离体培养下的遗传与变异

1、离体培养下的遗传与变异 第三章 离体培养下的遗传与变异 Larkin和和Scowcroft（1981）提出把由任何）提出把由任何 形式的细胞培养所产生的植株统称为体细形式的细胞培养所产生的植株统称为体细 胞无性系（胞无性系（somaclones），而把这些植株），而把这些植株 所表现出来的变异称之为体细胞无性系变所表现出来的变异称之为体细胞无性系变 异（异（somaclonal variation）。）。 离体培养下的遗传与变异 l 从对生物遗传的影响而言，细胞工程技术本身即包从对生物遗传的影响而言，细胞工程技术本身即包 含了双重性：遗传稳定性和变异性。含了双重性：遗传稳定性和变异性。 l对于

2、单纯的繁殖技术而言，离体培养的技术操作是细胞对于单纯的繁殖技术而言，离体培养的技术操作是细胞 或组织或个体的不断复制。然而因为起始培养的材料、或组织或个体的不断复制。然而因为起始培养的材料、 培养基成分以及培养时间的不同，使其产生的无性后代培养基成分以及培养时间的不同，使其产生的无性后代 的遗传稳定性也有了一定差异，这些变异是因为在培养的遗传稳定性也有了一定差异，这些变异是因为在培养 过程中产生的，属于随机性变异。过程中产生的，属于随机性变异。 l细胞工程还有一类技术操作，其目的就在于创造变异，细胞工程还有一类技术操作，其目的就在于创造变异， 如体细胞人工突变、基因转移、体细胞融合等。这些离如

3、体细胞人工突变、基因转移、体细胞融合等。这些离 体操作技术，在某种程度上说具有一定的目的性和方向体操作技术，在某种程度上说具有一定的目的性和方向 性，可以在短期内获得从自然界可能要经过几年乃至上性，可以在短期内获得从自然界可能要经过几年乃至上 百年的进化才能获得的性状，从而加速了生物进化的进百年的进化才能获得的性状，从而加速了生物进化的进 程。程。 离体培养下的遗传与变异 离体培养中的遗传与变异特点离体培养中的遗传与变异特点 体细胞变异的细胞遗传学基础体细胞变异的细胞遗传学基础 体细胞无性系变异诱导与选择应用体细胞无性系变异诱导与选择应用 体细胞变异的分子遗传学基础体细胞变异的分子遗传学基础

4、离体培养下的遗传与变异 1 1 离体培养中的离体培养中的 遗传稳定性遗传稳定性 2 2 离体培养下变异离体培养下变异 3 3 影响体细胞遗传与变异的因素影响体细胞遗传与变异的因素 第一节 离体培养中的遗传与变异特点 离体培养下的遗传与变异 一. 离体培养中的遗传稳定性 l 离体培养的细胞学基础是有丝分裂，有丝分裂的离体培养的细胞学基础是有丝分裂，有丝分裂的 DNA半保留复制和染色体的均等分裂机制，从理论半保留复制和染色体的均等分裂机制，从理论 上可以保证离体培养物在一般情况下的遗传稳定性。上可以保证离体培养物在一般情况下的遗传稳定性。 l 在准确选择培养方式的前提下，离体无性繁殖可以具在准确选

5、择培养方式的前提下，离体无性繁殖可以具 有较高的遗传稳定性（有较高的遗传稳定性（Phillip等，等，1994）。正是基于）。正是基于 这一理论，利用离体培养技术建立了多种植物的无性这一理论，利用离体培养技术建立了多种植物的无性 繁殖体系。繁殖体系。 离体培养下的遗传与变异 l 离体培养的遗传稳定性表现的另一个方面是即使发生某离体培养的遗传稳定性表现的另一个方面是即使发生某 些变异，只需根据需要选择适当的培养方式进行离体繁些变异，只需根据需要选择适当的培养方式进行离体繁 殖，即可以淘汰或选择变异、或分离纯合体。殖，即可以淘汰或选择变异、或分离纯合体。 l离体培养下的变异均属于无性变异，即使变异

6、发生，从个体离体培养下的变异均属于无性变异，即使变异发生，从个体 的角度讲只会发生在少数性状上，因此，很容易从群体中剔的角度讲只会发生在少数性状上，因此，很容易从群体中剔 除变异个体，从而可以维持离体培养群体的遗传稳定性。快除变异个体，从而可以维持离体培养群体的遗传稳定性。快 速繁殖即是采用这一技术途径来保持所繁殖对象的品种典型速繁殖即是采用这一技术途径来保持所繁殖对象的品种典型 性。性。 l变异也可以通过离体培养选择保留并快速纯化，这亦是离体变异也可以通过离体培养选择保留并快速纯化，这亦是离体 培养遗传稳定性利用的途径之一。培养遗传稳定性利用的途径之一。 离体培养下的遗传与变异 二. 离体培

7、养下变异特点 变异的普遍性变异的普遍性 变异的局限性变异的局限性 （特点）（特点） 嵌合性嵌合性 离体培养下的遗传与变异 部分植物离体培养再生植株的表型变异频率部分植物离体培养再生植株的表型变异频率 植 物 种 类再生植株来源变异频率(%) 烟 草体细胞愈伤组织10 水 稻胚愈伤组织71.9 甘 蔗幼叶愈伤组织18 玉 米体细胞愈伤组织14 大 麦花粉植株10-15 马铃薯叶肉原生质体100 菠 萝冠芽愈伤组织7 腋芽愈伤组织34 幼果愈伤组织100 离体培养下的遗传与变异 l就单个变异体来讲，离体培养中变异性状往就单个变异体来讲，离体培养中变异性状往 往是单一的，或少数几个性状的变异。往是单

