基因工程基本操作程序

1、选修3 基因工程基本操作程序1 1 简述基因工程原理及基本操作程序简述基因工程原理及基本操作程序2 2 设计某一转基因生物的研制过程设计某一转基因生物的研制过程目的基因的目的基因的获取获取基因表达载体的基因表达载体的构建构建（关键）（关键）将目的基因将目的基因导入导入受体细胞受体细胞目的基因的目的基因的检测与鉴定检测与鉴定基因工程基本操作的四个步骤基因工程基本操作的四个步骤：2 2、获取目的基因的常用方法：、获取目的基因的常用方法：从自然界已有的物种分离从自然界已有的物种分离 人工方法合成人工方法合成(1)(1)从基因文库中直接获取从基因文库中直接获取 一、目的基因的获取一、目的基因的获取1

2、1、目的基因：、目的基因：（2 2）利用）利用PCRPCR扩增目的基因扩增目的基因（3 3）通过）通过DNADNA合成仪用化学方法直接人工合成合成仪用化学方法直接人工合成来源：来源：指编码蛋白质的基因或调控作用的因子指编码蛋白质的基因或调控作用的因子。在不知目的基因在不知目的基因序列的序列的情况下，情况下，依据基因的依据基因的特性特性获得所需的目的基因。获得所需的目的基因。需构建基因文库需构建基因文库如果如果需要大量的目的基因需要大量的目的基因，利用，利用PCRPCR扩增扩增基因较小、核苷酸序列已知基因较小、核苷酸序列已知2 2、获取目的基因的常用方法、获取目的基因的常用方法(1)(1)从基因

3、文库中直接获取从基因文库中直接获取 一、目的基因的获取一、目的基因的获取1 1、目的基因的来源、目的基因的来源基因文库的构建方法基因文库的构建方法 基因文库的分类：基因文库的分类：a a、一种生物的全部基因、一种生物的全部基因-基因组文库基因组文库( (总总) )b b、一种生物的部分基因、一种生物的部分基因-部分基因组文库部分基因组文库（c cDNADNA文库）文库）文库类型cDNA文库基因组文库文库大小_基因中启动子(具有启动作用的DNA片段)_基因中内含子(位于编码蛋白质序列内的非编码DNA片段)_基因多少某种生物的_基因某种生物的 基因物种间的基因交流可以部分基因可以小大无有无有部分全

4、部一、目的基因的获取（关键）一、目的基因的获取（关键）基因重组基因重组反转录酶反转录酶mRNAmRNAcDNAcDNA一、目的基因的获取一、目的基因的获取2 2、获取目的基因的常用方法、获取目的基因的常用方法(1)(1)从基因文库中直接获取从基因文库中直接获取 基因组文库（总）构建方法基因组文库（总）构建方法 cDNA(cDNA(互补互补DNA)DNA)构建方法：构建方法：人工合成法人工合成法（真核生物真核生物）直接分离法直接分离法（原核核生物）（原核核生物）逆转录法逆转录法: :化学合成法：化学合成法：如何筛选？ 由肽链（氨基酸序列）_基因的核苷酸序列，_ 信使RNA序列， 互补的单链DNA

5、，然后在酶的作用下合成 。 以目的基因转录的_为模板，_ _成互补的单链DNA，然后在酶的作用下成 。这个叫做这种生物的 文库基因文库的构建方法：直接分离法多用于原核生物一、目的基因的获取一、目的基因的获取2、获取目的基因的常用方法(1)从基因文库中直接获取 基因文库：基因组文库 、cDNA(互补DNA):人工合成法（真核生物）逆转录法:化学合成法：目的基因逆转录合成双链推测合成mRNAcDNA(互补DNA)推测2 2、获取目的基因的常用方法、获取目的基因的常用方法(1)(1)从基因文库中直接获取从基因文库中直接获取 一、目的基因的获取一、目的基因的获取1 1、目的基因的来源、目的基因的来源基

6、因文库的构建方法基因文库的构建方法基因文库：基因组文库 、cDNA(互补DNA)：直接分离法:人工合成法（真核生物）（2 2）利用）利用PCRPCR扩增目的基因扩增目的基因a a、条件、条件已知基因的核苷酸序列、四种脱氧核苷酸、引物已知基因的核苷酸序列、四种脱氧核苷酸、引物TaqTaqDNADNA聚合酶聚合酶使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增c c、结果、结果耐高温耐高温b b、方式：、方式：以指数方式扩增，即以指数方式扩增，即_（n n为扩增循环的次数）为扩增循环的次数）2 2n n适宜的温度和适宜的温度和PHPH值值2 2、获取目的基因的常用方

