神经干细胞体外诱导分化为胆碱能神经元探究进展.

1、神经干细胞体外诱导分化为胆碱能神经元的研究进展 硕士研究生 孙晓静 导师 孙莉 传统的观点认为， “中枢神经细胞不可再生” ，然而自 1992 年 Reynolds 等从成年鼠脑纹状体和海马中首次分离出了神经干细胞 （NSC） ,且它与多能干细胞一样具有自我更新、分裂增殖、多向分 化的潜能，此后人们开始深入了解神经干细胞。 Erikson 等于 1998 年 也证实了人脑中同样存在神经干细胞， 随后的研究发现成年脑中神经 干细胞主要存在于侧脑室外侧壁脑室下区和海马齿状回中。 随着近年 来对中枢神经系统的损伤或病变部位实行细胞替代或移植治疗的研 究深入， 为中枢神经系统损伤、 神经系统变性疾病或

2、神经退行性疾病 等的治疗提供了新的方向。 阿尔茨海默病（ AD ）是老年人常见的一种慢性进行性神经系统 变性疾病。长期以来认为前脑胆碱能投射系统（尤其是 Meynert 基底 核）胆碱能神经元变性、 细胞数量减少等导致 AD 认知功能不可逆的 减退。目前就其病因有多种学说：如基因学说（APP基因1卜早老 蛋白基因 2 、ApoE 基因 3 ）、胆碱能假说、雌激素水平下降学 说4 、氧化应激学说 5 、铝中毒学说、炎症学说 6 、神经营养 因子学说 7 等。此外， AD 还可能与年龄、种族、社会心理因素及 各种疾病史等多种因素有关。 综上所述 , 多因素参与 AD 发病 , 但目前为止确切的发病

3、机制 尚不清楚。其治疗方法包括对于轻度和中度 AD 予以乙酰胆碱酯酶 （AChE）抑制剂以提高认知功能，以及N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）拮 抗剂对重度 AD 的治疗 8, 其他药物如脑循环改善药物剂、 AChE 抑制剂、 M1 胆碱受体激动剂、乙酰胆碱释放促进剂、 神经生长因 子、抗氧化药物和抗 B -淀粉样药物等。这些治疗手段虽能减轻 AD 的症状 , 但无法补充大脑皮层和海马大量丢失的神经细胞,因而 对中、晚期AD患者的疗效有限。神经干细胞（NSCs）的广泛研究及 重大进展为AD的治疗提供了一个更有前景的治疗策略，NSC移植 治疗 AD 等退行性疾病成为近年来的研究热点。 然而不管是

4、诱导、 促 进内源性NSCs增殖分化，产生相应的神经细胞代替缺损变性的细胞， 还是体外培养需要的NSCs移植入体内，如何诱导NSCs定向分化为 胆碱能神经元都是一个至关重要的问题。 神经干细胞增殖、分化相关因素 神经干细胞的增殖、迁移、分化与多种因素相关。目前的研究认 为决定神经干细胞定向分化的机制有两种：一种是细胞自身基因调 控；另一种是外来因素调控，主要为各类细胞因子家族，如神经营养 因子、生长因子、 细胞黏附因子等均可影响神经细胞的分化，其影响 机制各不相同。 不同的细胞因子诱导分化出的神经元不同。 研究最多 有生长因子如：表皮生长因子（EGF）家族、碱性成纤维细胞生长因 子（FGF）家

5、族、B -转导生长因子（B -TGF）超家族、神经营养因 子、脑源性生长因子及化学诱导剂及药物等。 一、生长因子 碱性成纤维生长因子（FGF）在神经干细胞增殖的早期阶段发挥促 有丝分裂的作用 , 使神经干组胞获得对另一作用更强的促有丝分裂 因子表皮生长因子（EGF）的反应性；而表皮生长因子在神经干细胞 增殖后期发挥作用 9。两种因子对神经干细胞分化方向的作用也不 相同, 碱性成纤维生长因子能增加干细胞向神经元分化的比例 , 而表 皮生长因子敏感的干细胞生成的神经元常常少于 1%, 绝大多数是星 形胶质细胞 , 且这两种生长因子作用的神经干细胞分化形成的神经 元多为丫 -氨基丁酸能神经元10。T