8、一的，或少数几个性状的变异。 l分析水稻种子愈伤组织起源的植株变异显示，在分析水稻种子愈伤组织起源的植株变异显示，在 来自来自7575个愈伤组织的个愈伤组织的11211121个再生植株中，发生变个再生植株中，发生变 异的植株，与供体品种比较只有异的植株，与供体品种比较只有1 1个性状表现差异个性状表现差异 的占的占7272，2 2个以上性状表现差异的只占个以上性状表现差异的只占2828。 离体培养下的遗传与变异 l 然而就同一培养体系的再生群体而言，变异又具有多样然而就同一培养体系的再生群体而言，变异又具有多样 性性 。 l黑云杉黑云杉(shan)（P. mariana）65个系的个系的704

9、7个体细胞胚植株和个体细胞胚植株和 白云杉（白云杉（P. glauca）22个系的个系的3995个体细胞植株的表型变异分个体细胞植株的表型变异分 析显示，尽管两个种的体细胞胚植株变异频率分别只有析显示，尽管两个种的体细胞胚植株变异频率分别只有1.0% 和和1.6%，但分析发生变异的植株变异范围确较大，按形态变，但分析发生变异的植株变异范围确较大，按形态变 异即可分为异即可分为9类，仅在矮化型变异一个性状上也表现出一系列类，仅在矮化型变异一个性状上也表现出一系列 程度上的显著不同，生长程度上的显著不同，生长45年后其植株高度呈现一系列变年后其植株高度呈现一系列变 异类型，一些极度生长限制型矮化的

10、株高只有几厘米，最矮异类型，一些极度生长限制型矮化的株高只有几厘米，最矮 类型的株高只有类型的株高只有23cm， 离体培养下的遗传与变异 离体培养下的遗传与变异 l 与有性重组相比，体细胞突变性状具有一定局限性与有性重组相比，体细胞突变性状具有一定局限性 l从表型上看，在不同植物类型中经常发生的变异主要是从表型上看，在不同植物类型中经常发生的变异主要是 植株形态（株高、叶形、叶色等）、生长势、育性、某植株形态（株高、叶形、叶色等）、生长势、育性、某 些抗性等性状的变异。些抗性等性状的变异。 l从生理生化特性上看容易出现同功酶谱、次生代谢的消从生理生化特性上看容易出现同功酶谱、次生代谢的消 长等

11、变异。长等变异。 l一些单基因控制的性状不仅发生隐形突变，也发生显性一些单基因控制的性状不仅发生隐形突变，也发生显性 突变。突变。 离体培养下的遗传与变异 l 嵌合性是指同一有机体中同时存在有遗传组成不同嵌合性是指同一有机体中同时存在有遗传组成不同 的细胞，它是组织培养中常见的现象。的细胞，它是组织培养中常见的现象。 l 实际上，愈伤组织在大多数情况下是一种具有不同实际上，愈伤组织在大多数情况下是一种具有不同 染色体数和遗传变异程度不同的细胞组成的嵌合体，染色体数和遗传变异程度不同的细胞组成的嵌合体， 这些细胞各自进行不同步的分裂。这些细胞各自进行不同步的分裂。 离体培养下的遗传与变异 硬粒小

12、麦硬粒小麦(Triticum durum )6个无性系植株体细胞染色体数个无性系植株体细胞染色体数 (括号外为个体数，括号内为染色体数括号外为个体数，括号内为染色体数) 序号2n58 11(7)737(1624, 26)768(29, 39, 40)42 2 35(17, 20, 23)111(33) 1 35(9, 11, 12)621(15,18,2127)333 43(7)14(16, 21, 22, 27)223 51(11)65(15, 22, 26)141(32) 62(12)118(18, 2026)211(40) 2 离体培养下的遗传与变异 影响体细胞遗传与变异的因素 供供 体

13、体 植植 物物 离体培养下的遗传与变异 l 供体植物的遗传背景对体细胞变异具有直接影响。供体植物的遗传背景对体细胞变异具有直接影响。 供体植株原有的倍性水平在培养细胞多倍化过程中供体植株原有的倍性水平在培养细胞多倍化过程中 起着重要作用，处于二倍体水平上的细胞比处于单起着重要作用，处于二倍体水平上的细胞比处于单 倍体水平上的细胞较为稳定。倍体水平上的细胞较为稳定。 l 植物种内基因型间变异频率差异较大。植物种内基因型间变异频率差异较大。 lTremblay等（等（1999）比较研究黑云杉和白云杉体细胞变异）比较研究黑云杉和白云杉体细胞变异 时也显示，黑云杉中体细胞变异频率最大的基因型可达，时也

14、显示，黑云杉中体细胞变异频率最大的基因型可达， 而有些基因型变异率则为而有些基因型变异率则为0。白云杉种内不同基因型的体。白云杉种内不同基因型的体 细胞变异，变异率最高的基因型可达，而有些基因型则细胞变异，变异率最高的基因型可达，而有些基因型则 根本不发生变异。根本不发生变异。 离体培养下的遗传与变异 谷子体细胞无性系R2的变异频率 基因型 R2 株系 数 未变异株系变 异 株 系总 变 异 株 系 数 稳定变 异 分 离 变 异 豫谷1号 豫谷5号 高39 郑407 冀谷14号 C445 矮宁黄 210 120 170 121 55 70 100 201 104 152 110 39 47

15、83 95.7 86.7 89.4 90.9 70.9 67.1 83.0 0 5 3 3 4 0 6 0 4.2 8 2.5 7.3 0 6.0 9 11 15 8 12 23 11 4.3 9.1 8.8 6.6 21.8 32.9 11.0 4.3 13.3 10.6 9.1 29.1 32.9 17.0 离体培养下的遗传与变异 l 以分生组织为外植体的再生植株通常可以维持供体以分生组织为外植体的再生植株通常可以维持供体 植物的典型性，体细胞变异频率很低。植物的典型性，体细胞变异频率很低。 l 在分化组织中，由于细胞分化过程中的核内有丝分在分化组织中，由于细胞分化过程中的核内有丝分 裂或