7、法、获取目的基因的常用方法一、目的基因的获取一、目的基因的获取(1)(1)从基因文库中直接获取从基因文库中直接获取 基因文库的构建方法基因文库的构建方法基因文库基因文库d d、过程、过程（二）利用（二）利用PCRPCR扩增目的基因扩增目的基因d d、过程、过程高温变性高温变性（解旋为单链）（解旋为单链）低温退火低温退火（引物与单链互补结合）（引物与单链互补结合）适温延伸适温延伸（在（在TaqTaq酶的作用下合成酶的作用下合成 与模板互补的与模板互补的DNADNA双链）双链）重复循环重复循环一、目的基因的获取一、目的基因的获取a a、条件、条件b b、方式、方式c c、结果、结果2 2、获取目的

8、基因的常用方法：、获取目的基因的常用方法：从自然界已有的物种分离从自然界已有的物种分离 人工方法合成人工方法合成(1)(1)从基因文库中直接获取从基因文库中直接获取 一、目的基因的获取一、目的基因的获取1 1、目的基因：、目的基因：（2 2）利用）利用PCRPCR扩增目的基因扩增目的基因（3 3）通过）通过DNADNA合成仪用化学方法直接人工合成合成仪用化学方法直接人工合成来源：来源：指编码蛋白质的基因或调控作用的因子指编码蛋白质的基因或调控作用的因子。在不知目的基因在不知目的基因序列的序列的情况下，情况下，依据基因的依据基因的特性特性获得所需的目的基因。获得所需的目的基因。需需构建构建基因文

9、库基因文库如果如果需要大量的目的基因需要大量的目的基因，利用利用PCRPCR扩增扩增基因较小、核苷酸序列已知基因较小、核苷酸序列已知目的基因的目的基因的获取获取基因表达载体的基因表达载体的构建构建将目的基因将目的基因导入导入受体细胞受体细胞目的基因的目的基因的检测与鉴定检测与鉴定基因工程基本操作的四个步骤基因工程基本操作的四个步骤：2 2、构建过程、构建过程复制原点复制原点. .目的基因目的基因启动子启动子. .终止子终止子标记基因等标记基因等1 1、基因、基因表达载体表达载体的组成的组成二、基因表达载体的构建（核心）二、基因表达载体的构建（核心）其中有两个DNA片段连接形成的产物有几种？目的

10、基因载体连接物载体载体连接物 目的基因目的基因连接物如何筛选？ 使用两种限制酶同时处理质粒、外源DNA,目的在于可以防止_ 。如何避免？质粒和含目的基因的质粒和含目的基因的DNADNA片段自片段自身环化身环化载体载体与与表达载体表达载体的区别：二者都有标记基因的区别：二者都有标记基因 复制原点两部分复制原点两部分DNADNA片段。表达载体在载体片段。表达载体在载体 基础上增加了目的基因、启动子、终止子三基础上增加了目的基因、启动子、终止子三 部分结构部分结构启动子、终止子启动子、终止子对于目的基因表达必不可少对于目的基因表达必不可少目的基因不能单独进入受体细胞，必需目的基因不能单独进入受体细胞

11、，必需以表以表 达载体的方式携带达载体的方式携带进去。进去。注意注意二、基因表达载体的构建（核心）二、基因表达载体的构建（核心）例1、构建最佳基因表达载体（重组质粒）是基因工程的关键。有4种限制性核酸内切酶，其中1号和4号切割DNA后产生的是平末端，2和3号酶产生的是黏性末端。含目的基因的DNA片段和质粒的酶切序列如下图所示： 请设计酶切方案，构建最佳基因表达载体（重组质粒）目的基因用酶2和4切割，质粒用酶 和 切割，由于1和4切出的是平末端，可以相连，因而目的基因可以与质粒重组。 二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建（核心）（核心）1 12 2例1构建最佳基因表达载体（重组质粒）是基

12、因工构建最佳基因表达载体（重组质粒）是基因工程的关键。有程的关键。有4 4种限制性核酸内切酶，其中种限制性核酸内切酶，其中1 1号和号和4 4号切割号切割DNADNA后产生的是平末端，后产生的是平末端，2 2和和3 3号酶产生的是号酶产生的是黏性末端。含目的基因的黏性末端。含目的基因的DNADNA片段和质粒的酶切序片段和质粒的酶切序列如下图所示：列如下图所示： 若用酶2和3切割重组质粒，可以得到几个DNA片段： 。 1 1二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建（核心）（核心）例2下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，限制酶限制酶BamHHindEcoRSma识别序列及识别序列及切割