6、arasenko等9比较碱性成纤 维生长因子、 表皮生长因子和外源性白血病抑制因子联合及单独应 用对培养的人胚神经干细胞的影响 , 发现上述 3 种生长因子联合应 用对人胚神经干细胞的扩增最有效 , 人胚神经干细胞在有碱性成纤 维生长因子 , 肝素及层粘连蛋白的联合作用下往胆碱能神经元方向 分化。 二、转化生长因子（3超家族 骨形成蛋白是转化生长因子 3超家族中最大成员。在原肠胚期, 骨形成蛋白首先表现为抑制神经外胚层的形成 ； 在神经管期 ,不同浓 度的骨形成蛋白和其他细胞因子共同促进神经管背部不同类型神经 细胞的分化 ； 在发育晚期 , 作用于腹侧区的神经前体细胞 , 抑制这些 细胞分化为

7、神经元及少突胶质细胞 , 促进其分化为星形胶质细胞 ,同 时也作用于非腹侧区的神经前体细胞 , 促进其存活及分化 11。骨形 成蛋白 2 可以明显抑制 Oligr2（ 促进神经前体细胞向神经元和少突 胶质细胞分化的一种重要转录调控因子）的表达 , 从而抑制少突胶质 细胞分化 12。 Varley 等试验研究证明骨形成蛋白 2 是神经嵴细胞 向肾上腺素能神经元分化的有效调节物 13。在中枢神经系统发育中 , 骨形成蛋白 2 在室管膜区表面有表达 , 可以启动 VZ 内的新皮层前 体神经细胞向神经元分化。 体外培养的神经上皮细胞在骨形成蛋白 2 作用 24 h 之后 , 可以增加分化产物中神经元数

8、目 , 提示骨形成蛋白 2 能够促进神经干细胞向神经元分化。 三、神经营养因子、脑源性生长因子 神经营养因子刺激鸟类神经管前体细胞分化为运动神经元, 但 对分化的离体运动神经元的存活总数则无明显影响。 但是神经营养因 子对细胞分化的影响似乎是通过促进已分化的神经细胞的成熟, 而 不是使未分化的多能干细胞向神经元分化。脑源性生长因子、胰岛 素样生长因子、 血小板源性生长因子等被证实增加神经干细胞向神 经元表型方向的分化。睫状神经营养因子和白血病抑制因子作用于 多潜能神经干细胞 , 诱导它们分化成星形胶质细胞 ;而甲状腺素 T3 则促使其分化为少突胶质细胞14。Kim等15研究表明，粒-巨噬 细胞

9、集落刺激因子可促进神经祖细胞增殖 , 抑制其分化及凋亡。 另外 , 参与神经干细胞诱导分化的细胞因子有细胞因子白细胞介素类, 如 白介素1 a具有诱导人神经干细胞向多巴胺神经元分化的作用，联 合应用白介素1 a、白介素11、白血病抑制因子和胶质细胞源性神 经营养因子对人神经干细胞向成熟的多巴胺神经元分化具有协同作 用16。 四、化学诱导剂及药物 化学诱导剂被引进神经干细胞体外诱导实验中并被证实有效, 邓红等 17分离培养新生大鼠纹状体脊髓神经干细胞, 观察不同浓度 全反式视黄酸对脊髓神经干细胞的影响 , 结果发现全反式视黄酸诱 导脊髓神经干细胞向神经元方向分化 , 其作用在一定范围内呈剂量 依

10、赖性，脊髓神经干细胞的 RAR B基因的表达对全反式视黄酸存在 剂量依赖性和时间依赖性。王飞等18用不同浓度（0.5卩mol/L、1 卩mol/L、5卩mol/L和10卩mol/L）的全反式维甲酸在体外诱导人 胚胎神经干细胞 , 全反式维甲酸能显著提高人胚胎神经干细胞分化 为神经元的比例，其中1卩mol/L的维甲酸诱导人胚胎神经干细胞 分化为神经元的比例最高。 目前已知， 细胞因子、 生长因子以及内环境等因素的作用可诱导 神经干细胞向不同的终末神经细胞分化， 诸如成纤维细胞生长因子诱 导神经干细胞的主要分化方向是 丫 -氨基丁酸能神经元；鼠胶质细胞 源性生长因子于中枢神经系统可诱导出多巴胺神经

