课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数.doc

1、土壤中分解尿素细菌的分离与计数知识清单一、研究思路1筛选菌株(1) 实验室中微生物筛选的原理人为提供有利于_ 生长的条件 ( 包括营养、 温度、 pH等 ) ，同时 _或_其他微生物生长。(2) 选择培养基在微生物学中， 将允许 _ 种类的微生物生长，同时 _或_其他种类微生物生长的培养基，称做选择培养基。(3) 分离分解尿素的细菌的选择培养基在该培养基配方中，为微生物的生长提供碳源的是_，琼脂的作用是凝固剂。_ ，提供氮源的是该培养基对微生物具有选择作用。其选择机制是_才能在该培养基上生长。土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们体内能合成_，将尿素分解的反应式是 _ 。Taq 细菌能忍受9

2、3左右的高温， 是在美国黄石国家公园的一个热泉中发现的，这说明，在寻找目的菌株时，要根据_ 。2统计菌落数目的方法(1) 稀释涂布平板法 ( 也叫活菌计数法 )原理： 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的_ ，通过统计平板上的 _，就能推测出样品中大约含有多少活菌。操作第一，设置重复组，增强实验的说服力与准确性。将待测样品经一系列10 倍稀释，然后选择 _稀释度的菌液，分别取0.1 mL 接种到已制备好的平板上，然后用无菌涂布器将菌液涂布整个平板表面，放在适宜的温度下培养并计算菌落数。为使结果接近真实值，可将同一稀释度涂布到三个或三个以上的平板上，培养并计算出

3、_ 。第二，为了保证结果准确，一般选择菌落数在_的平板进行计数，若设置的重复组中结果相差太远，意味着操作有误，需重新实验。计算公式：每克样品中的菌株数CVM，其中C 代表 _ ，V 代表 _(mL) ， M代表 _。(2) 显微镜直接计数法原理： 此法利用特定的_或 _ ，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量，但不能区分细菌的死活。计数板是一块特制的载玻片，上面有一个特22定的面积1 mm 和高 0.1 mm 的计数室，在1 mm的面积里又被划分成25 个 ( 或 16 个 ) 中格，每个中格进一步划分成16 个( 或 25 个) 小格，计数室由_个小格组成。操作：将稀释的样品滴在计数板

4、上，盖上盖玻片，然后在显微镜下计数45 个中格中的细菌数， 并求出每个小格所含细菌的平均数，再按公式求出每毫升样品中所含的细菌数。计数公式：每毫升原液所含细菌数每小格平均细菌数40010 000 稀释倍数。(3) 设置重复和对照设置重复： 培养过程中应设置重复组，同一稀释度下应涂布_个平板， 才能增强实验的说服力与准确性。设置对照： 实验中应设置对照，主要目的是 _ 对实验结果的影响， 提高实验结果的可信度。 如_ 对照组，观察培养物中是否有杂菌污染； 设置_培养基，观察选择培养基是否具有 _作用。二、实验设计实验步骤1土壤取样：从肥沃、湿润的土壤中，用无菌小铁铲铲去表层土3 cm 左右，迅速

5、取土壤并装入 _密封或事先准备好的_中。2制备培养基：制备_ 培养基作为对照组，尿素为唯一氮源的培养基作为 _，用来判断选择培养基是否具有_。37_个选择培养基、_个牛肉膏蛋白胨培养基，因此需要15 个选择培养基和5 个牛肉膏蛋白胨培养基。两种培养基应各有一个作为_对照，此外还需准备8 个灭菌的试管和1 个灭菌的移液管。3样品的稀释与涂布平板：参考下面的实验流程示意图，将10 g 土样加入盛有90 mL无菌生理盐水的锥形瓶中( 锥形瓶体积为250 mL) ，充分摇匀，吸取上清液1 mL，转移至盛773有_ mL 生理盐水的无菌大试管依次等比稀释至10 稀释度，并按照由10 10 稀释度的顺序分

6、别吸取_mL 进行平板涂布操作。按照浓度从低到高的顺序涂布平板，不必更换移液管。说明：图中的1、2、3 平板是 _， 4 为 _ 作对照，判断选择培养基是否具筛选作用，还有两个空白对照，即不涂布稀释后菌液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基，验证培养基中是否_。4将涂布好的培养皿放在30温度下培养，及时观察和记录。5挑选选择培养基上不同形态的菌落接入含_培养基的斜面中，观察能否产生颜色反应。6细菌的计数当菌落数目稳定时，选取菌落数在 _的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对3 个平板进行重复计数，然后求出_，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。同时仔细观察所分离到的菌落，并记录菌落特征

7、。7统计表格表一平板上的菌落数记录表稀释倍数10310410510610712341234123412341234123?表二菌落特征记录表菌落形状大小隆起颜色种类程度123?注：一般来说， 在一定的培养条件下( 相同的培养基、温度及培养时间) ，_表现出 _的菌落特征。三、操作提示1取土样用的小铁铲和盛土样的信封在使用前都要_。2应在 _旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入_中，塞好棉塞。3在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在_旁操作。4实验时要对 _做好标记。注明 _等。5为了提高效率，在操作时更加有条不紊，应当_ 。四、结果分析与评价内容结论分析有无杂菌污染的对照的培养皿中 _菌落生长

8、未被杂菌污染培养物中菌落数 _被杂菌污染判断菌落形态多样，菌落数偏高培养物中混入_选择培养基的筛牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数目_选择培养基的数目选择培养基具选作用筛选作用，已筛选出一些菌落样品的稀释操作得到 2 个或 2 个以上菌落数目在_的平板操作成功，能进行菌落的计数重复组的结果若选取同一种土样，统计结果应_；如果结果相差太远，说明实验操作过程中出现操作失误，需要找出产生差异的原因五、课题延伸在细菌分解尿素的化学反应中， 细菌合成的 _将尿素分解成了 _。氨会使培养基的碱性增强， _升高。因此， 我们可以通过检测培养基_ 来判断该化学反应是否发生。在以尿素为唯一氮源的培养基中加入_指示剂，培

9、养某种细菌后， 如果 pH 升高，指示剂将 _，这样，我们就可以准确地鉴定该种细菌能够分解尿素。土壤中分解尿素细菌的分离与计数知识清单一、 1.(1) 目的菌株抑制 阻止(2)特定抑制阻止(3) 葡萄糖尿素只有能够以尿素作为氮源的微生物脲酶CO(NH)脲酶 H OCO 2NH 它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找222232(1) 一个活菌菌落数三个菌落平均数30 300某一稀释度下平板上生长的平均菌落数涂布平板时所用的稀释液的体积稀释倍数(2)细菌计数板血细胞计数板400(3) 至少 3 排除实验组中非测试因素空白完全筛选二、 1.(1)无菌信封烧杯(2)牛肉膏蛋白胨实验组选择作用 3 1空白(3)90.1