13、位点切割位点GGATC CC CTAGGAAGCT TT TCGAAGAATTCCTTAAGCCCGGGGGGCCC(1)若对图中质粒进行改造，插入的Sma酶切位点越多，质粒的热稳定性越_。高高二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建（核心）（核心）下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，限制酶限制酶BamHHindEcoRSma识别序列及识别序列及切割位点切割位点GGATC CC CTAGGAAGCT TT TCGAAGAATTCCTTAAGCCCGGGGGGCCC(2)用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用Sma切割，原因是_SmaSma会破坏质粒的抗性基因、会破坏质粒的抗

14、性基因、外源外源DNADNA中的目的基因中的目的基因二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建（核心）（核心）下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，限制酶限制酶BamHHindEcoRSma识别序列及识别序列及切割位点切割位点GGATC CC CTAGGAAGCT TT TCGAAGAATTCCTTAAGCCCGGGGGGCCC(3)与只使用EcoR相比较，使用BamH和Hind两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以防止_质粒和含目的质粒和含目的基因的外源基因的外源DNADNA片段自身环化片段自身环化二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建（核心）（核心）下表中列出了几种

15、限制酶识别序列及其切割位点，限制酶限制酶BamHHindEcoRSma识别序列及识别序列及切割位点切割位点GGATC CC CTAGGAAGCT TT TCGAAGAATTCCTTAAGCCCGGGGGGCCC(4)为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入_酶。DNADNA连接连接二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建（核心）（核心）1 1、导入植物细胞、导入植物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法: :基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞什么是转化什么是转化1 1、导入植物细胞、导入植物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法: :

16、基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞2 2、导入动物细胞、导入动物细胞 显微注射法：显微注射法：将基因表将基因表达载体提纯，用显微仪达载体提纯，用显微仪注射到注射到受精卵受精卵中中1 1、导入植物细胞、导入植物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法: :基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞2 2、导入动物细胞、导入动物细胞3 3、导入微生物细胞、导入微生物细胞原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少方法：方法：用用CaCa2+2+处理细胞处理细胞 感受态

17、细胞感受态细胞 表达载表达载体与感受态细胞混合体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收感受态细胞吸收DNADNA分子分子目的基因的目的基因的获取获取基因表达载体的基因表达载体的构建构建将目的基因将目的基因导入导入受体细胞受体细胞目的基因的目的基因的检测与鉴定检测与鉴定目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定：目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定1 1、为什么要检测？、为什么要检测？表达载体是否满足要求？表达载体是否满足要求？表达载体是否导入细胞？表达载体是否导入细胞？目的基因是否维持稳定或整合到染色体目的基因是否维持稳定或整合到染色体DNADNA？目的基因是否转录？目的基因是否转录？目的基因转录

18、后是否翻译？目的基因转录后是否翻译？目的基因翻译出蛋白质是否有活性？目的基因翻译出蛋白质是否有活性？目的基因翻译出蛋白质有活性是否表现出生物个体上目的基因翻译出蛋白质有活性是否表现出生物个体上的性状？的性状？1 1、分子水平的检测：分子杂交技术、分子水平的检测：分子杂交技术检测是否插入目的基因检测是否插入目的基因检测是否转录出检测是否转录出mRNAmRNA2 2、还可以进行个体水平的鉴定、还可以进行个体水平的鉴定目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定基因探针：基因探针：探针制备：放射性同位素探针制备：放射性同位素( (如如3232P)P)、荧光分子等荧光分子等标记的标记的DNADNA分子；分

19、子；1 1、分子水平的检测：分子杂交技术、分子水平的检测：分子杂交技术检测是否插入目的基因检测是否插入目的基因检测是否转录出检测是否转录出mRNAmRNA检测目的基因是否翻译检测目的基因是否翻译 成蛋白质成蛋白质2 2、还可以进行个体水平的鉴定、还可以进行个体水平的鉴定抗体与蛋白质进行抗原抗抗体与蛋白质进行抗原抗体杂交，看是否有杂交带体杂交，看是否有杂交带依据其性状进行检测如：抗虫或抗病的接种实验依据其性状进行检测如：抗虫或抗病的接种实验目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定基因探针：基因探针：归纳归纳: : 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序1.1.获取目的基因获取目的基因从基因