11、元， 于周围神经系 统可产生施万细胞；白细胞抑制因子与多巴胺能神经元生成相关 19 。胶质源性神经营养因子 GDNF 在 NSC 分化为多巴胺神经元中 起重要作用 20 . 神经营养因子家族中 BDNF 能增加 EGF 诱导增殖 的神经前体细胞向GABA （丫 -氨基丁酸）能神经元分化，并且也能 刺进神经前体细胞向胆碱能神经元分化。 中枢胆碱能神经系统是中枢胆碱能神经元及其纤维投射分布的 部位，乙酰胆碱（Ach）作为中枢胆碱能神经系统的一种重要递质， 参与学习和记忆等相关的生理活动。 大脑退行性变的疾病常引起中枢 胆碱能神经系统受损并导致学习和记忆等高级神经功能障碍，这是 AD 等疾病重要的发

12、病机制。 胆碱能神经相关的细胞因子 一、神经营养因子（ NGF） NGF 由中枢胆碱能神经系统合成、分泌，反过来支持和营养中 枢神经系统，因此对神经营养因子对胆碱能神经的保护和维持作用的 研究很多。 NGF 在脑内的主要作用部位是基底前脑胆碱能神经系统 , 能促进胆碱能神经元发育 ,增强突触的可塑性和神经元的功能 ,使胆碱 能神经细胞中的 Ach、 ChAT 和 AchE 等活性增强 ,并促进其存活和 纤维的延伸 21 ,22。研究表明 ,若注射 NGF 抗阻断 NGF 与其受体的 结合 ,基底前脑胆碱能神经元的ChAT 和 AchE 活性会明显下降 22 。此外 Calza 等23在损毁基底

13、前脑胆碱能神经元后 , 于侧脑室注 射EGF和bFGF 14 d后，再改用NGF注射14 d,结果除发现基底 前脑胆碱能神经元受损大鼠的学习记忆功能得到明显改善外 , 形态 学也证实脑内海马等处有较多的神经干细胞被 NGF 诱导分化为胆 碱能神经元。也有实验结果 24发现 NGF 可诱导皮层和隔区来源的 神经干细胞向成熟的 AChE 阳性的胆碱能神经元分化。且隔区来源 的神经干细胞比皮层来源的神经干细胞更易于向 AChE 阳性神经元 分化 , 这可能是因为隔区来源的神经干细胞具有更易于向胆碱能神 经元分化的区域特异性。 BDNF 作为一种重要的神经营养因子亦有众多的研究报导， 神经 干细胞的增

14、殖首先需要有丝分裂原的作用，表面生长因子（EGF）和碱 性成纤维细胞生长因子 （bFGF）是神经干细胞体外增殖的重要的有 丝分裂原 ,并且多数研究认为 bFGF 与 EGF 分别在胚胎发育早晚期 促进神经前体细胞的增殖 ,并可促神经干细胞向神经前体细胞、胶 质前体细胞分裂 25 ,而 BDNF 在定向祖细胞分化成终末细胞中起 重要作用26 。BDNF在体外可促进 NSC的存活和促进其向神经元 分化。诸如林玲等人27通过体外培养出生23d大鼠脑皮质的神 经干细胞，应用免疫荧光术分别观察 BDNF组和对照组中（3 2tubulin 阳性神经元数 ,结果发现 BDNF 组阳性细胞数明显多于对照组 ,

15、且 神经元的突起明显较对照组长。谢青松等人28 利用孕14d大鼠胚 胎脑组织中的神经干细胞在体外加入 BDNF 诱导分化 1、3、和 5d 后行流式细胞仪检测发现 : BDNF 组神经元的比例较对照组各时段的 比例提高了 1 倍。中枢神经系统的功能主要依赖于神经元,不同类型 的神经元其功能也不同 ,而神经元的种类是按神经递质来区分的。研 究已证实BDNF能增加EGF诱导增殖的神经前体细胞向 GABA（ 丫 -氨基丁酸 ）能神经元分化 ,并且也能促进神经前体细胞向胆碱能神 经元分化。这为外源性神经干细胞移植治疗中枢性疾病提供了依据。 二、骨形态发生蛋白（ BMP） BMPs 是转化生长因子 3超

