第二章 基因工程工具酶

1、第二章第二章 基因工程工具酶基因工程工具酶 分类：分类： 限制性内切酶限制性内切酶（Restriction Endonuclease） RNaseA 1.水解酶类水解酶类 核酸酶核酸酶 RNaseT1 RNaseH DNase S1 核酸外切酶核酸外切酶（Exonuclease） 大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶 （DNA Pol ) 大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶大片段大片段 （Klenow Fragment|） 2.DNA聚合酶类聚合酶类 嗜热嗜热DNA聚合酶聚合酶（Taq酶酶 ） DNA连接酶连接酶 ( Ligase ) 反转录酶（反转录酶（Reverse Transcriptas

2、e) 小牛肠碱性磷酸酶小牛肠碱性磷酸酶(CIP) 3.修饰酶类修饰酶类 细菌碱性磷酸酶细菌碱性磷酸酶(BAP ) T4噬菌体多核苷酸激酶噬菌体多核苷酸激酶 （T4 Phage Polynucleotide Kinase) 鼠源鼠源 禽源禽源 （一）限制性核酸内切酶的发现（一）限制性核酸内切酶的发现 （二）限制性核酸内切酶的分类（二）限制性核酸内切酶的分类 （三）限制性核酸内切酶的命名（三）限制性核酸内切酶的命名 （四）（四） II型限制性核酸内切酶的基本特性型限制性核酸内切酶的基本特性 （五）限制性核酸内切酶的消化反应条件（五）限制性核酸内切酶的消化反应条件 一、一、 限制性核酸内切酶限制性核

3、酸内切酶 由寄主控制的由寄主控制的限制限制和和修饰修饰现象现象-20世纪世纪60年代，年代，Linn和和Arber 发现发现 (B) (K) 大肠杆菌大肠杆菌B大肠杆菌大肠杆菌K EOP=1 EOP=1 EOP=10 -4 EOP=10 - 4 EOP 成斑率成斑率 efficiency of plating 外源外源DNA 自身自身DNA （一）核酸限制性核酸内切酶的发现（一）核酸限制性核酸内切酶的发现 限制限制和和修饰修饰现象现象 限制限制修饰的酶学系统修饰的酶学系统 (B) (B) 酶切位点酶切位点 不被修饰不被修饰 噬菌体噬菌体DNA 被切割被切割 酶切位点酶切位点 被修饰被修饰 基因

4、组基因组DNA 不被切割不被切割 E.coli E.coli B B含有含有EcoBEcoB核酸酶和核酸酶和EcoBEcoB甲基化酶甲基化酶 当当(k)(k)噬菌体侵染噬菌体侵染E.coliE.coliB B时，由于其时，由于其 DNADNA中有中有EcoBEcoB核酸酶特异识别的碱基序列，核酸酶特异识别的碱基序列， 被降解掉。而被降解掉。而E.coliE.coliB B的的DNADNA中虽然也存在中虽然也存在 这种特异序列，但可在这种特异序列，但可在EcoBEcoB甲基化酶的作甲基化酶的作 用下，催化用下，催化S- S-腺苷甲硫氨酸（腺苷甲硫氨酸（SAMSAM）将甲基）将甲基 转移给限制酶识

5、别序列的特定碱基，使之转移给限制酶识别序列的特定碱基，使之 甲基化。甲基化。 EcoBEcoB核酸酶不能识别已甲基化的核酸酶不能识别已甲基化的 序列。序列。 1962年瑞士的年瑞士的W.Arber（阿尔伯）提出细菌的限（阿尔伯）提出细菌的限 制修饰系统。制修饰系统。1968年发现年发现型内切酶型内切酶; 1968年美国的年美国的H. O. Smith发现发现型内切酶型内切酶; 1970年美国的年美国的O. Nathans（内申斯）用（内申斯）用型酶型酶 制备了肿瘤基因制备了肿瘤基因; 1978年三人共获诺贝尔生理与医学奖。年三人共获诺贝尔生理与医学奖。 从此，相关研究展开。目前从此，相关研究展