20、文库从基因文库 利用利用PCRPCR技术技术2.2.构建基因表达载体构建基因表达载体目的基因、启动子、终止子、标记基因目的基因、启动子、终止子、标记基因3.3.将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞农杆菌转化法、显微注射法、基因枪法农杆菌转化法、显微注射法、基因枪法4.4.目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定检测：是否插入、转录、翻译、个体水平的检测检测：是否插入、转录、翻译、个体水平的检测化学方法直接人工合成化学方法直接人工合成1 1有关基因工程的叙述正确的是有关基因工程的叙述正确的是( )( ) A A限制酶只在获取目的基因时才用限制酶只在获取目的基因时才用 B B重组质粒的形成

21、是在细胞内完成的重组质粒的形成是在细胞内完成的 C C质粒都可以作为运载体质粒都可以作为运载体 D D蛋白质的氨基酸排列顺序可以为合成目的基蛋白质的氨基酸排列顺序可以为合成目的基 因提供线索因提供线索练习：练习：2 2科学家已经能够通过基因工程的方法，能使番茄果肉细胞科学家已经能够通过基因工程的方法，能使番茄果肉细胞中含有人奶蛋白。以下有关该基因工程的叙述错误的是（中含有人奶蛋白。以下有关该基因工程的叙述错误的是（ ） A.A.采用反转录的方法得到的目的基因有启动子、终止子采用反转录的方法得到的目的基因有启动子、终止子 B.B.用同种限制酶处理质粒和含目的基因的用同种限制酶处理质粒和含目的基因

22、的DNADNA，可产生相同，可产生相同 的黏性末端而形成重组的黏性末端而形成重组DNADNA分子分子 C.C.番茄的叶肉细胞可作为受体细胞番茄的叶肉细胞可作为受体细胞 D.D.启动子对于目的基因在番茄的叶肉细胞中的表达是不可缺启动子对于目的基因在番茄的叶肉细胞中的表达是不可缺 少的少的3 3、假设以大肠杆菌质粒作为运载体，并以同一种限、假设以大肠杆菌质粒作为运载体，并以同一种限制性内切酶切割运载体与目的基因，将切割后的运制性内切酶切割运载体与目的基因，将切割后的运载体与目的基因片段混合，并加入载体与目的基因片段混合，并加入DNADNA连接酶。连接连接酶。连接产物至少有产物至少有_种种DNADN

23、A分子，它们分别是分子，它们分别是_。基因工程又叫基因拼接技术。基因工程又叫基因拼接技术。1 1、在该技术中，用人工合成方法获得目的基因的途、在该技术中，用人工合成方法获得目的基因的途径之一是：以目的基因转录的径之一是：以目的基因转录的_为模板，为模板，_成互补的单链成互补的单链DNADNA，然后在酶的作用下，然后在酶的作用下合成合成 。2 2、基因工程中常用的受体细胞有细菌、真菌、基因工程中常用的受体细胞有细菌、真菌、_。若将真核基因在原核细胞中表达，对该目的基因的若将真核基因在原核细胞中表达，对该目的基因的基本要求是基本要求是_。专题一基因工程专题一基因工程举例说出基因工程的应用2.2.抗

24、病转基因植物抗病转基因植物 转基因工程技术主要用于提高农作物的转基因工程技术主要用于提高农作物的抗逆能力抗逆能力、改良农作物的改良农作物的品质品质、利用植物、利用植物生产药物生产药物等方面等方面. .3.3.其他抗逆转基因植物：其他抗逆转基因植物：转基因植物抗除草剂玉米转鱼抗寒蛋白基因的番茄转黄瓜抗青枯病基因的甜椒转黄瓜抗青枯病基因的马铃薯不会引起过敏的转基因大豆一一植物基因工程硕果累累（植物基因工程硕果累累（在农业上的应用）：2.2.抗病转基因植物抗病转基因植物 转基因工程技术主要用于提高农作物的转基因工程技术主要用于提高农作物的抗逆能力抗逆能力、改良农作物的改良农作物的品质品质、利用植物、

25、利用植物生产药物生产药物等方面等方面. .3.3.其他抗逆转基因植物：其他抗逆转基因植物：4.4.利用转基因改良植物的品质利用转基因改良植物的品质1）高产、稳产和具优良品质的品种 2）抗逆性品种：抗虫、抗病毒、抗除草剂、抗盐碱、抗干旱、抗高温 一一植物基因工程硕果累累（植物基因工程硕果累累（在农业上的应用）： 繁殖具有抗病能力、高产仔率、高产奶率和高质量的皮毛等繁殖具有抗病能力、高产仔率、高产奶率和高质量的皮毛等优良品质优良品质的转的转基因动物。基因动物。 该过程的重要步骤是通过该过程的重要步骤是通过感染或显微注射技术将重组感染或显微注射技术将重组DNADNA转移到动物受精转移到动物受精卵卵中