16、家族最大的成员，也是影响神经发育 的重要基因组之一， BMPs 从神经发生到神经系统发育成熟的不同时 期、不同脑区均起着相当重要的作用。2000年，Lgnacio等29 报 道,在培养的神经细胞中，骨形态发生蛋白9 （BMP9）直接诱导编码乙 酰胆碱转移酶和乙酰胆碱转动囊基因的表达及上调乙酰胆碱的合成 脑室内注射 BMP9 可增加活体的乙酰胆碱水平 , 说明 BMP9 是胆碱 能中枢神经系统的分化因子。 BMP 家族中的 BMP4 也具有相应的效 应。BMPs在不仅神经系统的发育中有多种作用，且对神经营养因子 的作用产生影响 30 。不同浓度的 BMPs 对不同时期 NSCs 的分化 具有不同

17、作用。如在 E16大鼠的皮层，1-10ng/ mL BMPs可以促进 神经元和星形胶质细胞的分化 ，100ng/ mL则使细胞死亡31 。常艳 32 等人所做实验用表皮生长因子（EGF）和成纤维生长因子（FGF）将 NSCs 体外扩增进入分化阶段后，再给予一定浓度的 BMP4 诱导 NSCs的分化方向，提高ChAT的表达，促进NSCs向胆碱能神经 元方向的分化。结果显示免疫荧光染色加 BMP4 培养的实验组的 ChAT阳性细胞明显比不加BMP4培养的对照组的阳性细胞多，而且 荧光较强 ; 流式细胞术的结果也提示实验组 ChAT 阳性细胞率显著 高于对照组（P 0. 05）;而ChAT是胆碱能神

18、经元的标志性酶。所以 这项实验可提示 BMP4 对 NSCs 确实具有胆碱能诱导分化作用。有 实验研究观察发现不同浓度 BMP4 对端脑胆碱能前体细胞的产生和 分化也有不同的影响，研究证实低浓度（20pg/L） BMP4可诱导端脑胆 碱能前体细胞发生和分化，而较高浓度（40/L） BMP4可抑制其发 生和分化 33 。 上述具有胆碱能诱导分化作用的细胞因子的研究进展， 对于诱导 NSCs定向分化为胆碱能神经元技术的完备有重大意义，是神经干细 胞用于治疗 AD 等引起的脑损伤或神经元缺损很有必要的基础研究。 然而如何诱导NSCs在病变部位定向分化为胆碱能神经元， 或者如何 将保证体外诱导生成的胆

19、碱能神经元的存活率及质量并将其顺利送 达神经元损伤部位，这些是研究者们需要更进一步探讨的问题。 参考文献 1 Postina R , Schroeder A , Dewachter I ,et al . A disintegrin - metallo2 proteinase prevents amyloid plaque formation and hippocampal defects in an Alzheimer disease mouse model J . J Clin Invest , 2004 , 113(10) : 1 456 - 1 464。 2 Gabuzda D , Bu

20、sciglio J , Chen L B. Inhibition of energy metabolism al2ters the processing of amyloid protein and induces a potentially amyloid2genic derivative J . J Biol Chem , 1994 , 269 ( 18 ) : 136 232 -136 238. 3 Trommer B L , Shah C , Yun S H ,et al . ApoE isoform - specific effects on L TP : blockade by o

21、ligomeric amyloid - beta1 - 42 J . NeurobiolDis ,2005 , 18 (1) : 75 - 82. 4 Svensson A L ,Nordberg A. Beta - est radiol attenuate amyloid beta -peptide toxicity via nicotinic receptors J . Neuroreport , 1999 , 10 (17) :3 485 - 3 489. 5 Huber A , Stuchbury G, Burkle A ,et al . Neuroprotective therapi

22、es for Alzheimer s diseaseJ . Curr Pharm Des ,2006 , 12 (6) :705 - 717. 6 Sast re M , Klockgether T ,Heneka M T. Cont ribution of inflammatory processes to Alzheimer s disease : molecular mechanisms J . Int J DevNeurosci ,2006 , 24 (2 - 3) :167 - 176. 7 Peng S , Wuu J , Mufson E J ,et al . Precursor

