重组Ecoli生产类人胶原蛋白发酵调控策略与500L中试规模放大方法优化

1、重组Ecoli生产类人胶原蛋白发酵调控策略与500L中试规模放大方法优化西北大学博士学位论文重组E.coli生产类人胶原蛋白发酵调控策略与 500L中试规模放大方法优化姓名：薛文娇申请学位级别：博士专业：生物化工指导教师：范代娣20090610西北大学博士学位论文中文摘要本研究旨在建立一套完整的重组Escherichiacoli生产类人胶原蛋白(human, likecollagen. H LC)的中试规模生产工艺，并通过对各单元操作从实验室规模到中 试规模的放大研究，为进一步将该工艺放大到工业生产奠定基础。重组Eco li的高密度培养是HLC生产过程的核心单元，其放大的成功与否直接关系到整个

2、工艺过程。 为了明确影响发酵过程的 关键因素，从而选择合适的放大准则和方法， 本文对发酵过程中二氧 化碳和乙酸的影响进行了系统研究。尽管有大量文献表明，二氧化碳对重组Eco li发酵有负面影 响，然而关于二氧化碳对重组Ecoli， 特别是重组蛋白表达方面 的定量研究却未见报道。本研究采用二氧化碳脉冲法首次考察了重组 Eco li生长不同阶段二氧化碳浓度对重组蛋白生产的影响。研究结果表明，当在分批培养阶段施加浓度为2 0%(v/v)二氧化碳 脉冲时，细胞生长明显受到抑制；而在补料阶段引入该脉冲时，却引 起了比生长速率的小幅上升；二氧化碳对HLC表达的抑制只发生在 HLC的表达阶段，即在蛋白表达诱

3、导阶段引入浓度为2 0%(v/v)二氧化碳脉冲3小时，贝卩最终HLC浓度下降33.9%。尽管 二氧化碳脉冲的浓度越高，作用时间越长，其相应的抑制或促进作用 也越明显，但当二氧化碳脉冲浓度小于等于10%时， 对发酵过程却 几乎没有影响。然后，针对重组Eco li发酵过程的关键问题一乙酸抑制作了 系统研究。研究结果表明，在分批培养阶段乙酸对Eco li细胞有 明显的抑制作用，但在补料培养阶段，其影响却并不明显；而乙酸对 HLC表达的抑制只发生在HLC的表达阶段。 本文首次建立了这一 评价重组Eco li细胞生长不同阶段乙酸影响的方法。 而建立该法 的理论依据就是在葡萄糖饥饿阶段，重组Eco li细

4、胞可以利用乙 酸。为此，本研究也首次讨论了在细胞生长不同阶段，利用葡萄糖饥 饿以诱导乙酸吸收对发酵过程的影响。在发酵放大过程中，合适的种子扩大培养过程的建立对于成功的 放大也至关重要。为了建立最优的种子扩大培养过程， 本研究考察了三级种子不同移种阶段和不同种子培养基浓度对发酵过程的影响。结果表明：在对数期后期移种，HLC产率最咼；另外，当种子培养基 葡萄糖浓度为2 0/L时，其后发酵过程所需的培养时间较短，HL C表达量较高，HLC平均产率最高，达到0 .5189/L/h。由乙酸的相关研究可知，乙酸对本表达体系具有较强的抑制作用， 因而本研究建立了以控制乙酸产生为根本目的的溶氧探测补料技术，

5、该技术具有很强的适应性，可在不中文摘要同的环境中迅速得到发酵过程的最佳补料方案。 采用溶氧探测补 料技术，在实验室规模获得的最终细胞干重和HLC浓度分别为6 9.19/L和13. g,/L，该值与以前根据比生长速率优化 的结果基本一致。而放大到中试规模时，尽管乙酸浓度和实验室规模 基本相同，优化诱导时机后获得的HLC表达水平也基本相同，但最终细胞干重和HLC浓度有一定程度下降， 分别为51.79/L和9.69/L。直接放大后HLC产量下降的原因之一可能是不同规模发酵罐 氧传递能力不同所致。针对该问题，通过测定不同规模发酵罐的体积 氧传递系数，并建立了体积氧传递系数对操作参数(通气量、搅拌速 度

6、和装液量)的关联方程，使得不同规模的发酵罐在氧的传递方面具 有可比性。实验室小规模发酵罐kLa值对操作参数的经验关联式为：(kLa) L=0.0111Qn3185NL5131VL 以中试规模发酵罐kLa值对操作参数的经验关联式为：（kLa）P=0.2690Q0.2983N1.2727V Ln枷最后，根据体积氧传递系数的关联方程，分别以kLa和p決k La为放大基准进行放大。由于本发酵体系对二氧化碳较不敏感， 中 试规模（5 0 0 L）中加压操作得到了成功应用。即以pkLa为 放大基准进行放大规模的不诱导的分批. 补料培养，最终获得的细胞 干重为7 7.9 9 /L，略低于实验室规模培养获得的