16、核内复制，其结果是在活体内组织分化期间就裂或核内复制，其结果是在活体内组织分化期间就 会出现体细胞多倍性。在植物体内，这些多倍性细会出现体细胞多倍性。在植物体内，这些多倍性细 胞在正常情况下不再发生分裂以维持正常分化细胞胞在正常情况下不再发生分裂以维持正常分化细胞 的功能，然而在离体培养条件下，培养基中的激素的功能，然而在离体培养条件下，培养基中的激素 以及培养环境，就有可能刺激这些多倍性细胞分裂，以及培养环境，就有可能刺激这些多倍性细胞分裂， 进而分化形成多倍体植株。进而分化形成多倍体植株。 离体培养下的遗传与变异 l 普遍认为，培养方式、激素以及其它附加成分均会诱导体细胞变普遍认为，培养方

17、式、激素以及其它附加成分均会诱导体细胞变 异的发生，因为离体培养本身可能即是一种变异诱导的过程。异的发生，因为离体培养本身可能即是一种变异诱导的过程。 l 培养基激素浓度和不同激素配比对再生植株的染色体倍性有一定培养基激素浓度和不同激素配比对再生植株的染色体倍性有一定 影响。影响。 l 在豌豆根段培养物和细胞培养中发现，在豌豆根段培养物和细胞培养中发现， 2 2，4 4D 0.25 mgLD 0.25 mgL-1 -1能增加多倍体 能增加多倍体 细胞的有丝分裂，减少二倍体细胞的有丝分裂，而高浓度（细胞的有丝分裂，减少二倍体细胞的有丝分裂，而高浓度（20 mgL20 mgL-1 -1）则 ）则

18、能促进二倍体细胞的分裂。能促进二倍体细胞的分裂。 l 在在0.02 mgL0.02 mgL-1 -1激动素和 激动素和1 mgL1 mgL-1 -1NAA NAA的培养基上建立起来的纤细单冠菊幼苗的培养基上建立起来的纤细单冠菊幼苗 愈伤组织，保存愈伤组织，保存8080天以后，其中多数细胞为二倍体，少数为四倍体。将这天以后，其中多数细胞为二倍体，少数为四倍体。将这 些愈伤组织转移到含不同激素水平的培养基上，发现其多倍体细胞的分裂些愈伤组织转移到含不同激素水平的培养基上，发现其多倍体细胞的分裂 频率不同。频率不同。0.02 mgL0.02 mgL-1 -1激动素和 激动素和4 mgL4 mgL-1

19、 -1 NAA NAA的多倍体分裂频率为的多倍体分裂频率为2020，而，而 0.02 mgL0.02 mgL-1 -1激动素和 激动素和1 mgL1 mgL-1 -1 NAA NAA时的多倍体分裂频率为时的多倍体分裂频率为100100。出现这一。出现这一 现象的原因可能是因为多倍体细胞通常具有较强的环境忍耐能力，能够通现象的原因可能是因为多倍体细胞通常具有较强的环境忍耐能力，能够通 过一些自体调节使细胞分裂。过一些自体调节使细胞分裂。 离体培养下的遗传与变异 l 激素除了引起染色体倍性的增加外，在一些培养中还发现激素除了引起染色体倍性的增加外，在一些培养中还发现 染色体倍性减少的现象。首次报道

20、培养过程中的染色体减染色体倍性减少的现象。首次报道培养过程中的染色体减 数是在数是在1948年（年（Huskins，1948），以后一些研究者在他们），以后一些研究者在他们 的工作中也相继发现这一现象，但有关体细胞倍性减数的的工作中也相继发现这一现象，但有关体细胞倍性减数的 资料还十分有限。顾蔚（资料还十分有限。顾蔚（1999）在蚕豆组织培养中发现，）在蚕豆组织培养中发现， 体细胞染色体减数与使用极端的激素浓度有关，在他的试体细胞染色体减数与使用极端的激素浓度有关，在他的试 验中不含激素的培养基其多倍体发生频率为，在验中不含激素的培养基其多倍体发生频率为，在10 mgL- 1NNA和 和2.5

21、 mgL-1KT的培养基中，单倍体发生频率可达。的培养基中，单倍体发生频率可达。 离体培养下的遗传与变异 l 除了培养基的外源激素可以引起变异外，除了培养基的外源激素可以引起变异外， 培养基的物理状态以及培养类型也会引起细培养基的物理状态以及培养类型也会引起细 胞的变异。一般来讲，悬浮培养的细胞较半胞的变异。一般来讲，悬浮培养的细胞较半 固体培养的细胞易产生变异。固体培养的细胞易产生变异。 离体培养下的遗传与变异 l 原生质体培养的体细胞变异大于细胞培养的变异，原生质体培养的体细胞变异大于细胞培养的变异， 而细胞培养的变异又大于组织器官培养的变异。而细胞培养的变异又大于组织器官培养的变异。 在

22、细胞培养中，性细胞培养再生植株的变异要大在细胞培养中，性细胞培养再生植株的变异要大 于体细胞培养的植株。马铃薯原生质体培养再生于体细胞培养的植株。马铃薯原生质体培养再生 植株的变异达到植株的变异达到100100，而茎尖培养再生植株基本，而茎尖培养再生植株基本 没有变异。没有变异。 l 在因培养类型引起的变异中，不仅有染色体倍性在因培养类型引起的变异中，不仅有染色体倍性 的异常变异，同时基因突变、染色体结构变异、的异常变异，同时基因突变、染色体结构变异、 以及非以及非DNADNA水平引起的变异亦相继增加。水平引起的变异亦相继增加。 离体培养下的遗传与变异 l 由继代次数引起的体细胞变异几乎在各种

23、类型的植由继代次数引起的体细胞变异几乎在各种类型的植 物中均有报道。一般来讲，继代时间越长，继代次物中均有报道。一般来讲，继代时间越长，继代次 数越多，细胞变异的机率就越高。数越多，细胞变异的机率就越高。 l烟草继代培养烟草继代培养5 5年的愈伤组织，其再生植株与供体基因型年的愈伤组织，其再生植株与供体基因型 相比，几乎没有形态正常的植株。染色体分析显示，这相比，几乎没有形态正常的植株。染色体分析显示，这 些植株大多为非整倍体和多倍体。些植株大多为非整倍体和多倍体。 l玉米从刚诱导的愈伤组织中分化的植株，在形态上与供玉米从刚诱导的愈伤组织中分化的植株，在形态上与供 体基因型基本一致，但培养体基