6、开。目前已纯化出已纯化出3000种限制种限制 性内切酶中性内切酶中，其中有其中有30%是在是在NEB发现的发现的 。 概念概念: : 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶（restriction endonucleaserestriction endonuclease ） 一类能够识别双链一类能够识别双链DNADNA分子中的某种特定核苷酸序分子中的某种特定核苷酸序 列，并由此切割列，并由此切割DNADNA双链结构的核酸内切酶。切开双链结构的核酸内切酶。切开 的是的是3,5-3,5-磷酸二酯键。磷酸二酯键。 （二）限制性核酸内切酶的类型及其主要特性（二）限制性核酸内切酶的类型及其主要特性 特性特性

7、1. 限制修饰活性限制修饰活性 2. 内切酶的蛋白内切酶的蛋白 质结构质结构 3. 限制辅助因子限制辅助因子 4. 切割位点切割位点 5. 特异性切割特异性切割 6. 基因克隆中基因克隆中 I 型型 双功能的酶双功能的酶 3种不同亚基种不同亚基 ATP、Mg2+和和S- 腺苷甲硫氨酸腺苷甲硫氨酸 距特异性位点距特异性位点 5端至少端至少1000bp 不是（随机）不是（随机） 无用无用 II 型型 限制酶和修饰酶分开限制酶和修饰酶分开 单一成分单一成分 Mg2+ 位于识别位点上位于识别位点上 是是 非常有用非常有用 III 型型 双功能酶双功能酶 2种亚基种亚基 ATP、Mg2+和和S- 腺苷甲

8、硫氨酸腺苷甲硫氨酸 特异性位点特异性位点3端端 24-26bp处处 是是 用处不大用处不大 （三）限制性核酸内切酶的命名（三）限制性核酸内切酶的命名 1、寄主菌属名的第一个字母和种名的头两个字母组成寄主菌属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个斜体个斜体 字母的略语表示酶来源的菌种名称，如大肠杆菌字母的略语表示酶来源的菌种名称，如大肠杆菌Escherichia coli 表示为表示为Eco , 流感嗜血菌流感嗜血菌Haemophilus influenzae 表示为表示为 Hin； 2、用一个正体字母表示菌株的类型，比如用一个正体字母表示菌株的类型，比如EcoR、Hind； 3、如果一种特殊

9、的寄主菌株具有几个不同的限制修饰体系，则如果一种特殊的寄主菌株具有几个不同的限制修饰体系，则 用罗马数字标出，比如用罗马数字标出，比如Eco R I、 Hind III。 EcoR （酶名称）: Escherichia Coli Rnis 属名 种名 株系 编号 （四）（四）IIII型限制性核酸内切酶的基本特点型限制性核酸内切酶的基本特点 1、识别位点的特异性、识别位点的特异性 每种酶都有其特定的每种酶都有其特定的DNA识别识别 位点，通常是由位点，通常是由48个核苷酸组成的特定序列（靶个核苷酸组成的特定序列（靶 序列）。序列）。 2、识别序列的对称性、识别序列的对称性 靶序列通常具有双重旋转

10、对称靶序列通常具有双重旋转对称 的结构，即双链的核苷酸顺序呈回文结构。的结构，即双链的核苷酸顺序呈回文结构。 3、切割位点的规范性、切割位点的规范性 交错切或对称切（可形成粘性末端或平末端的交错切或对称切（可形成粘性末端或平末端的DNA 分子）。分子）。 能识别外源能识别外源DNA并将其水解的内切核酸酶，是细菌对外源并将其水解的内切核酸酶，是细菌对外源 DNA的防御机制。的防御机制。 几种几种IIII型限制性核酸内切酶的酶切位点型限制性核酸内切酶的酶切位点 Pst IProvindencia stuartii 164 CTGCAG GACGTC Haemophilus influenzae R

11、d 与与II型核酸内切酶有关的几个概念型核酸内切酶有关的几个概念 粘性末端粘性末端 cohesive ends是指是指DNA分子在限制酶的作用之下形成分子在限制酶的作用之下形成 的具有互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的具有互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间 的配对而重新环化起来。的配对而重新环化起来。 平平 末末 端端 Blunt endBlunt end在识别序列对称处同时切开在识别序列对称处同时切开DNADNA分子两条链，分子两条链， 产生的平齐末端结构。则不易于重新环化。产生的平齐末端结构。则不易于重新环化。 同裂酶同裂酶 isoschizomersis

