基础生物化学：第13章 DNA的生物合成

1、第十二章 DNA的生物合成 本章重点介绍遗传中心法则和本章重点介绍遗传中心法则和DNA半保半保 留复制方式，掌握复制的化学反应和复制留复制方式，掌握复制的化学反应和复制 方向，以及参与方向，以及参与DNA复制的酶和蛋白质因复制的酶和蛋白质因 子，掌握子，掌握DNA复制的基本过程。了解逆转复制的基本过程。了解逆转 录及逆转录酶，了解录及逆转录酶，了解DNA突变及修复方式突变及修复方式 。 思考思考 DNA是绝大多数生物体遗传信是绝大多数生物体遗传信 息的载体，继息的载体，继1953年年Watson & Crick提出提出DNA双螺旋结构模型后，双螺旋结构模型后， 1958年，年，Crick提出了

2、提出了“中心法则中心法则” (Central dogma)揭示了遗传信息的揭示了遗传信息的 传递规律。传递规律。 we had found the secret of life 遗传信息传递的中心法则遗传信息传递的中心法则 蛋白质蛋白质 逆转录逆转录 翻译翻译 转录转录 复制复制 复制复制 DNA RNA 生物的遗传信息以密码的形式储存在生物的遗传信息以密码的形式储存在 DNA分子上，表现为特定的核苷酸排列顺分子上，表现为特定的核苷酸排列顺 序。在细胞分裂的过程中，通过序。在细胞分裂的过程中，通过DNA复复 制制把亲代细胞所含的遗传信息忠实地传递把亲代细胞所含的遗传信息忠实地传递 给两个子代细

3、胞。在子代细胞的生长发育给两个子代细胞。在子代细胞的生长发育 过程中，这些遗传信息通过过程中，这些遗传信息通过转录转录传递给传递给 RNA，再由，再由RNA通过通过翻译翻译转变成相应的转变成相应的 蛋白质多肽链上的氨基酸排列顺序，由蛋蛋白质多肽链上的氨基酸排列顺序，由蛋 白质执行各种各样的生物学功能，使后代白质执行各种各样的生物学功能，使后代 表现出与亲代相似的遗传特征。后来人们表现出与亲代相似的遗传特征。后来人们 又发现，在宿主细胞中一些又发现，在宿主细胞中一些RNA病毒能以病毒能以 自己的自己的RNA为模板为模板复制复制出新的病毒出新的病毒RNA ，还有一些，还有一些RNA病毒能以其病毒能

4、以其RNA为模板合为模板合 成成DNA，称为，称为逆转录逆转录，这是中心法则的这是中心法则的 补充。补充。 中心法则总结了生物体内遗传信息的流动规律，揭示遗传的分子基础，不仅使人中心法则总结了生物体内遗传信息的流动规律，揭示遗传的分子基础，不仅使人 们对细胞的生长、发育、遗传、变异等生命现象有了更深刻的认识，而且以这方面们对细胞的生长、发育、遗传、变异等生命现象有了更深刻的认识，而且以这方面 的理论和技术为基础发展了基因工程，给人类的生产和生活带来了深刻的革命。的理论和技术为基础发展了基因工程，给人类的生产和生活带来了深刻的革命。 ？ 目目 录录 第一节第一节 半保留复制半保留复制 第二节第二

5、节 DNA的生物合成的生物合成 第三节第三节 DNA的损伤与修复的损伤与修复 第四节第四节 DNA重组重组 第一节第一节 半保留复半保留复 制制 （DNA指导下的指导下的DNA合成合成） DNA在复制过程中首先是在复制过程中首先是 两条链间的氢键断裂，然后双两条链间的氢键断裂，然后双 链解开。接着再以每一条链为链解开。接着再以每一条链为 模板，按照碱基互补配对原则模板，按照碱基互补配对原则 （A:T,G:C）, 由由DNA聚合酶催聚合酶催 化合成新的互补链。这样新形化合成新的互补链。这样新形 成的两个成的两个DNA分子与原来的分子与原来的 DNA分子的碱基序列完全相同。分子的碱基序列完全相同。

6、 每个子代每个子代DNA中的一条链来自中的一条链来自 亲代亲代DNA，另一条链则是新合，另一条链则是新合 成的，这种复制方式称为成的，这种复制方式称为半保半保 留复制留复制。 DNA半保 留复制的 实验依据 19581958年年Meselson Meselson & stahl& stahl用同位素用同位素 示踪标记示踪标记/ /密度梯密度梯 度离心技术度离心技术实验实验, , 证明了证明了DNADNA是采取是采取 半保留的方式进半保留的方式进 行复制行复制. 第二节第二节 DNA的生物合成的生物合成 一一DNA合成的通式及方向合成的通式及方向 二二参与参与DNA复制的酶和蛋白因子复制的酶和蛋

