免疫细胞的分离及检测※检测完整版

1、目录目录 第一节第一节 吞噬细胞的分离和收集吞噬细胞的分离和收集第二节第二节 外周血单个核细胞的分离和纯化外周血单个核细胞的分离和纯化第三节第三节 淋巴细胞及其亚群的分离淋巴细胞及其亚群的分离3免疫细胞的分离及检测免疫细胞的分离及检测检测：检测：各类免疫细胞及其亚群的数量和各类免疫细胞及其亚群的数量和功能测定功能测定方法：方法：体外法为主体外法为主目的：目的：判断机体免疫状态判断机体免疫状态意义：意义：探讨疾病的发病机制、发展、预后、疗效探讨疾病的发病机制、发展、预后、疗效免疫细胞的分离免疫细胞的分离 是指将各种参与免疫反应的是指将各种参与免疫反应的 细胞从血液或组织中分离出来细胞从血液或组织

2、中分离出来 免疫细胞种类 大吞噬细胞大吞噬细胞: :即单核即单核- -吞噬细胞系统吞噬细胞系统 小吞噬细胞小吞噬细胞: :即中性粒细胞即中性粒细胞第一节第一节 吞噬细胞的分离和收集吞噬细胞的分离和收集吞噬细胞的种类吞噬细胞的种类特征性标志特征性标志 CD14CD14分离技术分离技术 PecollPecoll密度梯度分离法密度梯度分离法 流式细胞仪分离技术流式细胞仪分离技术 免疫磁珠分离法：为目前较常用的方法免疫磁珠分离法：为目前较常用的方法 黏附法黏附法一、吞噬细胞的分离一、吞噬细胞的分离（一）单核细胞的分离免疫磁珠分离法免疫磁珠分离法 斑蝥敷贴法分离人巨噬细胞斑蝥敷贴法分离人巨噬细胞 动物的

3、巨噬细胞直接从腹腔渗出液中获取动物的巨噬细胞直接从腹腔渗出液中获取 （二）巨噬细胞的分离（二）巨噬细胞的分离聚合物加速沉降法聚合物加速沉降法 可从外周血中分离出白细胞可从外周血中分离出白细胞RBC血浆血浆(抗凝血抗凝血)WBCRBC FicollFicoll分离法分离法 可从白细胞中分离出纯化的中性粒细胞可从白细胞中分离出纯化的中性粒细胞（三）中性粒细胞的分离（三）中性粒细胞的分离Ficoll-Hypaque密度梯度离心分离中性粒细胞密度梯度离心分离中性粒细胞吞噬细胞的吞噬活动大体分为吞噬细胞的吞噬活动大体分为趋化趋化、吞噬吞噬和和胞内杀灭胞内杀灭作作用三个阶段，据此建立相应的检测方法。用三个

4、阶段，据此建立相应的检测方法。 （一）中性粒细胞功能检测技术（一）中性粒细胞功能检测技术 （二）巨噬细胞功能检测技术（二）巨噬细胞功能检测技术二、相关功能检测二、相关功能检测细胞趋化功能的检测细胞趋化功能的检测吞噬功能的检测吞噬功能的检测杀菌功能的检测杀菌功能的检测（一）中性粒细胞功能检测（一）中性粒细胞功能检测体内试验法：皮肤窗法体内试验法：皮肤窗法体外试验法：滤膜渗透法体外试验法：滤膜渗透法 琼脂糖平板法琼脂糖平板法 趋化功能检测趋化功能检测检测细胞运动功能检测细胞运动功能皮肤窗法皮肤窗法 在在受检者前臂屈侧中央受检者前臂屈侧中央3 3范围内，搔刮范围内，搔刮皮肤后，用盖玻片压紧固定，在第

5、皮肤后，用盖玻片压紧固定，在第2 2，5 5，8 8，1212，2424，3636小时各取样一次，染色观察中性粒细胞聚集小时各取样一次，染色观察中性粒细胞聚集开始时间、聚集程度等。健康正常人一般开始时间、聚集程度等。健康正常人一般2 23h3h后后开始聚集，达开始聚集，达5050100100个，个，6 6小时可达小时可达10001000个以上个以上。 原理及技术要点原理及技术要点 在一特制的分上下两层的小盒，将趋化因子加入在一特制的分上下两层的小盒，将趋化因子加入下室，待检细胞加入上室，两室用微孔滤膜分隔，下室，待检细胞加入上室，两室用微孔滤膜分隔，3737温育数小时后，上室的中性粒细胞受下室