12、oschizomers 能识别和切割同样的核苷酸靶序列的能识别和切割同样的核苷酸靶序列的 不同来源的内切酶。不同同裂酶对位点的甲基化敏感性有差别。不同来源的内切酶。不同同裂酶对位点的甲基化敏感性有差别。 同尾酶同尾酶 isocaudamersisocaudamers 识别的靶序列不同，但能产生相同粘识别的靶序列不同，但能产生相同粘 性末端的一类限制性核酸内切酶。如性末端的一类限制性核酸内切酶。如BamH I 、BclI、BglII和和 Xho I 是一组同尾酶。是一组同尾酶。 平齐末端 带带5P端的黏性末端端的黏性末端带带3OH 和和5P端的平末端端的平末端 例如例如Hpa和和Msp是同裂酶，

13、识别顺序都是是同裂酶，识别顺序都是 5C|CG G3 3G GC|C5 如果其中有如果其中有5-甲基胞嘧啶，甲基胞嘧啶，Hpa不能够切割，不能够切割，MspI能切割。能切割。 同裂酶切割DNA时，产生相同的粘末端，故被切割得DNA可重组并且重组后 产生两种情况A.B,如图： MobI BamHI BglII 5NGATCN3 5NGGATCCN3 5NAGATCTN3 3NCTAGN5 3NCCTAGGN5 3NTCAAGAN5 5N GATCCN3 5NG GATCTN3 3NCTAG GN5 3NCCTAG AN5 5NGATCCN3 5NGCATCTN3 CTAGGN5 CGTAGAN5

14、 A: 可被MobI识别切割，但不被 B:重组DNA,-不能被上述酶识别 BamHI识别切割。 与切割。 注意 限制性内切酶对外源限制性内切酶对外源DNADNA的作用无种属特一性：对不的作用无种属特一性：对不 同的外援同的外援DNA,DNA,只要有酶的识别顺序即可切割只要有酶的识别顺序即可切割DNADNA产生产生 相同的粘末端或平截末端，据此可进行相同的粘末端或平截末端，据此可进行DNADNA的重组。的重组。 在在A A情况下产生的重组体只能被一种酶消化，减少了情况下产生的重组体只能被一种酶消化，减少了 可逆反应，提高了重组率。转化后还可以用可消化的可逆反应，提高了重组率。转化后还可以用可消化

15、的 那种酶那种酶(Mob)(Mob)进行酶切鉴定。进行酶切鉴定。 在在B B情况下，产生重组体。不能再被两种酶识别，消情况下，产生重组体。不能再被两种酶识别，消 除了可逆反应，效率更高。但转化后不能再用这两种除了可逆反应，效率更高。但转化后不能再用这两种 酶鉴定。通常选酶鉴定。通常选A A的情况。的情况。 4. 不具有甲基化功能不具有甲基化功能 II型限制性核酸内切酶的甲基化修饰作用型限制性核酸内切酶的甲基化修饰作用 由相应的甲基化酶承担。由相应的甲基化酶承担。 5. 对单链对单链DNA的切割的切割 切割效率较低。切割效率较低。 酶活单位酶活单位 一个限制酶单位一个限制酶单位（U）指：指：在理

16、想的反应条件（适在理想的反应条件（适 宜的缓冲液和反应温度，通常为宜的缓冲液和反应温度，通常为37）下，）下，1h内内中完中完 全降解全降解1 g DNA所需要的酶量。所需要的酶量。 （五）限制性核酸内切酶的消化反应（五）限制性核酸内切酶的消化反应 酶酶 切切 反反 应应 的的 基基 本本 步步 骤骤 电泳紫外分析37 1h加反应液 CKM Buffer (10) 2.0 L ddH2O 约约16.5 L DNA 0.21.0 g Enzyme 12U Volume 20.0 L 1.0kb 1.0kb 0.4kb 0.5kb 0.6kb CKMT T 反应反应 体系体系 混匀混匀 最适温度最

