植生生化实验解读北大吴光耀

1、2011年精英教案第五届全国中学生物竞赛培训年精英教案第五届全国中学生物竞赛培训植生、生化实验解读课北京大学生命科学学院吴光耀 教授 1.1.蛋白质测定蛋白质测定(1) 总n量测定 有机n(甘氨酸) + h2so4 2co2 + 3so2 + 4h2o + nh3 (nh4) 2so4 + 2naoh 2h2o + na2so4 + 2nh3 nh4hb4o7+ hcl + 5h2o nh4cl + 4h3bo3 用酸滴定氨1.1.蛋白质测定蛋白质测定(2) 双缩脲法 测两个以上的肽键 碱性环境双缩脲与cu+生成紫红色化合物 540nm (nh2) 2co 2 nh2-co-nh-co-nh2

2、+nh1.1.蛋白质测定蛋白质测定(3) folin-酚法 是改进的双缩脲法 640nm同时测定了酪氨酸酚基。1.1.蛋白质测定蛋白质测定(4) 紫外法 280nm 比色1.1.蛋白质测定蛋白质测定(5) 考马斯亮蓝法 考马斯蓝g-250可与蛋白结合, 从红色染料转变成蓝色。 595nm 测定吸收值2. 2. 核酸测定核酸测定(1) rna 测定地衣酚法 rna + hcl 糠醛(核糖转变) 糠醛 + 3,5-二羟基甲苯(地衣酚) 鲜绿色 670nm比色2. 2. 核酸测定核酸测定(2) dna 测定 二苯胺法 dna + 冰乙酸 羟酮基戊醛(脱氧核糖转化) 羟酮基戊醛 + 二苯胺 蓝色 59

3、5nm 比色2. 2. 核酸测定核酸测定(3) 定磷法 有机磷 + 高氯酸 无机磷 无机磷 + 磷钼酸钼蓝 660nm 比色2. 2. 核酸测定核酸测定(4) 紫外法 260nm 比色3. 3. 质粒质粒dnadna提取和测定提取和测定(1) 扩增质粒 lb + 氨苄青霉素(2) 细菌裂解 +碱 (质粒dna出来, 染色体dna变性)(3) 沉淀蛋白 +乙酸钾、酚-氯仿(4) 纯化质粒dna 水相质粒dna用乙醇沉淀 + rnase 溶于tris缓冲液中(5) 260nm测定, 或电泳测定4. dna4. dna平板电泳平板电泳(1) 制胶 tris-硼酸缓冲液(tbe) + 1%琼脂糖(2)

4、 加液 tbe液(3) 加样 样品 + 花青素(4) 电泳 滤光板看dna移动过程5. pcr (polymerase chain reaction) 5. pcr (polymerase chain reaction) - dna- dna扩增扩增(1) 模板、引物、dntp、聚合酶、缓冲液、mg+(2) 过程: 模板双链分开 结合引物 新链合成(3) 可用毛囊dna y染色体dna, 设计引物,pcr, 男有女无.播放动画6. 6. 层析层析(1) 分配层析 纸层析、液相层析(2) 吸附层析 活性碳、氧化铝(3) 交换层析 离子交换剂(4) 凝胶层析 sephadex sepharose

5、s7. 7. 糖的测定糖的测定(1) 萘酚反应 糖 + 酸 糠醛 +萘酚紫环反应(2) 蒽酮反应 糖 + 蒽酮+硫酸兰绿色7. 7. 糖的测定糖的测定(3) 间苯二酚反应 酮糖 + 酸 羟甲基糠醛 +间苯二酚 鲜红色(4) 甲基间苯二酚反应 戊糖 + 酸 糠醛 +地衣酚 兰色沉淀 己糖 - 褐色沉淀8. 8. 还原糖测定还原糖测定( (有自由醛基有自由醛基) )(1) 费林反应 葡萄糖 + cu(oh) 2+ naoh 氧化亚酮 红黄色9. 9. 叶绿素性质叶绿素性质双羧酸的酯 酯溶性. 非极性溶剂(正己烷、石油醚)荧光+hcl 去镁叶绿素 +乙酸铜铜代叶绿素+naoh 皂化10. 10. 线

6、粒体氧化磷酸化线粒体氧化磷酸化磷氧比(p/o): 这一电子传递链过程中, 形成atp的量与消耗氧分子之间的比为磷氧比11. 11. 希尔用离心机分离了菠菜叶绿体希尔用离心机分离了菠菜叶绿体, , 他他在分离叶绿体中加入氧化态的氧化还原剂在分离叶绿体中加入氧化态的氧化还原剂- -2,6-2,6二氯靛酚二氯靛酚(dcip) (dcip) 后照光后照光, , 发现发现dcipdcip被还原被还原( (氧化态兰色氧化态兰色, , 还原态无色还原态无色), ), 并有并有氧的释放氧的释放 。回答问题回答问题: :(1)(1)你认为分离叶绿体要下述哪些条你认为分离叶绿体要下述哪些条件件a. 一定ph的缓冲

7、液b. 溶液有一定的渗透势c. 离心分离的叶绿体用水悬浮d. 离心时,离心速度愈高愈好e. 在摄氏4度操作和离心最好f. 在室温操作最好回答问题回答问题: :(1)(1)你认为分离叶绿体要下述哪些条你认为分离叶绿体要下述哪些条件件a. 一定ph的缓冲液b. 溶液有一定的渗透势c. 离心分离的叶绿体用水悬浮d. 离心时,离心速度愈高愈好e. 在摄氏4度操作和离心最好f. 在室温操作最好回答问题回答问题: :(2) (2) 你认为这一实验证明了什么你认为这一实验证明了什么? ?a. 光反应产生氧 b. co2被还原c. 光反应产生还原剂 d. 水被光解回答问题回答问题: :(2) (2) 你认为这

