射技术计算机显微注射技术,每小时可注射每小时可注射1500个细胞个细胞.其缺点是操作比较复杂其缺点是操作比较复杂,被被 注入的基因可能随机整合到靶细胞染色体注入的基因可能随机整合到靶细胞染色体,结果可能会激活靶细胞的某些基结果可能会激活靶细胞的某些基 因或使其失活因或使其失活.本法已用于动物本法已用于动物,注射一种基因片断到卵细胞注射一种基因片断到卵细胞,达到转移基因达到

60、转移基因 的作用的作用 。 28基因治疗概论 2. 电涵法电涵法 将基因将基因DNA和靶细胞放入低传导液的电极槽中和靶细胞放入低传导液的电极槽中,通过通过1015s, 电压电压0.25v.通过电子打孔和细胞的胞饮作用通过电子打孔和细胞的胞饮作用,使基因进入细胞使基因进入细胞. 3. 生物媒介法生物媒介法(Biological vectors) 利用生物媒介物传递基因的方法为生物媒介法利用生物媒介物传递基因的方法为生物媒介法.即将经重新改即将经重新改 造的生物体基因片断作为媒介物造的生物体基因片断作为媒介物,发挥正常的媒介功能发挥正常的媒介功能,将正常将正常 基因传送到靶细胞基因传送到靶细胞,进