17、适温度,酶量酶量, 时间时间,反应终止反应终止 电泳鉴定结果电泳鉴定结果 在在“非最适的非最适的”反应条件下反应条件下, ,有些核酸内切限制酶识有些核酸内切限制酶识 别序列的特异性便会发生别序列的特异性便会发生“松动松动”，从其，从其“正确正确”识别序识别序 列以外的其它位点切割列以外的其它位点切割DNADNA分子，这种现象叫星号活性，分子，这种现象叫星号活性， 用用* *表示。表示。 限制性内切酶的第二活力限制性内切酶的第二活力 （Secondary activitySecondary activity，又称星号活力），又称星号活力） 指改变了酶的反应条件，使酶原有的识别特异性的指改变了酶的

18、反应条件，使酶原有的识别特异性的 降低。降低。 例如：例如：EcoRIEcoRI的典型特异性是核苷酸序列的典型特异性是核苷酸序列GAATTCGAATTC，当改变，当改变 此酶的反应条件时，他的特异性由原来的此酶的反应条件时，他的特异性由原来的6 6核苷酸降低为核苷酸降低为 四核苷酸四核苷酸AATTAATT。 星号活力的产生可为酶提供新的序列特异性，星号活力的产生可为酶提供新的序列特异性， 这些活性在某些情况下可能是有用的，但是很少这些活性在某些情况下可能是有用的，但是很少 导致第二识别位点的完全或同等的切割，因此为导致第二识别位点的完全或同等的切割，因此为 了避免星活力的出现，所有限制性酶切反

19、应均应了避免星活力的出现，所有限制性酶切反应均应 在标准条件下，通常反应条件通过缓冲液控制。在标准条件下，通常反应条件通过缓冲液控制。 （六）影响限制性核酸内切酶活性的因素（六）影响限制性核酸内切酶活性的因素 影响酶活性的因素很多，最重要的有：影响酶活性的因素很多，最重要的有： 酶纯度酶纯度 DNA的纯度的纯度 DNA的甲基化程度的甲基化程度 酶切反应的温度与时间酶切反应的温度与时间 DNA DNA的分子结构的分子结构 限制性核酸内切酶的缓冲液限制性核酸内切酶的缓冲液 （1）酶纯度）酶纯度 引起某些酶活力变化的因素较多，包括甘油的浓度，离子的 浓度，PH值，有机溶剂的存在，二价阳离子过高的酶和

20、DNA浓度 的比例。 （2）DNA纯度纯度 铂，酚铂，酚 ，氯仿，酒精，氯仿，酒精，EDTAEDTA，SDSSDS，盐离子，盐离子 等均影响酶活性。等均影响酶活性。 纯度不高，含有蛋白，特别是纯度不高，含有蛋白，特别是DNaseDNase加入加入 BufferBuffer时因有时因有MgMg2+ 2+ ，而激活降解 ，而激活降解DNADNA样品，而无特样品，而无特 异带。异带。 解决办法：解决办法：扩大反应体积扩大反应体积 20 L50 L 延长酶作用时间延长酶作用时间 1h数小时数小时 增加酶用量增加酶用量 1u10u （3 3）DNA甲基化程度甲基化程度 甲基化程度高不被大多数限制性内切酶

21、切甲基化程度高不被大多数限制性内切酶切 割，解决办法是：割，解决办法是： 选用无甲基化酶的突变菌株；选用无甲基化酶的突变菌株； 使用对甲基化酶碱基无切割能力的酶（对哺乳使用对甲基化酶碱基无切割能力的酶（对哺乳 动物动物DNA）。）。 （4）酶切反应的温度与时间）酶切反应的温度与时间 所有限制性内切酶均应在标准条件下进行，大多所有限制性内切酶均应在标准条件下进行，大多 数最适反应温度是数最适反应温度是37，少数耐热，少数耐热 Taq是是65； Sma 是是25 （30 ）。反应时间与酶量有关。反应时间与酶量有关。 （5）DNA分子的构型分子的构型 不同构型的影响很大：消化超螺旋环状不同构型的影响