24、因型基本一致，但培养3 3年后愈伤组织的再生能力显年后愈伤组织的再生能力显 著下降，再生植株生长异常，细胞学分析显示出染色体著下降，再生植株生长异常，细胞学分析显示出染色体 断裂和带型变异。断裂和带型变异。 离体培养下的遗传与变异 培养时间对掌叶半夏愈伤组织染色体变异的影响 培养时 间 （月） 观察细胞数 亚二倍体二倍体多倍体和非整倍体 细胞 数 细胞 数 细胞 数 1 3 12 18 92 51 50 83 14 6 15 29 15.2 11.8 30.0 34.9 65 39 27 33 70.7 76.5 54.0 39.8 9 6 7 19 9.8 11.8 14.0 22.9 离体

25、培养下的遗传与变异 第二节 体细胞变异的细胞遗传学基础 离体培养的体细胞变异，从本质上来说是细胞离体培养的体细胞变异，从本质上来说是细胞 对环境压力的应答机制的调整。有学者认为，实现对环境压力的应答机制的调整。有学者认为，实现 这一机制调整的始发点是放弃自然条件下的细胞学这一机制调整的始发点是放弃自然条件下的细胞学 控制程序，重建新的细胞学控制程序，这种程序重控制程序，重建新的细胞学控制程序，这种程序重 建的结果导致了染色体数量和结构的改变（建的结果导致了染色体数量和结构的改变（Phillips 等，等，1994）。）。 离体培养下的遗传与变异 DNA 重复复制重复复制 染色体断裂与重组染色体

26、断裂与重组 非正常有丝分裂非正常有丝分裂 离体培养下的遗传与变异 一.DNA核内重复复制(endoreduplication） l DNADNA重复复制但不发生细胞分裂，其结果是染色体组数增加，形重复复制但不发生细胞分裂，其结果是染色体组数增加，形 成同源多倍体。如果这种成同源多倍体。如果这种DNADNA重复复制多次发生，细胞内重复复制多次发生，细胞内DNADNA含量含量 就会不断上升。就会不断上升。 l SalonSalon和和EarleEarle（19981998）在硬粒小麦）在硬粒小麦( (Tripsacum dactyloides)Tripsacum dactyloides)的非成熟胚

27、的非成熟胚 培养中观察到，存活的再生植株均为二倍体和四倍体，加倍后的植株在形培养中观察到，存活的再生植株均为二倍体和四倍体，加倍后的植株在形 态和发育方面均很正常。态和发育方面均很正常。 l DNADNA的核内再复制在有些情况下可以反复进行。的核内再复制在有些情况下可以反复进行。 l DAmatoDAmato等（等（19801980）报道，红花菜豆（）报道，红花菜豆（Phaseolus coecineuPhaseolus coecineu，2n2n2222）幼）幼 胚离体培养形成的愈伤组织，正常二倍体细胞只占二分之一，由于胚离体培养形成的愈伤组织，正常二倍体细胞只占二分之一，由于DNADNA核

28、核 内多次复制，有的细胞核内内多次复制，有的细胞核内DNADNA值达到值达到128c128c。 l 一些中间类型的倍数性的形成，有研究认为可能是由于一些中间类型的倍数性的形成，有研究认为可能是由于DNADNA经过经过 重复复制后，在以后的复制中出现非同步复制或核融合所致。如重复复制后，在以后的复制中出现非同步复制或核融合所致。如 第一次第一次DNADNA复制没有发生分裂的复制没有发生分裂的4n4n核，在此后的分裂进程中，与核，在此后的分裂进程中，与 正常分裂的正常分裂的2n2n核发生融合，从而形成六倍体（张冬生，核发生融合，从而形成六倍体（张冬生，19891989）。）。 离体培养下的遗传与变

29、异 硬粒小麦中胚轴培养中硬粒小麦中胚轴培养中DNA值的变化值的变化 培养天数培养天数 不同不同DNA值细胞比例（）值细胞比例（） 2c2c4c8c 0 88.311.7 5 80.716.82.5 134.879.56.69.1 179.781.57.90.9 离体培养下的遗传与变异 l 近年研究显示，近年研究显示，DNADNA核内重复复制的发生与细胞分裂周期的核内重复复制的发生与细胞分裂周期的 调控有关。在离体条件下，一些进入调控有关。在离体条件下，一些进入S S期的细胞，在完成期的细胞，在完成DNADNA 复制后不进入下一阶段完成分裂，从而使细胞内复制后不进入下一阶段完成分裂，从而使细胞内

30、DNADNA值和染值和染 色体倍性增加一倍。这种细胞进入间期后又开始色体倍性增加一倍。这种细胞进入间期后又开始DNADNA合成，合成， 如果分裂能正常进行，则由此而产生的细胞即为四倍体。如如果分裂能正常进行，则由此而产生的细胞即为四倍体。如 果分裂仍然不能进行，则果分裂仍然不能进行，则DNADNA值和染色体倍性就会再增加一值和染色体倍性就会再增加一 倍，从而使细胞内倍，从而使细胞内DNADNA值和染色体倍性成值和染色体倍性成2 2n n形式增加。形式增加。 l 玉米胚乳和子叶发育研究显示，玉米胚乳和子叶发育研究显示，DNADNA重复复制可能与重复复制可能与M M期的不期的不 同同CDKCDK活