6、趋化温育数小时后，上室的中性粒细胞受下室趋化因子的吸引，由滤膜微孔进入滤膜内，取滤膜清洗、因子的吸引，由滤膜微孔进入滤膜内，取滤膜清洗、固定、干燥、染色和透明，在高倍镜下观察细胞穿固定、干燥、染色和透明，在高倍镜下观察细胞穿越滤膜的移动距离，从而判断其趋化功能。越滤膜的移动距离，从而判断其趋化功能。滤膜渗透法滤膜渗透法原理及技术要点原理及技术要点 在琼脂糖凝胶平板的中孔加白细胞悬液，左孔加在琼脂糖凝胶平板的中孔加白细胞悬液，左孔加趋化因子，右孔加对照液，温育趋化因子，右孔加对照液，温育48小时后，用显小时后，用显微镜测微器测定中性粒细胞向左孔的移动距离微镜测微器测定中性粒细胞向左孔的移动距离A

7、和和向右孔的移动距离向右孔的移动距离B，计算趋化指数。，计算趋化指数。趋化指数趋化指数= A/B趋化指数越大，表明中性粒细胞运动功能越强趋化指数越大，表明中性粒细胞运动功能越强 琼脂糖平板法琼脂糖平板法显微镜检查法显微镜检查法 100(%)计数的白细胞数吞噬细菌的白细胞数吞噬率吞噬指数=（一）中性粒细胞吞噬功能检测（一）中性粒细胞吞噬功能检测NBTNBT还原试验还原试验 原理：原理：N-N-C + H+N=N-R-N-NH2C N=NH四氮唑基（淡黄色）四氮唑基（淡黄色）甲甲chan（紫黑色）（紫黑色）杀菌功能检测杀菌功能检测 方法：方法：1.1.抗凝血抗凝血 + + 硝基蓝四氮唑（硝基蓝四氮

8、唑（NBTNBT），），3737孵育孵育25min25min。2.2.推片染色、镜检。推片染色、镜检。正常值：正常值：NBTNBT阳性细胞率应阳性细胞率应95% 95% NBT还原试验还原试验炭粒廓清试验炭粒廓清试验 正常小鼠肝中枯否细胞可吞噬清除正常小鼠肝中枯否细胞可吞噬清除9090炭粒，脾巨噬炭粒，脾巨噬细胞约吞噬清除细胞约吞噬清除1010炭粒。据此给小鼠静脉注射定量炭粒。据此给小鼠静脉注射定量印度墨汁（炭粒悬液），间隔一定时间反复取静脉血，印度墨汁（炭粒悬液），间隔一定时间反复取静脉血，测定血中炭粒的浓度，根据血流中炭粒被廓清的速度，测定血中炭粒的浓度，根据血流中炭粒被廓清的速度，判断巨

9、噬细胞的功能。判断巨噬细胞的功能。（二）巨噬细胞功能检测（二）巨噬细胞功能检测M +CRBCM +CRBC孵育孵育涂片、染色、镜检涂片、染色、镜检计算、吞噬率、吞噬指计算、吞噬率、吞噬指数数吞噬率（吞噬吞噬率（吞噬CRBCCRBC的的M 数数/ /计数的计数的M 数）数）100100吞噬指数吞噬指数 M吞噬的CRBCCRBC总数总数/ /计数的计数的M 数数吞噬功能检测吞噬功能检测返回章目录返回章目录PBMCPBMC包括：淋巴细胞、单核细胞包括：淋巴细胞、单核细胞各种血细胞比重不同各种血细胞比重不同, ,利用密度梯度离心进行分利用密度梯度离心进行分离离常用分层液：常用分层液：ficollhyp

10、aque，percoll第二节第二节 外周血单个核细胞的分离和纯化外周血单个核细胞的分离和纯化细胞细胞比重比重血小板血小板1.0301.035PBMC1.0751.090多核白细胞多核白细胞1.092红细胞红细胞1.093外周血各细胞成分的密度 Ficoll分离液法分离液法是一种单次差速密度梯度离心的分是一种单次差速密度梯度离心的分离法，主要用于分离外周血中的单个核细胞。离法，主要用于分离外周血中的单个核细胞。 原理：原理：Ficoll分层液：密度分层液：密度1.0771.0770.0010.001离心：密度梯度离心离心：密度梯度离心分离：各类细胞按其相应密度重新分布分离：各类细胞按其相应密度