22、很大：消化超螺旋环状DNA用的酶量大用的酶量大 于线性于线性DNA 不同位点切割能力不同不同位点切割能力不同 （6）限制性核酸内切酶的反应缓冲液）限制性核酸内切酶的反应缓冲液 Mg2+，Tris-HCl，NaCl或或KCl -巯基乙醇或二硫苏糖醇巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)(防止酶氧化防止酶氧化,以保持活性以保持活性) BSA（牛血清白蛋白）稳定酶蛋白。（牛血清白蛋白）稳定酶蛋白。 （七）其它水解核酸的酶 1. 水解RNA的核酸酶(Rnase):种类很多介绍五种 酶名称 来源 最适PH 作用特点 反应式 应用 RNaseA 胰脏 7.9 切嘧啶产生 ApUpCpNp RNA测序 3p嘧啶核苷

23、 酸或以其结 ApUp+Cp+Np 尾的寡核苷酸 RNaseT1 米曲霉 4.5 切G产生3Gp GpGpApCpGp 同上 或以其为结尾 的寡核苷酸 Gp+Gp+ApCpGp RNaseU2黑曲霉 4.5 切A产生3AP GpApCpApAp 同上 或以其结尾的 寡核苷酸片段 GpAp+CpAp+Ap RNasephy头绒孢菌 不切C产生3Ap, GpApCpUpGp 同上 3Gp,3Up或以其 为结尾片段 GpApCpUpGp RNaseH 大肠杆菌 水解DNA-RNA杂交 分子中的RNA 2 核酸酶S 来自稻谷曲霉 高度特异性于单链核酸的内切酶：可催化单链 RNA或DNA，降解成5单核苷

24、酸。同时也可作用于 双链核酸分子的单链区（小到一个碱基）。 作用： 测定杂交分子（DNA-DNA)或(RNA-DNA)的杂交 程度，即使是一对碱基没杂交也能检测到。 cDNA合成时去掉第一连与第二连的发夹结构 测定DNA上内含子的位置 （一）一）DNA连接酶的概念与作用机制连接酶的概念与作用机制 （二）二） 连接酶种类及特性的比较连接酶种类及特性的比较 （三）三） DNA连接酶作用的特点连接酶作用的特点 （四）四） DNA连接酶的反应条件连接酶的反应条件 （五）五）影响连接反应的因素影响连接反应的因素DNA连接的策略连接的策略 （六）六）T4 DNA连接酶对目的连接酶对目的DNA片段和片段和

25、载体连接的一般方案载体连接的一般方案 二、二、 DNA连接酶及其应用连接酶及其应用 DNADNA重组的核心技术：重组的核心技术：DNADNA片段之间的体外连接片段之间的体外连接 连接酶。连接酶。 （一）（一）DNA连接酶的概念与作用机制连接酶的概念与作用机制 环形环形DNADNA分子的发现使科学家相信一定有一种能连分子的发现使科学家相信一定有一种能连 接这种切口的酶存在。接这种切口的酶存在。 首个首个DNADNA连接酶连接酶(ligase)(ligase)19671967年，年，大肠杆菌大肠杆菌DNA连连 接酶接酶，是大肠杆菌基因编码是大肠杆菌基因编码 。 1970年，发现了年，发现了T4DN

26、A连接酶连接酶 ， 由大肠杆菌由大肠杆菌T4噬菌体噬菌体 基因编码的。基因编码的。 概念：概念： DNA连接酶（连接酶（Ligase） 能够催化两条能够催化两条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶。链之间形成磷酸二酯键的酶。 DNA连接酶的催化反应连接酶的催化反应 DNA ligase + NAD+/ATP 酶酶-AMP复合物复合物 +DNA AMP-DNA 相邻相邻3-OH对活化的磷原子发生对活化的磷原子发生 亲核攻击亲核攻击 AMP 3,5-磷酸二酯键磷酸二酯键 DNA 连接酶连接的作用机制连接酶连接的作用机制 （二）连接酶种类及特性的比较（二）连接酶种类及特性的比较 最常用最常用 （三）（三）