31、性有关，而此时的活性有关，而此时的CDKCDK活性又受到磷酸化和去磷酸化活性又受到磷酸化和去磷酸化 的影响。同时，在玉米中还发现了的影响。同时，在玉米中还发现了CDKCDK的抑制子的抑制子CKICKI，DNADNA核核 内复制通过内复制通过CDKCDK的调控在动物发育和病理细胞中已被证实。的调控在动物发育和病理细胞中已被证实。 因此，因此，LarkinsLarkins等认为，这一机制可能是等认为，这一机制可能是DNADNA核内重复复制的核内重复复制的 重要调控途径。重要调控途径。 离体培养下的遗传与变异 l 拟南芥髓组织、成熟叶片以及托叶细胞多倍体发生过程拟南芥髓组织、成熟叶片以及托叶细胞多倍

32、体发生过程 的研究显示，一个在的研究显示，一个在G2期表达的期表达的CDK基因基因CKS1At参与参与 调节了调节了DNA重复复制过程（重复复制过程（Jacqmard等，等，1999）。此）。此 外，外，Cebolla等（等（1999）在他们的研究中发现，一个与）在他们的研究中发现，一个与 Cyclins降解有关的基因降解有关的基因ccs52也与也与DNA重复复制和多倍重复复制和多倍 体细胞产生有关。现有资料显示，体细胞产生有关。现有资料显示，DNA的核内重复复的核内重复复 制可能涉及到一些与细胞周期调控基因的开启与关闭。制可能涉及到一些与细胞周期调控基因的开启与关闭。 离体培养下的遗传与变异

33、 二二. . 染色体断裂与重组染色体断裂与重组 染色体结构变异是体细胞变异的另一重要类型。染色体断染色体结构变异是体细胞变异的另一重要类型。染色体断 裂与重组是离体培养中染色体结构变异的主要原因之一，裂与重组是离体培养中染色体结构变异的主要原因之一， 也是体细胞变异中经常发生的现象，其细胞学特征是分也是体细胞变异中经常发生的现象，其细胞学特征是分 裂中期出现断裂的染色体片段、落后染色体以及染色体裂中期出现断裂的染色体片段、落后染色体以及染色体 桥，其结果是在体细胞中出现染色体易位、缺失、倒位桥，其结果是在体细胞中出现染色体易位、缺失、倒位 等多种类型的结构变异。等多种类型的结构变异。 离体培养

34、下的遗传与变异 染色体桥落后染色体 离体培养下的遗传与变异 l 近年的研究认为，染色体断裂与近年的研究认为，染色体断裂与DNADNA甲基化程度有关。增加甲基化程度有关。增加 DNADNA甲基化，亦会引起染色体断裂。分析认为，甲基化程度甲基化，亦会引起染色体断裂。分析认为，甲基化程度 的增加可能抑制的增加可能抑制DNADNA的复制效率，使得的复制效率，使得DNADNA复制不能同步，从复制不能同步，从 而造成后期桥的产生和染色体的断裂。而造成后期桥的产生和染色体的断裂。 l 染色体结构变异既可发生在愈伤组织细胞中，也可发生在再染色体结构变异既可发生在愈伤组织细胞中，也可发生在再 生植株中，有时在一

35、些再生植株的有性后代中也能观察到。生植株中，有时在一些再生植株的有性后代中也能观察到。 l 产生染色体结构变异的再生植株一般生长不正常，生活力低产生染色体结构变异的再生植株一般生长不正常，生活力低 下，很难长期生存，因此以保存种质资源为目的的离体培养下，很难长期生存，因此以保存种质资源为目的的离体培养 应尽可能避免这种变异发生，以免造成基因资源流失。应尽可能避免这种变异发生，以免造成基因资源流失。 离体培养下的遗传与变异 三. 非正常有丝分裂 l离体培养中，染色体除了整倍性变异外，还离体培养中，染色体除了整倍性变异外，还 可观察到大量的非整倍性变异，这种愈伤组可观察到大量的非整倍性变异，这种愈

36、伤组 织往往分化能力低下，再生植株大多生长不织往往分化能力低下，再生植株大多生长不 正常，有性繁殖遗传稳定差。正常，有性繁殖遗传稳定差。 离体培养下的遗传与变异 l 纺锤体形纺锤体形 成异常使成异常使 得有丝分得有丝分 裂不正常裂不正常 是其原因是其原因 之一。之一。 离体培养下的遗传与变异 l 核裂经常导致双核与多核细胞的出现。在红花菜豆核裂经常导致双核与多核细胞的出现。在红花菜豆 的胚培养愈伤组织中，双核细胞有的胚培养愈伤组织中，双核细胞有7070有核裂现象，有核裂现象， 蚕豆子叶诱导的愈伤组织细胞的双核和多核细胞出蚕豆子叶诱导的愈伤组织细胞的双核和多核细胞出 现的频率也相当高。在核裂出现

37、频率高的材料中，现的频率也相当高。在核裂出现频率高的材料中， 多倍体、亚多倍体和非整倍体细胞的出现频率亦相多倍体、亚多倍体和非整倍体细胞的出现频率亦相 应提高。应提高。 离体培养下的遗传与变异 第三节 体细胞变异的分子遗传学基础 l 体细胞变异除了发生在染色体水平上，更多的是在基体细胞变异除了发生在染色体水平上，更多的是在基 因水平上的变异。因水平上的变异。 l 从利用体细胞变异的角度看，染色体变异大多是一些从利用体细胞变异的角度看，染色体变异大多是一些 畸形变异，真正可利用的染色体变异是十分有限的。畸形变异，真正可利用的染色体变异是十分有限的。 l 基因水平上的变异在表型上大多只是个别性状的

38、改变，基因水平上的变异在表型上大多只是个别性状的改变， 不会影响再生植株的正常生长发育，因此，从再生植不会影响再生植株的正常生长发育，因此，从再生植 株的这些变异中就有可能筛选出有益的变异。株的这些变异中就有可能筛选出有益的变异。 l 基因水平上的变异从根本上讲就是基因水平上的变异从根本上讲就是DNADNA水平上的碱基突水平上的碱基突 变或修饰状态的改变。变或修饰状态的改变。 离体培养下的遗传与变异 碱基突变碱基突变 DNA序列的选择性序列的选择性 扩增与丢失扩增与丢失 转座子活化转座子活化 DNA甲基化甲基化 离体培养下的遗传与变异 l 碱基突变是指碱基突变是指DNADNA序列中碱基的改变。

