动物细胞培养生物制药

1、小组成员：叶春宇、马培培、江永新、严峻叶春宇、马培培、江永新、严峻 第第1111章章 11.5 11.5 动物细胞传代培养动物细胞传代培养 11.6 11.6 细胞系与细胞株细胞系与细胞株 11.7 11.7 动物细胞大规模培养动物细胞大规模培养 11.8 11.8 动物细胞生物制药动物细胞生物制药 11.5 11.5 动物细胞传代培养动物细胞传代培养 传代培养：是指将原代培养的细胞继续转接培养的过程。细传代培养：是指将原代培养的细胞继续转接培养的过程。细 胞的体外大量增殖以及细胞系的建立是通过传代培养实现的。胞的体外大量增殖以及细胞系的建立是通过传代培养实现的。 通常情况下，传至通常情况下，

2、传至510代以内的细胞称为次代培养细胞，传代以内的细胞称为次代培养细胞，传 至至1020代以上的细胞称为传代细胞系。代以上的细胞称为传代细胞系。 动物细胞体外培养： 组织获得与消化、接种、原代培养、传代培养 一般情况下，当传至一般情况下，当传至10105050代后，细胞增殖逐渐缓慢，最终完全代后，细胞增殖逐渐缓慢，最终完全 停止，之后进入衰退期。停止，之后进入衰退期。 动物细胞培养过程生长曲线动物细胞培养过程生长曲线 11.5.1 传代培养方法传代培养方法 11.5.2 11.5.2 传代培养过程分析传代培养过程分析 生长过程经历：潜伏期、指数生长期、减速期、生长过程经历：潜伏期、指数生长期、

3、减速期、 平台期、衰退期平台期、衰退期 培养期间，每培养期间，每12天需要对细胞做常规检查，天需要对细胞做常规检查， 包括：是否污染、细胞生长状况、培养液包括：是否污染、细胞生长状况、培养液PH 传代培养过程分析包括细胞形态检查及活力分析与 营养液PH及污染检查。 细胞形态检查细胞形态检查 将培养瓶放在倒置显微镜下观察。将培养瓶放在倒置显微镜下观察。 状态良好的细胞：轮廓形态不十分清晰，较透明。状态良好的细胞：轮廓形态不十分清晰，较透明。 生长不良的细胞：轮廓变清晰，细胞间隙生长不良的细胞：轮廓变清晰，细胞间隙 增大，胞内有空泡、脂增大，胞内有空泡、脂 滴、颗粒等。细胞形态滴、颗粒等。细胞形态

4、 不规则不规则。 细胞活力分析细胞活力分析 MTT法简单、快速、准确、广泛应用于新药筛选、法简单、快速、准确、广泛应用于新药筛选、 细胞毒性试验、肿瘤放射敏感性试验等方面细胞毒性试验、肿瘤放射敏感性试验等方面 采用MTT法。 活细胞的线粒体脱氧氢酶能将四唑盐还原成不溶于水的蓝紫 色产物甲暨并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲 亚砜（DMSO）能溶解蓝紫色结晶物，溶液 颜色深浅与所含甲暨量成正比。用酶标仪测 定OD570nm值就可以分析活细胞数量。 营养液营养液PH及污染检查及污染检查 含血清的新鲜培养液呈桃红色，PH在7.27.4之间。 一段时间后，CO2的积累使培养液PH下降，当超出缓

5、冲范围时， 培养液变黄，需要34d更换一次培养液。 CO2培养箱能自动控制5%的CO2含量。 易出现微生物污染。 细菌污染时培养液变浑浊，镜检可见。 PPLO因个体小，能透过滤器，污染时培养物无变化，不易发现。 严格遵守无菌操作。 培养瓶口盖需拧松或用无菌纱布棉塞以保证透气。 11.6 细胞系与细胞株细胞系与细胞株 细胞系：由原代培养经传代培养纯化，获得细胞系：由原代培养经传代培养纯化，获得 的能在体外生存的细胞群体。的能在体外生存的细胞群体。 有限细胞系与连续细胞系有限细胞系与连续细胞系 一个报道的细胞株应包括：培养简历、冻存液、一个报道的细胞株应包括：培养简历、冻存液、 细胞活力、培养液、