27、DNA连接酶作用的特点连接酶作用的特点 A.A. 连接的连接的两条链两条链必须分别具有自由必须分别具有自由3-OH3-OH和和5-P5-P， 而且这两个基团彼此而且这两个基团彼此相邻相邻； B. B. 在羟基和磷酸基团间形成磷酸二酯键是一种耗能在羟基和磷酸基团间形成磷酸二酯键是一种耗能 过程。过程。 E.coli DNA连接酶连接酶 连接具互补碱基黏性末端连接具互补碱基黏性末端(最初研究表明），最初研究表明）， 现在研究可连接平末端；需现在研究可连接平末端；需NAD+辅助因子，活性低，不常用。辅助因子，活性低，不常用。 T4DNA连接酶连接酶连接具互补碱基黏性末端和平末端，连接具互补碱基黏性末

28、端和平末端， 需需ATP辅助因子，活性高，常用。辅助因子，活性高，常用。 是双链是双链因此不能将两条单链连接起来或使单链环化因此不能将两条单链连接起来或使单链环化 起来。起来。 OH P 是相邻的是相邻的因此不能封闭因此不能封闭gap，只能封闭，只能封闭nick. gap NO Nick OK （四）（四）T4 DNA连接酶连接反应的条件连接酶连接反应的条件 连接酶反应体系连接酶反应体系 体系体系 T T载体载体 粘末端粘末端 平末端平末端 1010Buffer 1L 1/2L 1/2LBuffer 1L 1/2L 1/2L vector 50ng 3-30fmol 15-60fmolvect

29、or 50ng 3-30fmol 15-60fmol Insert fragment 100ng 9-90fmol 45-180fmolInsert fragment 100ng 9-90fmol 45-180fmol Ligase 0.5L 0.5/1L 0.5/1LLigase 0.5L 0.5/1L 0.5/1L Add ddHAdd ddH2 2O to total 10L 10/20L 10/20LO to total 10L 10/20L 10/20L 反应温度反应温度 4/16 4-8/RT 15-204/16 4-8/RT 15-20 反应时间反应时间 1h-1h-过夜过夜 4

30、h-4h-过夜过夜/3h 4h-/3h 4h-过夜过夜 酶的灭活酶的灭活 75 15min75 15min 连接液灭活后最好立即转化或储存于连接液灭活后最好立即转化或储存于4-8，时间不要太长，会降低转化率。，时间不要太长，会降低转化率。 DNA末端的浓度末端的浓度 较高浓度的较高浓度的DNA，利于分子间连接，形成线性二聚，利于分子间连接，形成线性二聚 体或多聚体分子。体或多聚体分子。 温度（通常在温度（通常在4-16 4-16 ） ATPATP的浓度的浓度(10molL 1molL ) 连接酶浓度（连接酶浓度（一般平末端大约需一般平末端大约需1 12U2U，粘末端仅需，粘末端仅需 0.1U0

31、.1U） 反应时间（通常连接过夜）反应时间（通常连接过夜） 插入片段和载体片段的摩尔比（插入片段和载体片段的摩尔比（ 1 1 1 15 5 1 1） （五）（五）影响连接反应的因素影响连接反应的因素 （六）（六）T4 DNA连接酶对目的连接酶对目的DNA片段片段 和载体连接的一般方案和载体连接的一般方案 1连接反应一般在灭菌的连接反应一般在灭菌的0.2-0.5ml离心管中进行。离心管中进行。 210l体积反应体系中：取载体体积反应体系中：取载体50-100ng，加入一定，加入一定 比例的外源比例的外源DNA 分子（一般线性载体分子（一般线性载体DNA分子与外源分子与外源 DNA分子摩尔数为分子

32、摩尔数为1 15 1），补足），补足ddH2O 至至8l。 3轻轻混匀，稍加离心，轻轻混匀，稍加离心，56水浴水浴5min后，迅速转入后，迅速转入 冰浴。冰浴。 4加入含加入含ATP的的10Buffer 1l，T4 DNA连接酶合适连接酶合适 单位，单位， 用用ddH2O 补至补至10l，稍加离心，在适当温度，稍加离心，在适当温度 （一般（一般14-16）连接）连接8-14hr。 粘性末端粘性末端DNA片段的连接片段的连接DNA连接酶连接法连接酶连接法 Nick Nick 平末端平末端DNA片段的连接末端同聚物加尾法片段的连接末端同聚物加尾法 3 35 53 35 5 末端核苷酸转移酶末端核苷