26、。中。基因工程在畜牧养殖业上的应用基因工程在畜牧养殖业上的应用二二动物基因工程前景广阔动物基因工程前景广阔1.1.用于提高动物生长速度用于提高动物生长速度2.2.用于改善畜产品的品质用于改善畜产品的品质如如转基因牛转基因牛分泌的乳汁，分泌的乳汁，乳糖含量降低，营养成分不变乳糖含量降低，营养成分不变3.3.用转基因的动物生产药物用转基因的动物生产药物乳汁中含有人生长激素的转基乳汁中含有人生长激素的转基因牛因牛( (阿根廷阿根廷) )转基因牛转基因牛基因工程在畜牧养殖业上的应用基因工程在畜牧养殖业上的应用二二动物基因工程前景广阔动物基因工程前景广阔1.1.用于提高动物生长速度用于提高动物生长速度2

27、.2.用于改善畜产品的品质用于改善畜产品的品质3.3.用转基因的动物生产药物用转基因的动物生产药物就基因药物而言，最理想的就基因药物而言，最理想的表达场所表达场所是哪里？是哪里？乳腺。乳腺。什么叫转基因动物？什么叫转基因动物？为什么乳腺能成为基因药物最理想的表达场所呢？为什么乳腺能成为基因药物最理想的表达场所呢？ 1 1）乳腺是一个外分泌器官，乳汁不进入体内循环，不会影响转基因动物）乳腺是一个外分泌器官，乳汁不进入体内循环，不会影响转基因动物本身的生理代谢反应。本身的生理代谢反应。 2 2）从乳汁中获取目的基因产物，产量高，易提纯，表达的蛋白质已经过）从乳汁中获取目的基因产物，产量高，易提纯，

28、表达的蛋白质已经过充分的修饰加工，具有稳定的生物活性。充分的修饰加工，具有稳定的生物活性。 3 3）从乳汁中源源不断获得目的基因的产物的同时，转基因动物又可无限）从乳汁中源源不断获得目的基因的产物的同时，转基因动物又可无限繁殖。繁殖。基因工程在畜牧养殖业上的应用基因工程在畜牧养殖业上的应用二二动物基因工程前景广阔动物基因工程前景广阔1.1.用于提高动物生长速度用于提高动物生长速度2.2.用于改善畜产品的品质用于改善畜产品的品质3.3.用转基因的动物生产药物用转基因的动物生产药物就基因药物而言，最理想的就基因药物而言，最理想的表达场所表达场所是哪里？是哪里？乳腺。乳腺。什么叫转基因动物？什么叫转

29、基因动物？为什么乳腺能成为基因药物最理想的表达场所呢？为什么乳腺能成为基因药物最理想的表达场所呢？4.4.用转基因的动物作器官移植的供体用转基因的动物作器官移植的供体5.5.基因工程药品异军突起基因工程药品异军突起基因工程胰岛素（一）基因工程胰岛素（一）二二动物基因工程前景广阔动物基因工程前景广阔基因工程在畜牧养殖业上的应用基因工程在畜牧养殖业上的应用5.5.基因工程药品异军突起基因工程药品异军突起基因工程干扰素（二）基因工程干扰素（二）其它基因工程药物其它基因工程药物基因工程药品基因工程药品 生长激素生长激素 治疗侏儒症治疗侏儒症的的唯一方法唯一方法，是向人体注射生长激素。而，是向人体注射生

30、长激素。而生长激素的获得很困难。以前，要获得生长激素，需解剖生长激素的获得很困难。以前，要获得生长激素，需解剖尸体，从大脑的底部尸体，从大脑的底部摘取垂体摘取垂体，并从中提取生长激素。，并从中提取生长激素。 现可利用基因工程方法，将人的现可利用基因工程方法，将人的生长激素基因导入大生长激素基因导入大肠杆菌肠杆菌中，使其生产生长激素。人们从中，使其生产生长激素。人们从 450 L450 L大肠杆菌培大肠杆菌培养液中提取的生长激素，相当于养液中提取的生长激素，相当于6 6万具尸体的全部产量。万具尸体的全部产量。 基因工程在畜牧养殖业上的应用基因工程在畜牧养殖业上的应用二二动物基因工程前景广阔动物基因工程前景广阔1.1.用于提高动物生长速度用于提高动物生长速度2.2.用于改善畜产品的品质用于改善畜