6、细胞形态类型、核型、无污细胞活力、培养液、细胞形态类型、核型、无污 染检测、物种检测、免疫检测、细胞建立者染检测、物种检测、免疫检测、细胞建立者 细胞株：从一个经过生物学鉴定的细胞系用细胞株：从一个经过生物学鉴定的细胞系用 单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细 胞增殖形成的细胞群胞增殖形成的细胞群 11.6.1 分离纯化与保存分离纯化与保存 体外原代培养一般都是多种类型的细胞混合生长，必须经过细体外原代培养一般都是多种类型的细胞混合生长，必须经过细 胞纯化得到单一种类细胞进行功能、形态等研究胞纯化得到单一种类细胞进行功能、形态等研究 1、自然纯化：无法根

7、据实际需求选择细胞，费时费力 2、人工纯化 细胞因子依赖法 反复贴壁法 酶消化法 机械法 3、克隆化培养 毛细管法 有限稀释法 细胞保存多采用冻存、低温液氮冻存 11.6.2适合工业化生产的细胞株适合工业化生产的细胞株 1、原代细胞： 2、二倍体细胞： 需要大量动物组织、成本高、费时费力 二倍体染色体，具有贴壁和接触抑制特性，有限的繁殖能 力，无致瘤性 具有两亲本特征 4、基因工程细胞： 3、融合细胞： 将编码药用蛋白质的基因重组到动物细胞构建工程菌 5、转化细胞： 体外可无限传代和生长繁殖，遗传、生长、 生物学特性可能改变 从生产方式上可分为细胞自转化和人工诱发转化 6、常用细胞株： CHO

8、细胞Vero cell BHK-21细胞W-38细胞 11.7 动物细胞大规模培养动物细胞大规模培养 Text Text Text 细胞大规模培养是指在生物反应器中高密度大量培养细胞用于生细胞大规模培养是指在生物反应器中高密度大量培养细胞用于生 产生物制品的技术产生物制品的技术 近几十年，人类对生长激素、干扰素、单克隆抗体、疫苗及白细胞介素等 生物制品的需求不断增加，传统方法已不能满足这一需求。因此，迫切需 要建立动物细胞大规模培养技术。自20世纪70年代以来，细胞培养用生物 反应器有了很大的进展，推动了动物细胞大规模培养技术的发展。目前贴 壁培养系统主要有转瓶（管）、微载体系统、中空纤维、玻

9、璃珠等。 11.7.1 转瓶（管）培养系统转瓶（管）培养系统 welcome to use these PowerPoint templates, New Content design, 10 years experience 一般用于小量培养到大规模培养的过渡阶段一般用于小量培养到大规模培养的过渡阶段 采用专门设计的细胞培养转瓶机和不同规格的转瓶进行培养采用专门设计的细胞培养转瓶机和不同规格的转瓶进行培养 有专门设计的旋转系统和不同规格的旋转管有专门设计的旋转系统和不同规格的旋转管 在转管培养的基础上为扩大培养而改进的在转管培养的基础上为扩大培养而改进的 优点：结构简单、投资少、技术成熟、重

10、复性好、优点：结构简单、投资少、技术成熟、重复性好、 放大只需简单地增加转瓶（管）数量放大只需简单地增加转瓶（管）数量 缺点：劳动程度大、占地空间大、单位体积提供细缺点：劳动程度大、占地空间大、单位体积提供细 胞生长的表面积小、细胞生长密度低、培养时监测胞生长的表面积小、细胞生长密度低、培养时监测 和控制环境条件受限和控制环境条件受限 11.7.2 微载体培养微载体培养 welcome to use these PowerPoint templates, New Content design, 10 years experience 1967年，维尔茨（van Wezel）开发了微载体系 统。

11、 微载体系统将传统的一维平面贴附扩展为三维立 体贴附，摆脱了传统的培养瓶（管）的限制。 同时，微载体使利用生物反应器进行动物细胞大 规模培养成为可能，既能满足动物细胞的贴壁要 求，又能充分利用生物反应器的内部空间。 微载体使直径微载体使直径60250m60250m的适用的适用 于贴壁依赖型细胞生长的微珠于贴壁依赖型细胞生长的微珠 理想的微载体应具备以下几个特征：理想的微载体应具备以下几个特征： 良好的生物相容性，无毒无害 有好的黏附性，一般带正电荷 大的比表面积，颗粒均匀，孔径均一 良好的传质性能 强的机械性能，长时间搅拌状态下不破碎，能保护细胞，方便 清洗处理，重复利用 好的热稳定性，在12