8、一实验证明了什么你认为这一实验证明了什么? ?a. 光反应产生氧 b. co2被还原c. 光反应产生还原剂 d. 水被光解希尔进一步实验希尔进一步实验, 他将分离叶绿体他将分离叶绿体悬液破碎悬液破碎, 离心离心, 分成绿色的沉淀分成绿色的沉淀和无色的上清液两部分和无色的上清液两部分, 沉淀再用沉淀再用缓冲液悬浮。发现绿色部分照光可缓冲液悬浮。发现绿色部分照光可放氧放氧, 如将两部分在暗处混合如将两部分在暗处混合, 加加入入14co2 2, 一定时间后一定时间后,则则14c被标记被标记在六碳糖上。在六碳糖上。 回答问题回答问题: : (1) (1) 上述进一步实验说明什么上述进一步实验说明什么?

9、 ?a. 光合作用可分为需光和不需光两部分b. co2固定是不需光的c. 氧的释放要光d. 水的氧化要光e. 水的还原要光f. 光产生还原剂g. 还原剂用于co2还原h. 光通过叶绿体起作用i. 六碳糖可氧化产生co回答问题回答问题: : (1) (1) 上述进一步实验说明什么上述进一步实验说明什么? ?a. 光合作用可分为需光和不需光两部分b. co2固定是不需光的c. 氧的释放要光d. 水的氧化要光e. 水的还原要光f. 光产生还原剂g. 还原剂用于co2还原h. 光通过叶绿体起作用i. 六碳糖可氧化产生co回答问题回答问题: :(2) (2) 实验中能否用实验中能否用nahnah1414

10、coco3 3代替代替1414coco2 2a. 不能 b. 能回答问题回答问题: :(2) (2) 实验中能否用实验中能否用nahnah1414coco3 3代替代替1414coco2 2a. 不能 b. 能单选题1、这是stitt研究果糖1，6-双磷酸酯酶（f1，6pase）被调节的一个实验结果，图中表明在磷酸二羟丙酮（dhap）增加时，1，6一二磷酸果糖（f1，6p）和2，6一二磷酸果糖（f2，6p）对f1，6pase的影响，你能得出如下结论：f2，6p调节f1，6pase活性f1，6p调节f1，6pase活性f1，6p和f2，6p都调节f1， 6pase活性f1，6p和f2，6p都不调

11、节 f1，6pase活性单选题1、这是stitt研究果糖1，6-双磷酸酯酶（f1，6pase）被调节的一个实验结果，图中表明在磷酸二羟丙酮（dhap）增加时，1，6一二磷酸果糖（f1，6p）和2，6一二磷酸果糖（f2，6p）对f1，6pase的影响，你能得出如下结论：f2，6p调节f1，6pase活性f1，6p调节f1，6pase活性f1，6p和f2，6p都调节f1， 6pase活性f1，6p和f2，6p都不调节 f1，6pase活性单选题在研究c4植物蔗糖合成时，测得如下结果：蔗糖是高等植物生长发育中主要运输物质，它由尿苷二磷酸葡萄糖（udpg）和fp首先形成磷酸蔗糖，也可由udpg与果糖形

12、成蔗糖。你再由光合碳代谢的知识，得出如下结论：蔗糖只在叶肉细胞中合成 蔗糖只在维管束鞘细胞中合成蔗糖在两类细胞中都能合成 蔗糖不在两类细胞中合成单选题在研究c4植物蔗糖合成时，测得如下结果：蔗糖是高等植物生长发育中主要运输物质，它由尿苷二磷酸葡萄糖（udpg）和fp首先形成磷酸蔗糖，也可由udpg与果糖形成蔗糖。你再由光合碳代谢的知识，得出如下结论：蔗糖只在叶肉细胞中合成 蔗糖只在维管束鞘细胞中合成蔗糖在两类细胞中都能合成 蔗糖不在两类细胞中合成单选题3、在黑暗萌发的芥菜叶子，在萌发60小时用红光诱导20分钟，在72小时时以全黑暗为对照，进行果糖双磷酸酯酶（fbpase）活性测定，结果如下：p

13、h值果糖双磷酸酯酶活性 全黑暗 光诱导 86 1.92 0.10 2.58 0.08 7.5 2.00 0.09 2.18 0.12在植物中有两种fbpase，一种在叶绿体内，一种在细胞质内，细胞质的酶在ph7.5-8.6之间有相同活性；而叶绿体内的酶只在ph8.6有最大活性，ph7.5时几乎无活性。你认为光诱导的是哪种fbpase。叶绿体的fbpase 细胞质的fbpase两者都被诱导 两者都没被诱导单选题3、在黑暗萌发的芥菜叶子，在萌发60小时用红光诱导20分钟，在72小时时以全黑暗为对照，进行果糖双磷酸酯酶（fbpase）活性测定，结果如下：在植物中有两种fbpase，一种在叶绿体内，一种在细胞质内，细胞质的酶在ph7.5-8.6之间有相同活性；而叶绿体内的酶只在ph8.6有最大活性，ph7.5时几乎无活性。你认为光诱导的是哪种fbpase。叶绿体的fbpase 细胞质的fbpase两者都被诱导 两者都没被诱导ph值果糖双磷酸