33、酸转移酶 +dATP+dTTP 3 35 5 3 35 5 AAAAA TTTT DNADNA聚合酶聚合酶和和 T4DNAT4DNA连接酶连接酶 平末端平末端DNA片段的连接衔接物连接法片段的连接衔接物连接法 衔接物衔接物(linker)(linker)，也叫接头，也叫接头，是有人工化学合成的一段是有人工化学合成的一段10-10- 1212个核苷酸组成，具有有个核苷酸组成，具有有1 1个或几个限制性酶切位点的平末端的个或几个限制性酶切位点的平末端的 双链寡核苷酸短片段。双链寡核苷酸短片段。 GGATCC CCTAGG + BamHI切割切割 GATCC G 连接酶经连接酶经BamHI切割的切割

34、的pBR322 G CCTAG BamHI衔接物衔接物 dsDNA GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG 连接酶连接酶 重组重组DNA分子分子 GATCC G G CCTAG 如何避免单酶切后产生的相同如何避免单酶切后产生的相同 的粘末端或平末端的自身环化？的粘末端或平末端的自身环化？ （一）大肠杆菌（一）大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I （二）（二）Klenow片段酶片段酶 （三）（三）T4 DNA聚合酶聚合酶 （四）逆转录酶（反转录酶）（四）逆转录酶（反转录酶） 三、三、DNA聚合酶及其应用聚合酶及其应用 （一）（一） 大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I （E.Coli D

35、NA pol I） 是是Kornberg A. 1956年首先从大肠杆菌年首先从大肠杆菌E。Coli 细胞中分离细胞中分离 出来的。它是一种多功能性的酶，包括出来的。它是一种多功能性的酶，包括 3 3种不同的酶活力：种不同的酶活力： 5- 3聚合酶活性聚合酶活性 （模板，（模板， 带带3OH游离基团的引物、游离基团的引物、 4dNTPs、 Mg2+ ） 双链特异性的双链特异性的53核酸外切酶活性核酸外切酶活性 35核酸外切酶活性。核酸外切酶活性。 A. 从游离的双链或单链从游离的双链或单链DNA的的3端降解。不过对于双链的降解可端降解。不过对于双链的降解可 被被5-3的多聚活性所抑制。主要是校

36、正作用。的多聚活性所抑制。主要是校正作用。 CCG GGCTATCGGA CCG GGCTATCGGA Pol I + Mg2+ 4dNTPs ATAGCCT CCGATAGCCT GGCTATCGGA CCGATAGCCT GGCTA CCGATAGCCT GGCTATCGGA Pol I + Mg2+ 4dNTPs CCGATAGCCT GGCTA Pol I + Mg2+ T 大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I 的三种用途的三种用途 A. 利用缺口转移法制备高比活度的利用缺口转移法制备高比活度的DNA探针探针 利用其利用其53的外切酶活性及其聚合酶活性。的外切酶活性及其聚合酶活性。 B

37、. 用于用于DNA连接前的大缺口填充连接前的大缺口填充 利用利用5 3的聚合酶活性。的聚合酶活性。 C. 用于用于DNA的序列分析的序列分析 利用利用5 3的聚合酶活性。的聚合酶活性。 大肠杆菌聚合酶大肠杆菌聚合酶I的应用示例的应用示例 缺口平移法制备探针缺口平移法制备探针 Pol I + Mg2+32P dNTPs （二）（二） Klenow片段酶片段酶 KlenowKlenow片段片段是大肠杆菌聚合酶是大肠杆菌聚合酶 I I 全酶经枯草杆菌蛋全酶经枯草杆菌蛋 白酶处理后产生的大片段酶分子，分子量为白酶处理后产生的大片段酶分子，分子量为76KD 76KD 。 酶催活性：酶催活性：5 3 5

38、3 的聚合酶活性的聚合酶活性 3 3 5 5 的核酸外切酶活性的核酸外切酶活性 CCGATAGCCT GGCTA CCGATAGCCT GGCTA Klenow+Mg2+ KlenowKlenow片段的主要用途（片段的主要用途（利用利用5 3 5 3 的聚合酶活性）的聚合酶活性） 修补限制性酶消化修补限制性酶消化DNADNA形成的形成的33隐蔽末端隐蔽末端 标记标记DNADNA片段的末端片段的末端 底物用底物用32 32P P dNTPsdNTPs cDNAcDNA克隆中第二链克隆中第二链cDNAcDNA的合成的合成 DNADNA序列的测定序列的测定 （三）（三） T4DNA聚合酶聚合酶 T