12、1蒸汽灭菌条件下不分解、不破碎、不 软化，适合高压灭菌 微载体的分类微载体的分类 实心微载实心微载 体体 多孔微载体多孔微载体 概念 细胞能贴附在微载体表 面生长 内部具有网状结构的小 孔，细胞能在微载体内 部生长 优点 易于细胞在表面贴壁， 机械强度高，容易接种 操作 比表面积更大，使细胞 免受机械损伤，得到的 细胞浓度高，可降低血 清用量，可以采用高的 搅拌速度和通气量 缺点 细胞浓度低，细胞容易 受剪切力、搅拌、碰撞 等影响，细胞易老化脱 落 容易产生营养传递障碍， 积聚代谢副产物 微载体的制作方法微载体的制作方法 制作方法包括：高温烧结法、聚合物快速凝聚法、高分子材料成球聚合法、锐孔喷

13、 冷冻凝固法 微载体培养基本流程微载体培养基本流程 1、选择合适的微载体类型： 2、浸泡水化及消毒： 3、接种： 4、培养观察与细胞计数： 5、传代培养： 6、细胞消化与收获： 微载体培养应注意的一些问题微载体培养应注意的一些问题 贴附率问题 细胞损伤问题 搅拌问题 传代问题 微载体质量与成本问题 微载体生物反应器培养的优点微载体生物反应器培养的优点 模拟了体内三维生长环境，减轻了接触性抑制，细胞可以 多层生长 表面积/体积（S/V）大，单位体积培养液的细胞产率高 把悬浮培养和贴壁培养融合在一起，兼有两者的优点 培养液可以循环使用，利用率高 放大容易，劳动度小 细胞接种、收获简便 生物反应器空

14、间利用率高，培养系统节省空间 动物细胞培养的生物反应器动物细胞培养的生物反应器 11.7.3 中空纤维生物反应器培养中空纤维生物反应器培养 welcome to use these PowerPoint templates, New Content design, 10 years experience 中空纤维生物反应器（hollow fiber bioreactor）是理查 德克瑞克（Richard Kncazek）等在1972年发明的。最初 使用的空心纤维是一种由醋酸纤维素和硝酸纤维素混合组 成的可透性膜，表面有许多海绵状多孔结构。这样，水分 子、营养物质和气体可以透过，细胞也能在上面贴

15、附生长。 柱状中空纤维反应器、板框式中空纤维反应器、中心灌流 式反应器 柱状中空纤维反应器柱状中空纤维反应器 板框式中空纤维反应器板框式中空纤维反应器 中心灌流式反应器中心灌流式反应器 11.7.4 大规模培养方式大规模培养方式 动物细胞大规模培养常采用的是：动物细胞大规模培养常采用的是： 流加式培养和灌流式培养流加式培养和灌流式培养 流加式培养 根据细胞对营养物质的不断消耗和需求，流加浓缩的营养可使细 胞持续生长至较高的密度，目标产物达到较高的水平。整个培养 过程没有培养液流出或细胞回收，通常在细胞进入衰亡期或衰亡 期后终止培养。 u流加原则是维持细胞生长相对稳定的营养条件，营养成分不过剩

16、不缺乏 u通常流加时间在指数生长期后，一次或多次 u对消耗快或浓度过高对细胞不利的成分注意及时和少量多次不加 u流加的营养成分主要有葡萄糖、谷氨酰胺、氨基酸、维生素等 灌流式培养 连续不断的灌注新的培养液，同时不断地排出旧培养液，细胞均 保留在反应器内的培养方式。 优点：（1）细胞截流在反应器内，可以维持较高的细胞密度，从 而提高了产品的产量 （2）反应速率容易控制，培养周期较长，可提高生产率， 目标产品回收率高 （3）细胞稳定地处在较好的营养环境中，可以去除氨、乳 酸、甲基乙二醛等有害代谢物质，减少细胞凋亡 （4）可连续性收获产品 不足：污染概率较高，在长期培养中细胞分泌产品的稳定性差，规