7、白因子 三三原核生物原核生物DNA复制的过程复制的过程 四四真核生物真核生物DNA复制的过程复制的过程 五五逆转录作用逆转录作用（RNA指导下的指导下的DNA的合成）的合成） DNA合成的通式及方向合成的通式及方向 DNA合成是以4种dNTP(N=A, T, G, C)为底物，在DNA聚合酶的 催化下，向DNA的3-OH添加脱氧核苷酸使链延长的过程。 1.1. DNADNA聚合酶聚合酶(DNA polymerases)(DNA polymerases) 2.2. DNADNA解旋酶解旋酶(DNA helicase(DNA helicase) ) 3.3. 单链结合蛋白单链结合蛋白(single

8、-strand (single-strand binding protein,binding protein,SSBSSB) )：结合在：结合在 解开的解开的DNADNA单链上，防止重新形单链上，防止重新形 成双螺旋。成双螺旋。 4.4. 拓扑异构酶拓扑异构酶(topoisomerase(topoisomerase):):兼兼 具内切酶和连接酶活力，能迅速具内切酶和连接酶活力，能迅速 将将DNADNA超螺旋或双螺旋紧张状态超螺旋或双螺旋紧张状态 变成松驰状态，便于解链。变成松驰状态，便于解链。 5.5. 引物酶引物酶(primase(primase) )和引发体和引发体 (primosome(

9、primosome) )：启动：启动RNARNA引物链的引物链的 合成。合成。 6.6. DNADNA连接酶连接酶（DNA ligaseDNA ligase） 大肠杆菌有三大肠杆菌有三 种种DNA聚合酶聚合酶 分子量分子量 每个细胞的分子统计数每个细胞的分子统计数 5 -3 聚合酶作用聚合酶作用 3 -5 核酸外切酶作用核酸外切酶作用 5 -3 核酸外切酶作用核酸外切酶作用 聚合速度聚合速度(核苷酸核苷酸/分分) 持续合成能力持续合成能力 主要功能主要功能 Pol Pol Pol 109,000 400 + + + 1000-1200 3-200 DNA修复修复 RNA引物切除引物切除 120

10、,000 100 + + - 2400 1500 DNA修复修复 400,000 10-20 + + - 15000-60000 500000 DNA复制复制 比较项目比较项目 DNA聚合酶聚合酶 DNA聚合酶聚合酶 DNA聚合酶聚合酶 DNA polymerase I 大片段(Klenow fragment) 小片段 5 -3 聚合酶作用聚合酶作用 3 -5 核酸外切酶作用核酸外切酶作用 5 -3 核酸外切酶作用核酸外切酶作用 DNA polymerase III DNA helicase If I were an enzyme, I would be DNA helicase , so I

11、 could unzip your genes Single-stranded DNA binding protein from M. tuberculosis, M. leprae and M. megmatis SSB primase A primosome is a complex of seven proteins: DnaG primase, DnaB helicase, DnaC helicase assistant, DnaT, PriA, Pri B, and PriC. DNA Ligase ligase from many bacteria http:/www.rcsb.o

12、rg/pdb/static.do?p=education_disc ussion/molecule_of_the_month/pdb55_1.html 1. 不能催化单链DNA连接 2. 必须具有粘性末端双链DNA，而不是平齐末端 3. 羟基和磷酸基团必须相邻 topoisomerase cuts one strand of a DNA double helix and then reanneals the cut strand. cuts both strands of one DNA double helix, passes another unbroken DNA strand thro

13、ugh it, and then reanneals the cut strand Type IType II 原核生物原核生物DNA复制的过程复制的过程 DNADNA复制的复制的起点和起点和方式方式 DNA链的合成与延长 终止终止 DNA复制的复制的起点和起点和方式方式 复制叉的推进复制叉的推进 环状环状 DNA复制复制 时所形成的时所形成的Q结结 构构 起始点起始点 双向复制双向复制 GATCTNTTNTTT 成串排列的成串排列的 三个三个13bp序列序列 共有序列共有序列共有序列共有序列 TTATCCACA DnaA蛋白结合位点蛋白结合位点 四个四个9bp序列序列 DnaA DnaB (