23、 form of brain - derived neurot rophic factor and mature brain - derived neurot rophic factor are ecreased in the pre - clinical stages of Alzheimer s diseaseJ . J Neu2 rochem. , 2005 , 93 (6) : 1 412 - 1 421. 8 Enna SJ, Coyle JT. In pharmacological management of neurological and psychiatric disorde

24、rs M. New York:McGraw-Hill Professional, 1998:267- 316. 9 Taras enko YI, Yu Y, Jordan PM, et al . Effect of growth factors onprol iferation and phenotypic diffe2ntiation of human fetal neural s temcel ls .J Neurosci Res 2004; 78(5):625-636 10 Whi ttemore SR, Moras sutti DJ , Wal ters WM, et al . Mi

25、togen and subs trate differential ly affect the l ineage res triction of adul t subventricular zone neural precursor cel l populations . Exp Cel l Res 1999; 252(1):75-95 11 Mehler MF, Mabie PC, Zhang D, et al .Bone morphogenetic proteins in the nervous sys tem.Trends Neurosci 1997; 20(7): 309-317 12

26、 Park HC, Mehta A, Richardson JS, et al .ol ig2 is required for zebrafish primary motor neuron and ol igodendrocyte development.Dev Biol 2002;248(2): 356-368 13 Varley JE, Maxwel l GD.BMP-2 and BMP-4, but not BMP-6, increas e the number of adrenegic cel ls which develop in quai l trunk neural cres t

27、cul tures .Exp Neurol 1996; 140(1): 84-94 14 Huang Z,Tang XM, Cambi F. Down regulation of the retinoblas toma protein (rb) is as sociated wi th rat ol igodendrocyte differentiation. Mol Cel lNeuros ci 2002; 19(2):250-262 15 Kim JK, Choi BH, Park HC,et al .Effects of GM-CSF on the neuralprogeni tor c

28、el ls . J Neuroreport 2004; 15(14):2161-2165 16 谭雪锋，金国华，田美玲，等.白介素-1 a及与白介素-11、 白血病抑制因子和胶质细胞源性神经生长因子联合诱导人神经干细 胞向多巴胺神经元的分化 J .解剖学报 ,2005, 36(4):351-355 17 邓红, 邹飞, 罗海吉 .全反式视黄酸对新生大鼠纹状体神经 干 细 胞 向 神 经 元 样 细 胞分 化 的 作 用 J . 第 一军 医 大 学 学 报,2005,25( 1 1 ): 1 357- 1 374. 18 王飞, 黄强, 李世亭 , 等.全反式维甲酸诱导神经干细胞分 化实验研究

29、 .J . 中华神经外科疾病研究杂志 , 2005,4(2):145-148. 19 谭雪锋，金国华，田美玲，等.白介素-1 a及与白介素-11、 白血病抑制因子和胶质细胞源性神经生长因子联合诱导人神经干细 胞向多巴胺神经元的分化 J .解剖学报 ,2005, 36(4):351-35521 20 Eleni R, Kerstin K . G DNF p r omotes neuronal differentiati on and do2paminergic devel opment ofmouse mesencephalic neuros pheres J .Neurosci Lett, 2

30、004, 361: 522 55. 21 Ha DH , Robertson RT , Roshanaei M, et al . Enhanced survival and morphological features of basal forebrain cholinergic neurons in vitro :role of neurotrophins and other potential cortically derived cholinergic trophic factors. J Comp Neurol , 1999 , 406 : 156 - 170. 22 Ward NL

31、, Hagg T. BDNF is needed for postnatal maturation of basal forebrain and neostriatum cholinergic neurons in vivo. Exp Neurol ,2000 , 162 : 297 - 310. 23 Calza L, Giuliani A, Fernandez M, et al. Neural stem cells and cholinergic neurons: Regulation by immunolesion andtreatment with mitogens, retinoic acid, and nerve growth factorJ. Proc Natl Acad Sci USA, 2003,100(12):7325. 24 熊咏，田美玲，秦建兵等 .NGF 诱导大鼠胚脑皮层和隔区 神经干细胞和 AChE 阳性神经元分化的作用 .南通大学学报(医学版)， 2007，01-001-03. 25 毕研贞 ,余 茜 . 碱性成纤维细胞生长因子与表皮生长因子 对神经干细胞增殖与分化的影响 J . 中国组织工程研究与临床康 复 , 2007, 11 (4) : 13452 1348.