39、T4 4DNADNA聚合酶是聚合酶是 从从T4T4噬菌体感染了的大肠杆菌中分离出来的，噬菌体感染了的大肠杆菌中分离出来的， 酶催活性：酶催活性： 5353的聚合酶活性的聚合酶活性 3 5 3 5 的核酸外切酶活性。的核酸外切酶活性。其外切酶活性要比大肠杆菌其外切酶活性要比大肠杆菌 聚合酶聚合酶 I I 的活性高的活性高200200倍。倍。比比Klenow Klenow 片段酶片段酶强强1001001,0001,000倍。倍。 因此，可以综合利用这两种活性进行因此，可以综合利用这两种活性进行取代合成取代合成反应：反应： 如果反应体系中仅存在一种如果反应体系中仅存在一种dNTPdNTP或没有底物时

40、，这时或没有底物时，这时T4DNAT4DNA聚合聚合 酶就会表现出酶就会表现出3 5 3 5 外切酶活力，从双链外切酶活力，从双链DNADNA的的33开始降开始降 解，直到露出底物解，直到露出底物dNTPdNTP相同的碱基。然后就在此位置发生合成和相同的碱基。然后就在此位置发生合成和 取代反应。取代反应。 CGTCGC GCAGCG CGTCGC GCAGCG dTTP Mg+ CGT GCAGCG 32P dNTPs Mg+ T4DNA聚合酶的用途聚合酶的用途 1 1、利用取代合成反应制备探针、利用取代合成反应制备探针 2 2、标记具有平末端的或具有、标记具有平末端的或具有33隐蔽末端隐蔽末

41、端 的的DNADNA片段片段 利用较强的利用较强的3 5 3 5 外切酶活性和外切酶活性和 5353聚合活性聚合活性 3 3、用于、用于DNADNA序列分析序列分析双脱氧终止法对长双脱氧终止法对长 片段片段DNADNA进行测序的理想用酶。进行测序的理想用酶。 （四）（四） 逆转录酶逆转录酶Reverse transcriptase 逆转录酶逆转录酶 是一种依赖是一种依赖RNARNA的的DNADNA聚合酶。聚合酶。 1970年H.M.Temin（美）和D.Baltimore(美)同时分别 从禽成髓细胞瘤病毒和鼠白血病病毒中发现了AMV RT和 Mo-MLV RT , 1975年二人共获诺贝尔生理

42、医学奖。 目前两个酶已经商品化生产。 功能：多功能酶，主要有三种酶活性： 依赖于RNA的DNA聚合酶功能。 RNaseH功能：水解DNA-RNA杂交分子 中的RNA链。 依赖于DNA的DNA聚合酶功能。 AMV-RT与与Mo-RT在结构、作用特点上不完全相同，在在结构、作用特点上不完全相同，在cDNA文库构建中讲述。文库构建中讲述。 oligo(dT) 5 3 DNA链链 3 5 RNA E活性活性1 4dNTP 3 5 RNA链链 DNA链链 RNaseH (活性活性2) E(活性活性3） 4dNTP 3 ds-DNA 5 5 3 3 ds-DNA 5 5 3 SI核酸酶核酸酶 （一）末端转移酶（一）末端转移酶（terminal transferase） （二）二） SI核酸酶（核酸酶（SI nuclease） （三）碱性磷酸酶三）碱性磷酸酶 四、修饰性工具酶四、修饰性工具酶 （一）末端转移酶（一）末端转移酶 l末端转移酶是一类不依赖于末端转移酶是一类不依赖于DNA模板的模板的DNA聚聚 合酶。合酶。 l特性：特性：该类酶可以在没有模板链存在的情况下，该类酶可以在没有模板链存在的情况下， 将核苷酸连接到将核苷酸连接到dsDNA或或ssDNA的在的在3OH。 特别是对于平末端的双链特别是对于平末端的双链DNA末端加尾十分有用。末端加尾十分有用。 l最常见的用途：最常见的用途：给