11、重新分布一、一、Ficoll分离法分离法Ficoll分层液分离单个核细胞示意图7898Percoll分离单个核细胞示意图返回章目录返回章目录红细胞的去除：低渗裂解法、氯化铵裂解法红细胞的去除：低渗裂解法、氯化铵裂解法 血小板的去除血小板的去除 ：胎牛血清梯度离心法：胎牛血清梯度离心法单核细胞的去除：黏附法单核细胞的去除：黏附法 羰基铁吞噬法（磁铁吸引法）羰基铁吞噬法（磁铁吸引法） 苯丙氨酸甲酯去除法苯丙氨酸甲酯去除法 第三节第三节 淋巴细胞及其亚群的分离淋巴细胞及其亚群的分离一、淋巴细胞的纯化一、淋巴细胞的纯化免疫磁珠分离法免疫磁珠分离法流式细胞术分离法流式细胞术分离法 其他方法其他方法二、淋

12、巴细胞亚群的分离二、淋巴细胞亚群的分离 原理原理 将针对淋巴细胞特殊表面标志的某种特异性单克将针对淋巴细胞特殊表面标志的某种特异性单克隆抗体与磁珠结合形成隆抗体与磁珠结合形成免疫磁珠（免疫磁珠（IMBIMB），当特异性，当特异性单克隆抗体与表达相应抗原的靶细胞结合，利用磁单克隆抗体与表达相应抗原的靶细胞结合，利用磁场可以将场可以将IMBIMB所结合细胞与其他细胞分离。包被磁珠所结合细胞与其他细胞分离。包被磁珠的抗体可以是第一抗体或第二抗体。的抗体可以是第一抗体或第二抗体。 免疫磁珠分离法免疫磁珠分离法免疫磁珠分离法免疫磁珠分离法488 nm 激光激光+-前向散射光前向散射光检测器检测器 荧光检

13、测器荧光检测器电磁场电磁场单个细胞被分类单个细胞被分类进入检测管进入检测管流流式式细细胞胞术术分分离离原原理理示示意意图图E花环沉降法花环沉降法T T细胞功能检测细胞功能检测B B细胞功能检测细胞功能检测NKNK细胞功能检测细胞功能检测三、相关功能检测三、相关功能检测T T细胞增殖试验细胞增殖试验T T细胞介导的细胞毒试验细胞介导的细胞毒试验 MHC-MHC-肽四聚体技术肽四聚体技术 淋巴细胞内细胞因子检测淋巴细胞内细胞因子检测 T细胞功能检测细胞功能检测淋巴细胞淋巴细胞DNADNA合成合成分化分化母细胞母细胞刺激物刺激物细胞变大细胞变大细胞浆扩大细胞浆扩大空泡空泡核仁明显核仁明显核染色质疏松

14、核染色质疏松T淋巴细胞增殖试验淋巴细胞增殖试验非特异性刺激物：非特异性刺激物： PHA - TPHA - T细胞细胞 ConA - TConA - T细胞细胞 PWM - TPWM - T、 B B细胞细胞 LPS - BLPS - B细胞细胞特异性刺激物：特异性刺激物： 异种抗原异种抗原 同种组织抗原同种组织抗原淋巴细胞转化的刺激物淋巴细胞转化的刺激物形态学检查法形态学检查法 3H-TdR3H-TdR掺入法掺入法 MTTMTT比色法比色法 淋巴细胞转化的检测方法淋巴细胞转化的检测方法形态学检查法形态学检查法 转化的淋巴细胞转化的淋巴细胞未转化的淋巴细胞未转化的淋巴细胞淋巴母细胞淋巴母细胞 过

15、渡型过渡型细胞大小细胞大小( (直径直径m)m)12122020121216166 68 8核大小、染色质核大小、染色质增大、疏松增大、疏松增大、疏松增大、疏松不增大、密集不增大、密集核仁核仁清晰、清晰、1 14 4个个有或无有或无无无有丝分裂有丝分裂有或无有或无无无无无胞质、着色胞质、着色增多、嗜碱增多、嗜碱增多、嗜碱增多、嗜碱极少、天青色极少、天青色浆内空泡浆内空泡有或无有或无有或无有或无无无伪足伪足有或无有或无有或无有或无无无未转化和转化淋巴细胞的形态特征未转化和转化淋巴细胞的形态特征原理：原理：刺激物刺激物3756hG1期期 S1期期 合成合成DNADNA 3H-TdR3716hDNA