14、解螺旋酶解螺旋酶) SSB E.Coli DNA复制起点在起始阶段的结构模型复制起点在起始阶段的结构模型 DNA链的合 成与延长 复制叉的复制叉的 移动方向移动方向 拓扑异构酶拓扑异构酶 DNA聚聚 合酶合酶III 解链酶解链酶 RNA引物引物 引物酶引物酶 DNA聚聚 合酶合酶I SSB 3 3 5 前导链前导链 滞后链滞后链 3 5 5 RNA引物引物 3 3 终终 止止 Mg2+ 连接酶连接酶 ATP或或NAD PPi或或NMN A TC G P TT PPP A A CCT GA P AC PPPP OH TG G A TC G P TT PPP A A CCT GA P AC PPP

15、 TG G P 缺口(nick） 3 35 5 5 53 3 模板链模板链 模板链模板链 Poli I切除RNA引物 Ligase 连接DNA DNA复制过程是一个高度精确的过程，据估计，复制过程是一个高度精确的过程，据估计， 大肠杆菌大肠杆菌DNA复制复制109-1010碱基对仅出现一个误差，碱基对仅出现一个误差， 保证复制忠实性的原因主要有三点保证复制忠实性的原因主要有三点: a、DNA聚合酶的高度专一性（严格遵循聚合酶的高度专一性（严格遵循 碱基配对原则）碱基配对原则） b、DNA聚合酶的校对功能聚合酶的校对功能（错配碱基被（错配碱基被3-5 外切酶切除）外切酶切除） c、起始时以、起始

16、时以RNA作为引物作为引物 DNA聚合酶的校对功能聚合酶的校对功能 聚合酶聚合酶 错配碱基错配碱基 复制方向复制方向 正正 确确 核苷酸核苷酸 5 5 5 5 5 5 3 3 3 3 3 3 切除错配切除错配 核苷酸核苷酸 DNADNA聚合酶的聚合酶的3 3 - 5- 5 外切酶水解位点外切酶水解位点 3 3 5 5 错配碱基错配碱基 3 - 5 核酸外切核酸外切 酶水解位点酶水解位点 DNA聚合酶的聚合酶的5 - 3 外切酶水解位点外切酶水解位点 真核细胞真核细胞DNA复制的特点复制的特点 多个起点复制多个起点复制 起起 点点 起起 点点 起起 点点 起起 点点 起起 点点 起起 点点 端粒

17、（端粒（telemeretelemere）复制）复制 真核和原核真核和原核DNA细胞复制比较细胞复制比较 端粒酶（端粒酶（telomerase） DNA复制需要引物，但在线形复制需要引物，但在线形DNA分子末端不可能分子末端不可能 通过正常的机制在引物被降解后合成相应的片段通过正常的机制在引物被降解后合成相应的片段.如果没如果没 有特殊的机制合成末端序列，染色体就会在细胞传代中有特殊的机制合成末端序列，染色体就会在细胞传代中 变得越来越短。这一难题是通过端粒酶的发现才得到了变得越来越短。这一难题是通过端粒酶的发现才得到了 澄清，端粒酶是一种含澄清，端粒酶是一种含RNA的蛋白复合物，实质上是一的

18、蛋白复合物，实质上是一 种逆转录酶，它能催化互补于种逆转录酶，它能催化互补于RNA模板的模板的DNA片段的合片段的合 成，使复制以后的线形成，使复制以后的线形DNA分子的末端保持不变。分子的末端保持不变。 初步研究表明，人体中生殖细胞的端初步研究表明，人体中生殖细胞的端 粒长度保持不变，而体细胞的端粒长度粒长度保持不变，而体细胞的端粒长度 则随个体的老化而逐步缩短。对此的一则随个体的老化而逐步缩短。对此的一 个推论是：人的生殖细胞具端粒酶的活个推论是：人的生殖细胞具端粒酶的活 力，体细胞则否。这一问题的解决无疑力，体细胞则否。这一问题的解决无疑 会有助于对生命衰老的认识会有助于对生命衰老的认识

19、。 5 3 AAAACCCCAAAACCC C C C A 端粒酶端粒酶 端粒合成的一种模型端粒合成的一种模型 3 5 TTTTGGGGTTTTG 5 3 AAAACCCCAAAACCC C C C A AA 3 5 TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTG 5 3 AAAACCCCAAAACCC C C C A AA T T G G G T G G G T 3 5 AA TTTTG 5 3 AAAACCCCAAAACCC C C C A GTTTTG 整合整合 移位移位 端粒合成的完成端粒合成的完成 TTTTGGGG TTTTGGGG TTTTGGGGTTTT 5 3 n AA 3 TTT