17、模放大过程中出现一些工程问题 11.7.5 动物细胞大规模培养的问题分析动物细胞大规模培养的问题分析 1、细胞代谢及产物抑制、细胞代谢及产物抑制 细胞培养过程中有害代谢产物产生的抑制是提高细胞细胞培养过程中有害代谢产物产生的抑制是提高细胞 密度的主要限制因素密度的主要限制因素 氨：抑制细胞生长的主要因素之一。来源于氨：抑制细胞生长的主要因素之一。来源于Gln的的 自然分解和细胞代谢所产生。自然分解和细胞代谢所产生。 乳酸：螯合钙离子，抑制谷氨酰胺酶，乳酸：螯合钙离子，抑制谷氨酰胺酶，渗透压，渗透压，PH，抑制细胞生长，抑制细胞生长 CO2：PH，对，对cell产生毒性作用或改变产生毒性作用或改

18、变cell代谢代谢 甲基乙二醛：有潜在的损伤作用甲基乙二醛：有潜在的损伤作用 2、培养基、培养基 是是cell赖以生长、增殖、分化的重要因素赖以生长、增殖、分化的重要因素 在经历了天然培养基、合成培养基后，无血清培养在经历了天然培养基、合成培养基后，无血清培养 基成为一种趋势基成为一种趋势 无血清培养基的优势在于避免了血清的批次、质量、成分等对无血清培养基的优势在于避免了血清的批次、质量、成分等对cellcell 培养造成的不确定因素及污染、毒性作用和不利于产品纯化等不良培养造成的不确定因素及污染、毒性作用和不利于产品纯化等不良 影响影响 无血清培养基并不适用于广泛的细胞类型，不同无血清培养基

19、并不适用于广泛的细胞类型，不同 类型的细胞或不同的细胞系或细胞株都有可能有类型的细胞或不同的细胞系或细胞株都有可能有 各自的无血清培养基组成各自的无血清培养基组成 在细胞早期培养阶段，细胞对于网速血清培养基的适应性往往具有特异性在细胞早期培养阶段，细胞对于网速血清培养基的适应性往往具有特异性 3、细胞凋亡、细胞凋亡 预防并控制细胞凋亡成为动物大规模培养的关键之一预防并控制细胞凋亡成为动物大规模培养的关键之一 细胞凋亡倒置死亡多是在营养成分耗尽、有害代谢产物增细胞凋亡倒置死亡多是在营养成分耗尽、有害代谢产物增 多时发生。谷氨酰胺的耗竭是常见的凋亡原因，凋亡一旦多时发生。谷氨酰胺的耗竭是常见的凋亡

20、原因，凋亡一旦 发生，不加谷氨酰胺已不能逆转发生，不加谷氨酰胺已不能逆转 动物细胞在无血清、无蛋白培养基中进行培养时，细胞变得更为脆弱，更动物细胞在无血清、无蛋白培养基中进行培养时，细胞变得更为脆弱，更 容易凋亡容易凋亡 可采用灌流式培养补充营养物，带走有害代谢产物来减缓细胞凋亡。可采用灌流式培养补充营养物，带走有害代谢产物来减缓细胞凋亡。 可采用基因工程方法将可采用基因工程方法将bcl-2基因（细胞凋亡抑制基基因（细胞凋亡抑制基 因）导入细胞抑制细胞凋亡，减少细胞特定营养物质因）导入细胞抑制细胞凋亡，减少细胞特定营养物质 的消耗、提高细胞密度和目的蛋白产量的消耗、提高细胞密度和目的蛋白产量

21、4、过程监控、过程监控 在线测定生物反应器中培养条件、代谢及目的产物浓在线测定生物反应器中培养条件、代谢及目的产物浓 度等数据，进行分析处理，及时进行反馈性控制是成度等数据，进行分析处理，及时进行反馈性控制是成 功进行大规模动物细胞培养的重要环节。功进行大规模动物细胞培养的重要环节。 渗透压：甘氨酸甜菜碱、三甲基甘氨酸或脯氨酸等渗透压保护剂在一定渗透压：甘氨酸甜菜碱、三甲基甘氨酸或脯氨酸等渗透压保护剂在一定 程度上能减轻高渗透压对细胞生长的抑制作用程度上能减轻高渗透压对细胞生长的抑制作用 微载体：足够的空间让细胞生长，提高贴附率微载体：足够的空间让细胞生长，提高贴附率 5、其他、其他 11.8