7、细胞干重（8 0.39/L），也低于以kLa为放大基准获得的中试规模培养的 最终细胞干重（9 0.oect,）。但以pkLa为基准放大，初 始装液量（285L）远高于以kLa为基准放大时的初始装液量 （1 0 5L）;诱导培养后，最终细胞干重达到6 8.4 9 /L，最终H LC浓度为13.09/L，基本同实验室规模。此外，本文还建立了 HLC中试纯化工艺， 并对其中影响蛋白收 率和蛋白纯度的主要工艺单元：高压匀浆、沉淀、超滤及离子交换层 析进行了放大研究。结果表明，高压匀浆不用改变任何操作参数可直 接放大；超滤过程仅改变和膜面积相关参数也可得到满意的放大结果； 对于沉淀单元，由于搅拌釜装置变

8、化，在中试规模重新优化了沉淀时 间：即沉淀7 0mi n后纯化效果最好； 保持线速度恒定进行层析单 元的放大也获得了较好结果。中试规模纯化工艺得到HLC的纯度为 9 5.4%，收率为65.4%，与实验室规模纯化结果相比（HL C纯度与收率分别为9 6.4%,71.7%）仅略有下降。关键词重组大肠杆菌，类人胶原蛋白，二氧化碳脉冲，乙酸，氧传递，中试放大ii西北大学博士学位论文英文摘要髓猃 aimofthisinvestigationWil lstodevelopaprocessforproduct ionofonhumanlikecollagen (HLC) byr ecombinantlaya

9、Escherichiacolipilot sc ale. Inaddition, thestudywouldso undbasisforscalinguptoproduc tionscalefurther, throughscale upinvestigationsforunitoperat ionsoftheprocess.Highcelldensitycultureofrec ombinantEcoliisthekeyunitforH LCproductionanditsscaleupper formancewoulddeterminethewhol eprocessefficiency.

10、 Tofindthekechosethescaleupcriteriafactorsinfluencingthefermentatio nprocessandthusandacetateOilandmethodprope d5theeffectsofcarbondioxideCarbondioxideplaysaHLCprodu ctionwasstudiedfirstly. majorro leinbothaerobicandanaerobicfe rmentations.However,culturefewliteraturesfocusedon氇eeffectsofcarbontarge

11、tproteindioxi 如 onrecomb inant 互coliandproduction. Inthis paper, asystematicstudywasiniti allycarriedoutwiththemethodtoinvestigatetheinflu enceofcarbondioxideC02oncarbondioxidepulsecult ivationsystemofinjecfionthere combinant 置coli. mpulse 蠲ectionex perimentsshowedthat:l_) a20%C02pulseintroducedinth

12、ebatchcultivationphasesinhib itedcellgrowthobviouslywhilet hatintroducedinthefedbatchcu ltivationphasesstimulatedcell growthinhibitoryeffectofC02onslightly; and2) HLCexpressionoccurre donlyintheexpressionphase, wher etheby33。 9%underafinalHLCconcentrationdecreased3h20%C02puls e.Meanwhile,thehigherth

13、eC02concentrationan d/orthelongerthedurationofthe C02pulses, thestrongerthestimul atoryorinhibitoryeffects. Howev er,theC02concentrationbelowhadlittleinfluenceonorequaltol0%theHLCproduction.Then, asystematicstudywascardedouttodeterminetheeffectsofa cetateonthehighcelldensitycul tureofrecombinantEcol

14、icontain ingHLCmRNA. Inthisstudy, theeffe ctsofacetateassimilationthrou gha 番ucoseastarvationperiodatdifferen tcellgrowthphaseswereinitiall yinvestigatedinfedbatchcultu reofrecombinantEcoli。 Theresult sshowedthatonacetateassimilationwasobs ervedwithoutnegativeeffectsstarvationperiodtheprocessd uring

15、aglucoseintroducedatalld efinedcellgrowthphasesexceptf orthepostinductionphase。 Inadd ition, anewmethodforevaluatingt heeffectsofacetateWasdevelopm entbasedontheabovefindings:theacetateconcentrationwascontro lledbyaddingacetateintocultur e西北大学博士学位论文Finally, thescale upfermentat ionsbasedOilkLaandpkL

16、awereca rriedoutrespectively, according tothecorrelationsforkLacalcul ation. Becausetherecombinantsys temwaslesssensitivitytotheC02, pressurizedculturewassuccessf ulfortheHLCproduction. Thatis, f orthenon.inducedcultivation thefinalonthepilot scalebas edontheconstantpkLascaleupc riteria,onDCWandwas7