39、序列中碱基的改变。 l 突变碱基的突变碱基的DNADNA序列处于结构基因的位置或调控序列的序列处于结构基因的位置或调控序列的 位置时，即可导致遗传状态的改变。位置时，即可导致遗传状态的改变。 l 碱基突变是产生体细胞变异的重要途径之一。碱基突变是产生体细胞变异的重要途径之一。 一. 碱基突变 离体培养下的遗传与变异 l 对于单基因控制的遗传性状，大多数碱基突变可以稳对于单基因控制的遗传性状，大多数碱基突变可以稳 定遗传而且符合孟德尔遗传分离规律，这一点已在水定遗传而且符合孟德尔遗传分离规律，这一点已在水 稻、烟草和玉米的体细胞变异中得以证实。稻、烟草和玉米的体细胞变异中得以证实。 lBrett

40、ell等从等从645株玉米杂种胚培养再生植株中，发现了一个株玉米杂种胚培养再生植株中，发现了一个 稳定突变体稳定突变体Adh1（乙醇脱氢酶突变体），克隆基因序列分（乙醇脱氢酶突变体），克隆基因序列分 析发现，该基因第七外显子中一个编码谷氨酸的析发现，该基因第七外显子中一个编码谷氨酸的GAG中的中的A 转换成为了转换成为了T，使翻译肽链中的谷氨酸转变为纈氨酸。，使翻译肽链中的谷氨酸转变为纈氨酸。 l 植物的许多性状特别是经济性状均由多基因控制，对植物的许多性状特别是经济性状均由多基因控制，对 于多基因控制性状的碱基突变可能由于技术上的复杂于多基因控制性状的碱基突变可能由于技术上的复杂 性，目前还

41、没有关于多基因控制性状的碱基突变报道。性，目前还没有关于多基因控制性状的碱基突变报道。 离体培养下的遗传与变异 l 早在上世纪早在上世纪8080年代年代LarkinLarkin和和ScoworoftScoworoft即提出，即提出，DNADNA序列的扩增与序列的扩增与 丢失也是体细胞无性系变异的原因之一。丢失也是体细胞无性系变异的原因之一。 l 早期的研究认为，早期的研究认为，DNADNA值的改变与倍性变异是一致的。值的改变与倍性变异是一致的。 l 但近年来的研究显示，但近年来的研究显示，DNADNA值的变化是一个比较复杂的分子生物学值的变化是一个比较复杂的分子生物学 现象。当现象。当DNAD

42、NA的的c c值以整倍性形式增加或减少时，其变化与染色体倍值以整倍性形式增加或减少时，其变化与染色体倍 性的变异是一致的。然而，有些性的变异是一致的。然而，有些DNADNA值的变化却与倍性没有直接联值的变化却与倍性没有直接联 系，这种变化大多是系，这种变化大多是DNADNA序列的选择性扩增或部分序列丢失造成序列的选择性扩增或部分序列丢失造成 l 在原核染色体中，在原核染色体中，DNADNA的量或真核细胞中单倍体的量或真核细胞中单倍体DNADNA的量，称为的量，称为C C值；值； C C值与生物结构与组成的复杂性不一致的现象，称为值与生物结构与组成的复杂性不一致的现象，称为C C值矛盾。值矛盾。

43、 l 离体培养下离体培养下DNADNA序列的选择性扩增包括两种情况，一是重复序列的序列的选择性扩增包括两种情况，一是重复序列的 扩增，二是基因的选择性扩增。扩增，二是基因的选择性扩增。 二. DNA序列的选择性扩增与丢失 离体培养下的遗传与变异 l Lapitan等（等（1988）以生物素标记的）以生物素标记的480 bp重复序列重复序列 DNA片段为探针，发现小黑麦杂种再生植株当代片段为探针，发现小黑麦杂种再生植株当代7R染染 色体短臂端粒位置上的这种重复序列发生了选择性扩增，色体短臂端粒位置上的这种重复序列发生了选择性扩增， 而且这种扩增可以遗传至少三代。而且这种扩增可以遗传至少三代。 l

44、 在水稻、小麦等作物中也发现一些微卫星在水稻、小麦等作物中也发现一些微卫星DNA的扩增。的扩增。 水稻悬浮培养细胞的水稻悬浮培养细胞的DNA分析发现，未分化的培养细分析发现，未分化的培养细 胞中一些高度重复序列的扩增比供体材料高胞中一些高度重复序列的扩增比供体材料高75倍，而不倍，而不 同品种的叶片这种扩增差异只有同品种的叶片这种扩增差异只有23倍。倍。 l 亚麻卫星亚麻卫星DNA和小麦和小麦rDNA研究中也有类似现象。研究中也有类似现象。 离体培养下的遗传与变异 l 基因的选择性扩增在植物个体发育中经常看到。离体培基因的选择性扩增在植物个体发育中经常看到。离体培 养下的基因选择性扩增被认为是

45、细胞在短期内为满足某养下的基因选择性扩增被认为是细胞在短期内为满足某 种需要而产生足够的基因产物的一种调控手段。种需要而产生足够的基因产物的一种调控手段。 抗除草剂草甘磷的突变系就是一个典型的例子。草甘磷能抑抗除草剂草甘磷的突变系就是一个典型的例子。草甘磷能抑 制制3-烯醇丙酮酸莽草酸盐烯醇丙酮酸莽草酸盐-5-磷酸合成酶（磷酸合成酶（EPSPs）活性，抗草）活性，抗草 甘磷突变体则具有较高甘磷突变体则具有较高EPSPs活性。活性。DNA分析显示，这种突分析显示，这种突 变体的变体的EPSPs活性提高是因为参与编码该酶的基因选择性扩增，活性提高是因为参与编码该酶的基因选择性扩增， 增加了增加了m