22、 动物细胞生物制药动物细胞生物制药 高等哺乳动物细胞可以很好表达修饰大分子的具高等哺乳动物细胞可以很好表达修饰大分子的具 有生物活性的蛋白产品有生物活性的蛋白产品 一批被一批被FDA批准的动物细胞制备的药物：胰岛素、批准的动物细胞制备的药物：胰岛素、 组织纤溶酶原激活剂、促进细胞生成素、白介素组织纤溶酶原激活剂、促进细胞生成素、白介素 等等 动物细胞生物制药已经成为疫苗、基因工程药物、动物细胞生物制药已经成为疫苗、基因工程药物、 抗体药物、蛋白药物等生物制品生产的重要技术抗体药物、蛋白药物等生物制品生产的重要技术 11.8.1病毒疫苗病毒疫苗 减毒活疫苗：减毒活疫苗： 基因缺失的减毒活疫苗：基

23、因缺失的减毒活疫苗： 灭活疫苗：灭活疫苗： 亚单位疫苗：亚单位疫苗： 流感病毒的包膜提取后制成的血凝素、神经氨酸酶亚单位疫苗流感病毒的包膜提取后制成的血凝素、神经氨酸酶亚单位疫苗 麻疹疫苗、风疹疫苗、黄热病疫苗、麻疹疫苗、风疹疫苗、黄热病疫苗、 狂犬病毒的胸苷激酶（狂犬病毒的胸苷激酶（TK） 缺失株（第一代）和缺失株（第一代）和gp3区缺失株（第二代）区缺失株（第二代） 流行性乙型脑炎疫苗、狂犬病疫苗、流行性乙型脑炎疫苗、狂犬病疫苗、 流感灭活疫苗流感灭活疫苗 基因工程亚单位疫苗：基因工程亚单位疫苗： 乙型肝炎病毒的表面抗乙型肝炎病毒的表面抗 原原HBsAg的基因在酵母的基因在酵母 CHO细胞

24、中表达的纯品细胞中表达的纯品 HBsAg多肽多肽 病毒疫苗生产需要注意的一些问题病毒疫苗生产需要注意的一些问题 培养病毒的细胞若有潜在的致癌性以及有支原体污培养病毒的细胞若有潜在的致癌性以及有支原体污 染均不能用于疫苗生产。染均不能用于疫苗生产。 选择病毒时，致病性低、选择病毒时，致病性低、 免疫效价高而持久、抗免疫效价高而持久、抗 原谱广、易增殖、便于原谱广、易增殖、便于 生产、可在传代细胞上生产、可在传代细胞上 增殖的病毒增殖的病毒 应尽量使细胞适应无血清培养基进行培养，消除含应尽量使细胞适应无血清培养基进行培养，消除含 血清培养基带来的过敏原。血清培养基带来的过敏原。 甲醛可去除病毒活性

25、，保持其抗原性。但甲醛能引甲醛可去除病毒活性，保持其抗原性。但甲醛能引 起疼痛和红肿，并释放组织胺，应减少甲醛浓度也起疼痛和红肿，并释放组织胺，应减少甲醛浓度也 要保证病毒活性消失要保证病毒活性消失 11.8.2 干扰素干扰素 干扰素是一种细胞因子，是真核细胞对各种刺激反应后形成的一组干扰素是一种细胞因子，是真核细胞对各种刺激反应后形成的一组 复杂的蛋白质。复杂的蛋白质。 1957年，英国的年，英国的Issacs和瑞士和瑞士Linderman在利用鸡胚绒毛尿囊膜研究流感干扰在利用鸡胚绒毛尿囊膜研究流感干扰 现象时发现病毒感染的细胞能产生一种因子，可干扰病毒的复制，将其命名为现象时发现病毒感染的细胞能产生一种因子，可干扰病毒的复制，将其命名为 干扰素。干扰素。 干扰素的生理作用干扰素的生理作用 广谱的抗病毒作用 抑制某些细胞的生长 免疫调节作用 抑制和杀伤肿瘤细胞 人白细胞干扰素IFN- 目前的人白细胞干扰素主要是基因工程干扰素 基因工程干扰素与血源性干扰素相比， 具有没有污染、安全性高、纯度高、比 活性高、成本低、疗效确切等优点 从人细胞中克隆出干扰 素基因，与大肠杆菌表达 载体连接构成重组表达质 粒，然后转化到大肠杆菌 中获得高效表达人干扰 素