17、7. 9g/L, whichWassimila rtolowerthanthethat(80.3g/L)ob tainedthelabscaleoncultivati onvalue(90.0g/L)obtainedinthep ilot scalebasedtheconstantkLascaleupcriteria. However, theinitialmediumvolu mefortheformer ( 2 8 5 L) wasmuchhig herthanthelatter(105L) . Thefina 1DCWandHLCconcentrationwere6 8.4g/Landl

18、3. Og/Lrepectively,wh ichweresimilartothoseobtained onthelabscale, fortheinducedcu ltivationonthepilot scale.onTheprocess majorforHLCpurificationunit sthepilotscalewasalsodevelop edinthisrecoveryandstudy. Theop erationinfluencingHLCpuritywe rehomogenization, precipitation, ultrafiltrationandCM52chro

19、mat ography. Thescale upinvestigati onshowedlargerscalefortheareathat, l) theoperationparam eterscouldbedirectlytransferr edtothemembranehomogenization; 2)theproportionallyforoperationp arametersrelatedtothewere, incr easedwasscaling UPtheultrafil trationprocess; 3) theprecipitat iontimeoptimizedtha

20、nthatonthepilot scaleand theoptimizedprecipitationw. as7 Omin, whichislittlehigherthelab scale; 4) CM52chromatographysca ling upbasedononconstantlinea rvelocitywassuccessful. Thepuri tyandrecoveryofHLCreached95. 4%, 65.4%,repectively,whichweredec reasedslightlycomparedtothose (theputityandrecoverywe

21、re96. 4%, 71.7%,respectively)obtainedont helab scale.KeywordsRecombinantEcoli, human likec ollagen,CO2pulse,acetate,oxyge ntransfer,scaleupV英文摘要mediaand/oremployedaglucose starvationandthustheeffectsof acetateatdifferentcellongrowthphaseweredetermine d. Experimentalresultsshowthato bviousacetateinhi

22、bitioncellgrowthoccurredinthephas esofbatchculturewhileitsinhib itoryeffectonHLCexpressionocc urredonlyintheexpressionphase.Thedevelopmentofasuitablein oculumisimportanttotheferment ationprocess. Tooptimizetheinoc ulumpreparationprocess, thethir dinoculumtransferstageandmedi umweredetermined.TheWasr

23、esultsshowedthatHLCprod uctivityWashighestwhentheHlir datlatelyexponentiMinoculumtr ansferredstage; inaddition, when theglucoseconcentrationWas20g/L, thefol lowingfermentationtimeWasshor testandthefinalHLCconcentrati0. 518washighest, andthustheHLCaverageproductivitywashighes t(achievedg/L/h) .aAceta

24、tehadSOastrongnegativeinfluenceo ntheHLCproductionaccordingtot hiswork,tocontrolfeed backacetatecontrolledmethodthat theprobingfeedingstrategyWasd evelopedWastheproduction. Theme thodonemployedtomaintaindissolv edoxygenconcentrationatthesam elevelfinalbothlaboratoryscaleand pilotscalefermentations.

25、TheonD CWof69. lg/LandHLCconcentration ofl3.1g/Lwereobtainedresultsarethelaboratoryfina lscale.andthe51. 7g/Lsimilartothatoptimize dinthepreviousof9. 6g/Lwereobta inedstudy. TheonDCWofandHLCconc entrationthepilot scaleuponop timizationofinductiontiming.Thereasonforthedecreaseinth eHLCproductiononthe

26、pilotscale maybethelowervolumetricmasstransferoxyge ntransferrateforthepilot ? scale coefficientkLakLaonfermentor. Therefore, the differentscalefermentorswasde terminedandthecorrelationsbet weentherateandoperationparame ters(aeration,stirreroxygentransferandinitialmed iumvolume)werecouldbedevelope d

27、.Andthusthecapacitiesfordiffe rentfermentorscompared. ThecorrelationsforkLaonthelab scalefermentoriS,(kLa)L=0.OlllQ0.3185Nl5lVL n4舳3AndthecorrelationsforkLaonthepilot scalefermentoris, (kLa)P=0.2690Q0.29S3N他 72 7VLm404西北大学学位论文知识产权声明书本人完全了解西北大学关于收集、保存、使用学位论文的规定。 学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。 本人允许论文被查阅和借阅。本人授权西北大学可以将本学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索， 可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研 究所等机构将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库或其它 相关数据库。保密论文待解密后适用本声明。学位论文作者签名：簦玺蝰学位论文作者签名：藿立酶1指导教 师签名：1墨丛翌翌1竺笪：墅：型指导教师签名：）矿矿7）年多月，矿日口/尹年多月，口日西北大学学位论文独创性声明本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，