46、RNA水平，从而增加了酶的含量。水平，从而增加了酶的含量。 Peter等的研究显示，在烟草抗草甘磷的突变体中，至少有等的研究显示，在烟草抗草甘磷的突变体中，至少有2个个 与与EPSPs合成相关的基因发生了选择性扩增，而且这些突变体合成相关的基因发生了选择性扩增，而且这些突变体 在没有草甘磷选择压力存在的情况下仍富含在没有草甘磷选择压力存在的情况下仍富含EPSPs mRNA。 离体培养下的遗传与变异 l 在离体培养中，有时也会发生在离体培养中，有时也会发生DNA序列丢失的现象。序列丢失的现象。 现有资料显示，现有资料显示，DNA序列丢失多发生在序列丢失多发生在rDNA及其它们的间隔及其它们的间隔

47、 序列，某些重复序列序列，某些重复序列DNA区域也易发生丢失。区域也易发生丢失。 Landsmann利用利用DNA随机克隆首先在马铃薯中发现了再生植随机克隆首先在马铃薯中发现了再生植 株有株有DNA片段的丢失，随后片段的丢失，随后Cullis和和Clary采用类似的方法在采用类似的方法在 亚麻再生植株中观察到亚麻再生植株中观察到rDNA的减少。以后在大麦、小麦以及的减少。以后在大麦、小麦以及 水稻的培养再生植株中均检测到水稻的培养再生植株中均检测到rDNA的减少。的减少。 DNA的减少不仅发生在核的减少不仅发生在核DNA中，也有发生在叶绿体基因组中，也有发生在叶绿体基因组 中。中。 一些一些D

48、NA序列的减少只发生在愈伤组织形成阶段，再生植株序列的减少只发生在愈伤组织形成阶段，再生植株 过程中又恢复到正常状态，目前还不清楚这种变化的生物学过程中又恢复到正常状态，目前还不清楚这种变化的生物学 意义。意义。 离体培养下的遗传与变异 l 上个世纪上个世纪8080年代，年代，LarkinLarkin和和ScowcroftScowcroft首先提出，转座首先提出，转座 因子的活化可能是体细胞无性系变异的原因之一。因子的活化可能是体细胞无性系变异的原因之一。 因为培养中细胞快速分裂，异染色质复制滞后，引起细胞分因为培养中细胞快速分裂，异染色质复制滞后，引起细胞分 裂后期形成染色体桥和染色体断裂。

49、在断裂部位的裂后期形成染色体桥和染色体断裂。在断裂部位的DNADNA修复过修复过 程中，位于异染色质区的转座子被活化继而转座，引起一系程中，位于异染色质区的转座子被活化继而转座，引起一系 列的结构基因活化、沉默以及位置变化，造成无性系变异。列的结构基因活化、沉默以及位置变化，造成无性系变异。 我国学者朱至清认为，也可能是转座子在培养环境中首先被我国学者朱至清认为，也可能是转座子在培养环境中首先被 激活而转座，从而造成染色体的结构变异。激活而转座，从而造成染色体的结构变异。 三. 转座子活化 离体培养下的遗传与变异 l Peschke等以玉米等以玉米Ac转座子测验系为母本，与转座子测验系为母本，

50、与1200 个由未成熟胚再生的植株进行测交，根据种子糊粉个由未成熟胚再生的植株进行测交，根据种子糊粉 层颜色色素的变化来确定再生植株中是否携带有活层颜色色素的变化来确定再生植株中是否携带有活 化的化的Ac转座子，结果在转座子，结果在56株中检测出株中检测出Ac活化。活化。 l 苜宿组织培养再生植株中也观察到因转座子活化所苜宿组织培养再生植株中也观察到因转座子活化所 引起的花色变异。引起的花色变异。 离体培养下的遗传与变异 l 利用利用Ds转座子系统进行异源转化，在一些作物中成功观转座子系统进行异源转化，在一些作物中成功观 察到转座子插入的体细胞突变，从而证明转座因子确实察到转座子插入的体细胞突

51、变，从而证明转座因子确实 诱导了体细胞变异。诱导了体细胞变异。 Mckenzie等为了建立一个稳定的转座子标签体系，将等为了建立一个稳定的转座子标签体系，将Ds/Ac转转 座系统导入球茎甘蓝中，获得的携带有转座系统的转化植株，座系统导入球茎甘蓝中，获得的携带有转座系统的转化植株， 在离体培养下增加选择压力，筛选稳定的转座子插入突变，在离体培养下增加选择压力，筛选稳定的转座子插入突变， 结果观察到在获得到结果观察到在获得到42个个Ac切除的稳定切除的稳定Ds插入再生植株中，插入再生植株中， 有有29个植株发生了个植株发生了Ds再转座。足迹分析显示，在再转座。足迹分析显示，在Ds Donor- s

52、ite序列附近发生了大量的缺失和重组。序列附近发生了大量的缺失和重组。 离体培养下的遗传与变异 l DNADNA甲基化在基因表达调控中具有重要作用。甲基化在基因表达调控中具有重要作用。DNADNA甲基化甲基化 和去甲基化，不仅能通过调控基因的表达与关闭来控制和去甲基化，不仅能通过调控基因的表达与关闭来控制 生物的发育，同时也可以通过生物的发育，同时也可以通过DNADNA甲基化途径来适应环甲基化途径来适应环 境对生物体的压力。境对生物体的压力。 l 目前甲基化研究主要利用目前甲基化研究主要利用HpaIIHpaII和和MspI MspI 两种甲基化敏感两种甲基化敏感 的限制性核酸内切酶进行比较分析

53、。的限制性核酸内切酶进行比较分析。 HpaIIHpaII和和MspIMspI的酶切位点均为的酶切位点均为CCGGCCGG，当靠外的，当靠外的C C被甲基化时，被甲基化时， 只能被只能被HpaIIHpaII酶切，当靠内的酶切，当靠内的C C被甲基化时，只能被被甲基化时，只能被MspIMspI酶切，酶切， 在一般情况下，与在一般情况下，与G G相邻的相邻的C C更容易被甲基化。利用两种酶切更容易被甲基化。利用两种酶切 片段的差异即可分析片段的差异即可分析DNADNA甲基化的变化。甲基化的变化。 四. DNA甲基化 离体培养下的遗传与变异 l 离体培养再生植株的甲基化变化首先在玉米体细胞离体培养再生