16、- 3H-TdR测淋巴细胞内放射量（测淋巴细胞内放射量（cpmcpm）计算计算SISI判断淋巴细胞转化程度判断淋巴细胞转化程度外周血（外周血（T T）G G0 0期期3H-TdR掺入法掺入法评价：该方法敏感性高、客观性强、重复评价：该方法敏感性高、客观性强、重复性好、可自动操作；设备昂贵、放射污染性好、可自动操作；设备昂贵、放射污染。 刺激指数（刺激指数（stimulating indexstimulating index，SI SI ） SI=SI=试验管试验管cpmcpm均值均值/ /对照管对照管cpmcpm均值均值3H-TdR掺入法掺入法原理原理：外周血外周血T T细胞细胞 PHA发生增

17、殖发生增殖 MTT含蓝色甲颗粒含蓝色甲颗粒 的的T T细胞细胞 MTT PHA 有机溶剂有机溶剂测吸光度（测吸光度（A A）值）值 计算计算SISI判定细胞增殖结果判定细胞增殖结果SI=值对照孔值试验孔AA(SI2(SI2具有意义具有意义) ) MTT比色法比色法原理原理:靶细胞抗原靶细胞抗原T T细胞细胞观察杀伤活力观察杀伤活力致敏致敏CTLCTL靶细胞靶细胞（三）（三）T细胞介导的细胞毒试验细胞介导的细胞毒试验 试验方法试验方法: 同位素法同位素法 淋巴细胞（淋巴细胞（CTLCTL）+ +含含51Cr 51Cr 的肿瘤细胞的肿瘤细胞 肿瘤细胞破坏肿瘤细胞破坏 51Cr 51Cr 释放释放

18、测定测定射射线线51Cr特异释放率= 均值对照孔均值最大释放孔均值对照孔均值试验孔cpmcpmcpmcpm100%（三）（三）T细胞介导的细胞毒试验细胞介导的细胞毒试验（三）（三）T细胞介导的细胞毒试验细胞介导的细胞毒试验背景无效应细胞背景无效应细胞效应细胞效应细胞/靶细胞靶细胞 1:1效应细胞效应细胞/靶细胞靶细胞 5:1效应细胞效应细胞/靶细胞靶细胞 20:1细胞溶解细胞溶解MHC-肽四聚体技术肽四聚体技术原理原理 根据根据T细胞活化的双识别原理，用生物工细胞活化的双识别原理，用生物工程技术将程技术将MHC分子在体外组装，并结合抗原表分子在体外组装，并结合抗原表位肽，形成抗原肽位肽，形成抗

19、原肽-MHC分子复合物，结合流式分子复合物，结合流式细胞仪定量检测抗原特异性细胞仪定量检测抗原特异性T细胞。细胞。T技术要点技术要点 : 1.1.在体外将特异性抗原肽段、可溶性在体外将特异性抗原肽段、可溶性MHCIMHCI类类分子重链及分子重链及2 2微球蛋白正确折叠，形成微球蛋白正确折叠，形成MHC-MHC-抗原肽复合物，并纯化该复合物。抗原肽复合物，并纯化该复合物。 2. 2.用生物素标记用生物素标记MHC-MHC-抗原肽复合物。抗原肽复合物。 3. 3.生物素标记的生物素标记的MHC-MHC-抗原肽复合物与荧光标抗原肽复合物与荧光标记的亲和素以记的亲和素以4: 14: 1的比例相混合，即

20、得到荧的比例相混合，即得到荧光标记的四聚体光标记的四聚体 MHC-肽四聚体技术MHC-肽四聚体技术原理原理: : 用刺激剂体外激活淋巴细胞，用蛋白转用刺激剂体外激活淋巴细胞，用蛋白转运抑制如莫能霉素阻止细胞因子分泌到细胞运抑制如莫能霉素阻止细胞因子分泌到细胞外，细胞内蛋白质转运方式被打乱，引起细外，细胞内蛋白质转运方式被打乱，引起细胞因子向高尔基体积聚，用流式细胞仪便可胞因子向高尔基体积聚，用流式细胞仪便可测出淋巴细胞内的细胞因子种类，从而确定测出淋巴细胞内的细胞因子种类，从而确定TH1/ TH2TH1/ TH2细胞的百分率。细胞的百分率。淋巴细胞内细胞因子检测淋巴细胞内细胞因子检测分泌的细胞因子分泌的细胞因子 Thl Th2Thl Th2 IL-2 + - IFN- + - TNF- + + IL