20、TGGGG TTTTGGGG TTTTGGGGT 5 3 T T CCCCT n AA3 TTTTGGGG TTTTGGGG TTTTGGGGT 5 3 T T AAAACCCC AAAACCCC AAAACCCCT n 进一步加工进一步加工 继续继续 延伸延伸 1 1、概念、概念 2、逆转录酶、逆转录酶 3、病毒逆转录过程病毒逆转录过程 4 4、逆转录的生物学意义逆转录的生物学意义 扩充了中心法则扩充了中心法则 有助于对病毒致癌机制的了解有助于对病毒致癌机制的了解 与真核细胞分裂和胚胎发育有关与真核细胞分裂和胚胎发育有关 逆转录酶是分子生物学重要工具酶逆转录酶是分子生物学重要工具酶 三种功能

21、三种功能 依赖依赖DNA指导下的指导下的DNA聚合酶活力聚合酶活力 依赖依赖RNA的的DNA聚合酶活力聚合酶活力 核糖核酸酶核糖核酸酶H活力活力 以以RNARNA为模板合成为模板合成DNADNA，这与，这与 通常转录过程中遗传信息从通常转录过程中遗传信息从 DNADNA到到RNARNA的方向相反，故称的方向相反，故称 为逆转录作用。为逆转录作用。 逆转录过程中逆转录过程中cDNA的合成的合成 依赖依赖RNA的的 DNA聚合酶聚合酶 核糖核酸核糖核酸 酶酶H活力活力 依赖依赖DNA的的 DNA聚合酶聚合酶 逆逆转录病毒的生活周期逆转录病毒的生活周期 生活周期 RNA 衣壳衣壳 被膜被膜 逆转逆转

22、 录酶录酶 转录转录 转译转译 整合入宿主细胞染色体整合入宿主细胞染色体DNA 进入细胞进入细胞 丢失被膜丢失被膜 丢失衣壳丢失衣壳 逆转录逆转录 RNA RNA cDNA 衣壳蛋衣壳蛋 白白 被膜蛋被膜蛋 白白 逆转录逆转录 酶酶 某些物理（紫外线、电离辐射）和化学或生物某些物理（紫外线、电离辐射）和化学或生物 学因素的作用，或者由于生物体学因素的作用，或者由于生物体DNA复制过程出现复制过程出现 异常均可引起异常均可引起DNA分子的损伤或改变。如果分子的损伤或改变。如果DNA损损 伤不能修复，对体细胞可能影响其功能或生存，对伤不能修复，对体细胞可能影响其功能或生存，对 生殖细胞则可能影响到

23、其后代。生殖细胞则可能影响到其后代。 一、一、类型类型 碱基对的置换碱基对的置换(substitution) 移码突变移码突变(framesshift mutation) 暗修复暗修复 二、二、 （1）光裂合酶修复光裂合酶修复 （2）切除修复切除修复 （3）重组修复重组修复 （4）诱导修复诱导修复（SOSSOS修复）修复） -T-C-G-G-C-T-G-T-A-C-G- -A-G-C-C-G-A-C-A-T-G-C- 转换转换 A -T-C-G-C-T-G-T-A-C-G- -A-G-C-G-A-C-A-T-G-C- 缺失缺失 T 野生型基因野生型基因 -T-C-G-A-C-T-G-T-A-C

24、-G- -A-G-C-T-G-A-C-A-T-G-C- -T-C-G-T-C-T-G-T-A-C-G- -A-G-C-A-G-A-C-A-T-G-C- 颠换颠换 碱基对的置换碱基对的置换 (substitution) -T-C-G-A-G-C-T-G-T-A-C-G- -A-G-C-T-C-G-A-C-A-T-G-C- 插入插入 移码突变移码突变 (framesshift mutation) DNA紫外线损伤的光裂合酶修复紫外线损伤的光裂合酶修复 A形成嘧啶二聚体形成嘧啶二聚体 B光复合酶结合光复合酶结合 于损伤部位于损伤部位 C修复后酶被释放修复后酶被释放 切除修复切除修复 碱基丢失碱基丢失碱基缺陷或错配碱基缺陷或错配 结构缺陷结构缺陷 切开切开 核酸内切酶核酸内切酶 核酸外切酶核酸外切酶切除切除 DNA聚合酶聚合酶 DNA连接连接酶酶 AP核酸内切酶核酸内切酶 核酸外切酶核酸外切酶 切开切开 切除切除 修复修复 连接连接 糖苷酶糖苷酶 插入酶插入酶 碱基碱基 取代取代 DNA的重组修复的重组修复 胸腺嘧啶胸腺嘧啶 二聚体二聚体 复制复制 核酸酶及核酸酶及 重组蛋白重组蛋白 修复复制修复复制 DNA聚合酶聚合酶 DNA连接酶连接酶 重组重组 SOS反应的机制反应的机制 靶基因表达靶基因