54、植株的甲基化变化首先在玉米体细胞 无性系再生植株中发现。来自玉米幼胚再生植株的无性系再生植株中发现。来自玉米幼胚再生植株的 某些无性系与供体相比发生了超甲基化，而另一些某些无性系与供体相比发生了超甲基化，而另一些 再生植株却只在与再生植株却只在与G G相邻的相邻的C C上发生甲基化，而且这上发生甲基化，而且这 种甲基化在基因组中的分布不均匀。种甲基化在基因组中的分布不均匀。 l 胡萝卜、番茄、马铃薯等多种植物的培养细胞或再胡萝卜、番茄、马铃薯等多种植物的培养细胞或再 生植株中，均报道发现了因生植株中，均报道发现了因DNADNA甲基化改变而产生的甲基化改变而产生的 体细胞变异。体细胞变异。 离体

55、培养下的遗传与变异 lKovaik等在烟草细胞悬浮系等在烟草细胞悬浮系“TBY-2”培养培养 中，观察到由于渗透压的改变，细胞中，观察到由于渗透压的改变，细胞DNA出出 现了超甲基化的现象。现了超甲基化的现象。 在培养基中加入在培养基中加入NaCl或者甘露醇提高培养基渗透压，然或者甘露醇提高培养基渗透压，然 后提取细胞后提取细胞DNA检测检测DNA甲基化变化情况。结果发现，甲基化变化情况。结果发现， 在烟草基因组的在烟草基因组的2个异染色质区（个异染色质区（HRS60和和GRS），其），其 CCG三核苷酸重复区和三核苷酸重复区和CCGG四核苷酸重复区的四核苷酸重复区的C几乎几乎 全部被甲基化。

56、当把细胞转移培养到渗透压正常的培养全部被甲基化。当把细胞转移培养到渗透压正常的培养 基中时，基中时，DNA甲基化程度又可恢复正常。甲基化程度又可恢复正常。 离体培养下的遗传与变异 u除了除了DNADNA甲基化程度的增加外，离体培养中的某些变异甲基化程度的增加外，离体培养中的某些变异 也为也为DNADNA甲基化程度的降低所致，最典型的例子是油棕甲基化程度的降低所致，最典型的例子是油棕 体细胞胚植株的雄蕊雌性化变异。体细胞胚植株的雄蕊雌性化变异。 RivalRival等发现油棕体细胞胚植株中，大约有等发现油棕体细胞胚植株中，大约有5 5的植株表现出的植株表现出 雄蕊雌性化和完全不育。进一步研究发现

57、，产生这种变异的雄蕊雌性化和完全不育。进一步研究发现，产生这种变异的 愈伤组织有两种类型，一种是瘤状愈伤组织（愈伤组织有两种类型，一种是瘤状愈伤组织（NCCNCC），另一种），另一种 是快速生长愈伤组织（是快速生长愈伤组织（FGCFGC）。）。 来自来自NCCNCC的变异植株，在种植的变异植株，在种植9 9年后，所有植株均可恢复正常。年后，所有植株均可恢复正常。 而来自而来自FGCFGC的变异植株只有的变异植株只有5050能恢复正常。进一步分析显示，能恢复正常。进一步分析显示， 变异植株变异植株DNADNA甲基化程度分析显示，来自甲基化程度分析显示，来自NCCNCC的变异植株，的变异植株，C

58、C的的 甲基化率比正常植株减少了。而来自甲基化率比正常植株减少了。而来自FGCFGC的变异植株，的变异植株，C C 的甲基化率比正常植株减少了的甲基化率比正常植株减少了 离体培养下的遗传与变异 第四节 体细胞无性系变异的诱导与选择 l 体细胞无性系变异的筛选有以下一些明显的优点：体细胞无性系变异的筛选有以下一些明显的优点： l可以在小空间内对大量个体进行选择。可以在小空间内对大量个体进行选择。 l筛选可以在几个细胞周期内完成，且不受季节限制。筛选可以在几个细胞周期内完成，且不受季节限制。 l因为试验在人工培养条件下进行，因此诱变和筛选条件可以因为试验在人工培养条件下进行，因此诱变和筛选条件可以

59、 根据需要进行调节和控制，从而提高了试验的重复性。根据需要进行调节和控制，从而提高了试验的重复性。 l由于变异是在单细胞水平上进行的，因此，一个突变体就是由于变异是在单细胞水平上进行的，因此，一个突变体就是 来自一个细胞，不会有非突变细胞的干扰，避免了整体植株来自一个细胞，不会有非突变细胞的干扰，避免了整体植株 水平上无性变异常呈现出的嵌合体。水平上无性变异常呈现出的嵌合体。 l在细胞培养系统中，诱变剂可较均匀的接触细胞，因此可以在细胞培养系统中，诱变剂可较均匀的接触细胞，因此可以 引起培养细胞相对较高频率的发生突变，增加了选择机会。引起培养细胞相对较高频率的发生突变，增加了选择机会。 离体培

60、养下的遗传与变异 l体细胞无性系变异的表示方法主要有两种：体细胞无性系变异的表示方法主要有两种： l一种是一种是ChaleffChaleff提出的以提出的以R R0 0、R R1 1、R R2 2、分别代表体分别代表体 细胞无性系变异的当代和自交以后的世代；细胞无性系变异的当代和自交以后的世代； l另一种是由另一种是由LarkinLarkin和和ScowcroftScowcroft提出的以提出的以SCSC1 1、RCRC2 2、 RCRC3 3、来分别代表体细胞无性系变异的当代和自交来分别代表体细胞无性系变异的当代和自交 以后的世代。以后的世代。 离体培养下的遗传与变异 诱变材料的选择诱变材料